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Article de méthode

In Situ Caractérisation des Biofilms MR1 Shewanella oneidensis par SALVI et ToF-SIMS

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DOI :

10.3791/55944

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18 août 2017

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1Earth and Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthode pour cultiver un biofilm pour in situ de microanalyse ions secondaires de temps de vol pour la cartographie chimique à l’état hydraté, activée par un réacteur de la microfluidique, système d’analyse à l’Interface liquide de vide. La MR de Shewanella oneidensis -1 avec la protéine fluorescente verte a été utilisé comme modèle.

Résumé

Biofilms bactériens sont associés à la surface des communautés qui sont largement étudiées pour comprendre leurs auto-produit substances polymériques extracellulaires (EPS) et leurs rôles en microbiologie environnementale. Cette étude décrit une méthode pour cultiver le biofilm attachement au système pour l’analyse à l’Interface liquide de vide (SALVI) et réaliser in situ une cartographie chimique d’un biofilm vivant par spectrométrie de masse à ions secondaires de temps de vol (ToF-SIMS). Ceci est fait par le biais de la mise en culture des bactéries dans le chenal SALVI avec notre configuration spécialisé tant à l’extérieur, ainsi que par le biais de techniques d’imagerie optiques pour détecter la présence de biofilm et l’épaisseur avant l’analyse par ToF-SIMS. Nos résultats montrent les pics caractéristiques du biofilm Shewanella dans son état naturel hydraté, mettant en valeur son environnement de cluster eau localisée, ainsi que les EPS fragments qui sont radicalement différents de même du biofilm déshydraté État. Ces résultats démontrent la capacité de la percée de SALVI qui permet pour l’imagerie de biofilm in situ avec un instrument d’imagerie chimique axée sur le vide.

Introduction

Biofilms bactériens sont associés à la surface des communautés qui ont évolué au fil du temps comme un moyen de défense aux bactéries pour survivre variant des stimuli physiques et mécaniques indésirables, dans lequel les cellules sont capables de fixer et de survivre dans de nombreux environnements possibles. 1 , 2 les Biofilms sont largement étudiées et ont des applications dans de nombreux domaines tels que la biomédecine, de génie biomédical, de l’agriculture et de recherche industrielle et de développement. 1 , 2 comprendre la cartographie chimique de ces communautés microbiennes complexes, y compris leurs auto-produit substances polymériques extracellulaires (EPS) et leur environnement local eau-cluster, est essentiel pour obtenir un précis et détaillé représentation de leurs activités biologiques. 2

Biofilms exister et se développer au sein d’un état fortement hydraté. Cela représente un grand défi en utilisant des techniques d’analyse de surface axée sur le vide comme la spectrométrie de masse à ions secondaires de temps de vol (ToF-SIMS) en raison des difficultés dans l’étude des liquides volatils dans le vide. Ainsi, les techniques d’analyse de surface axée sur le vide sont limitaient presque exclusivement à l’étude des échantillons de biofilm à seulement leur état séché. Toutefois, étudier un biofilm dans son état séché inhibe l’enquête précise de son microenvironnement vrai biologique. Il provoque souvent des changements drastiques à la morphologie de l’intégrité et le biofilm EPS, qui a été démontrée après avoir comparé les résultats spectraux biofilm sec aux études in situ liquide. 3 , 4 cet article présente une solution pour l’étude des biofilms dans leur état naturel hydratée grâce à l’utilisation de notre système d’analyse à l’Interface liquide de vide (SALVI),5,6 un réacteur microfluidique qui contient le liquide sous sa membrane silicium mince de nitrure (NAS) dans un MICROCANAL de polydiméthylsiloxane (PMDS), offrant ainsi un accès direct au faisceau sonde ionique secondaire tout en conservant l’intégrité structurale de la matrice liquide sous vide chambre. 7 , 8

S. oneidensis MR-1 muté pour exprimer la protéine de fluorescence verte (GFP) a été choisie comme organisme modèle dans cet exemple de procédure de biofilm en raison de sa polyvalence métabolique et l’utilisation commune en microbiologie environnementale et appliquée, qui reposait lourdement sur sa capacité unique pour la réduction de métal et de transfert d’électron extracellulaire. 9 , 10 , 11 en outre, la présence de GFP tolérée pour facile biofilm-épaisseur continue par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence, à l’aide d’un filtre de fluorescéine isothiocyanate (FITC). Nos études antérieures ont montré des preuves de cette bactérie favorisant l’attachement à la fenêtre de péché en l’utilisant dans operando imagerie de fluorescence pour la croissance de biofilm d’une épaisseur de jusqu'à une centaine de micromètres. 4 , 12 alors que cet article discutera seulement la confirmation de la présence de biofilm par microscopie à fluorescence, la SALVI est compatible avec d’autres méthodes d’imagerie optiques comme la Super-résolution imagerie de fluorescence (c.-à-d., structurée illumination microscopie (SIM)9) et confocale microscopie à balayage laser (CLSM) imagerie4). Imagerie optique peut servir à mesurer l’épaisseur du biofilm et obtenir une image 3D de la forme du biofilm, tel qu’il apparaît, confirmant son épaisseur et son attachement à la fenêtre de péché. 9 tandis que GFP a été utilisé dans l’analyse de SIMS, s. oneidensis sans GFP a été utilisé pour la courbe de croissance, comme cette seule mesure requise de la densité optique et ne nécessitait pas de toute imagerie de fluorescence. En général, la différence entre la GFP tag et espèces non balisés dans la courbe de croissance sont insignifiante. En outre, alors que ce protocole utilise S. oneidensis MR-1 GFP comme un organisme modèle pour décrire la procédure, cette procédure est conçue pour une souche bactérienne pouvant être requises pour la culture au sein de SALVI. Bien que, compte tenu des connaissances de la souche bactérienne nécessaire, certaines conditions de croissance tels que temps, température et oxygène environnement peuvent doivent être modifiées pour tenir compte de la souche de la bactérie à utiliser. Pour le milieu de croissance, cette procédure utilise « nanofils » bouillon de medium, trypticase soja (TSB) sans dextrose et gélose trypticase soja (TSA) sans dextrose pour la culture. La composition du milieu « nanofils » a été spécialement formulée pour la croissance et pour la surveillance des prolongements de la membrane et le périplasme S. oneidensis qui semblent prendre la forme de petits fils et la composition du milieu a été établi dans des recherches antérieures. 13 , 14

Notre protocole précédent sur in situ liquide ToF-SIMS a illustré l’avantage que SALVI a à offrir pour l’immobilisation de la protéine et l’attachement pour le péché, mais aussi un protocole détaillé sur la réduction des données et analyse ToF-SIMS. 12 plutôt que de répéter les étapes de réduction de données, ce document servira à plutôt se concentrer sur l’approche unique de mise en place et en cultivant des biofilms dans notre microchannel SALVI, ainsi que les mesures d’imagerie pour détecter la présence de biofilm et épaisseur préalable à l’analyse de ToF-SIMS. Alors que les biofilms ont été jusque-là limités aux séchées uniquement des échantillons au sein de la chambre du vide basé sur des techniques d’analyse surfaces, EPS et biofilm cartographie chimique détaillée des biofilms vivants peut maintenant être obtenue in situ en raison de cette nouvelle capacité.

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Protocole

1. préparation des matériaux

  1. Préparation du tube support
    1. flacons de sérum (un par culture de biofilm et trois par la courbe de croissance)
      Remarque : comme indiqué dans l’introduction, toute croissance moyen approprié de fournir les nutriments nécessaires pour la souche de bactéries d’intérêt peut être utilisé pour cette procédure ; dans ce cas, " nanofils " médias et BST sans milieu de dextrose a été utilisé pour la croissance de S. oneidensis MR-1 GFP. 13
      1. dépôt 20 mL de milieu de culture dans une bouteille de sérum de 70 mL, bouchon le bouchon et la bouteille à sertir. Couvrez le dessus avec un morceau de papier d’aluminium propre stérile.
      2. Autoclave la bouteille avec un cycle de liquide pendant 30 minutes à 121 ° C. Afterward, conservez le flacon de sérum stérilisé à température ambiante.
    2. Tubes de Culture anaérobie
      1. déposer 5 mL de milieu de culture dans un tube à culture anaérobie espace aérien, mettre sur le bouchon et la bouteille à sertir. Couvrez le dessus avec une feuille stérile.
  2. Préparation bulle piège tube
    1. à l’aide d’une aiguille de 22 calibre, soigneusement percer un trou à travers un bouchon de bouteille de sérum.
    2. 20 couper en 1/32 " en polytétrafluoroéthylène (PTFE) tube avec un rasoir tel qu’une extrémité du tronçon de tuyau est pointée.
    3. à l’aide de la pointe, enfiler le tube PTFE à travers le trou dans la partie supérieure du bouchon en caoutchouc. Poussez le tube à travers jusqu'à environ 2 cm à travers le bouchon et couper l’extrémité pointue du tube PTFE avec un rasoir pour avoir une plate fin.
    4. Enlever le piston d’une seringue de 5 mL et monter le bouchon en caoutchouc à l’étape 1.2.3 dans l’extrémité ouverte de la seringue. La fin de 2 cm de tuyau de PTFE est dans le canon de la seringue. Il s’agit du barboteur.
    5. Envelopper le barboteur (le PTFE tube, bouchon en caoutchouc et seringue) fait en étape 1.2.4 une feuille d’aluminium et fixez avec du Ruban autoclave. Autoclave, le paquet de feuilles pour stériliser le tube avec une gravité cycle à 121 ° C pendant 30 min. stocker le paquet de feuilles de scellés à température ambiante jusqu’au moment de l’utiliser à l’étape 2.4.
  3. Courbe de croissance bactérienne
    Remarque : ce protocole utilise S. oneidensis MR-1 GFP comme un organisme modèle pour cultiver le biofilm dans SALVI. Toutefois, cette procédure peut être adaptée pour tenir compte des autres bactéries de plus en plus par voie aérobie ou anaérobie. Selon quelle souche est utilisé, temps de croissance et de l’environnement peuvent devoir être ajustée en conséquence.
    NOTE : stocks de bactérienne congélateur-80 ° C se composait d’un mélange de 1:1 du BST sans dextrose et du glycérol. L’exemple de courbe de croissance illustré à la Figure 1 B a été préparé en utilisant une culture starter du BST avec aucun dextrose, transféré en quantités respectives de 0,2 mL trois fois pour flacons de sérum de 70 mL par 20 mL " nanofils " moyen pour éliminer les traces du BST. Toutefois, ce protocole suppose que seul milieu sera utilisée, et que les transferts ultérieurs ne seront pas conduits, comme cela a été fait avec ces solutions moyennes particuliers pour S. oneidensis. Bien que non décrites dans le présent protocole, des transferts supplémentaires comme ça sont recommandées car au départ du dépôt les bactéries au BST riche aide les cellules congelées à récupérer ; et trois transferts ultérieurs à " nanofils " veille à ce que tous les TSB a disparu et que la dynamique de croissance typique se produisent.
    1. Ensemencer la Culture Starter
      1. enlever le stock de glycérol bactérienne du congélateur-80 ° C et réchauffer le stock avec une main gantée pour décongeler plus rapidement possible. Déplacez ce stock de congélateur à l’armoire de sécurité biologique (BSC).
      2. Au sein de la BSC, utiliser une seringue de 1 mL avec une aiguille de 22G attachée pour transférer 0,1 mL de congélateur étalon dans un tube à culture anaérobie plafonnés et sertie contenant 5 mL de milieu de culture avec aucun dextrose, préparé à l’étape 1.1.2. Éliminer le stock restant de congélateur dans le conteneur à déchets biologique approprié, comme gel nouveau pourrait choquer les cellules.
      3. Incuber la culture starter dans un shaker/incubateur à 30 ° C à 150 rotations par minute (tr/min) et n’oubliez pas de prendre une densité optique à 600 nm (OD 600) lecture lorsqu’il est prêt pour utilisation. Enregistrer l’heure de la croissance et l’OD 600 telle qu’il peut être fait à ce moment-là pour une utilisation ultérieure, telle que les résultats sont reproductibles. À titre d’exemple, cette culture starter était laissée croître pendant 15 h et utilisée à une OD 600 environ 1.0.
    2. Milieu de croissance inoculant
      1. prendre les trois sérum bouteilles préparées à l’étape 1.1.1.2 et la culture de départ établi au 1.3.1.3 et amener les deux à la GCS.
      2. Dans le BSC, en utilisant une seringue stérile 1 mL avec une aiguille de 22G attachée, transfert 0,1 mL de solution de la culture de départ à chacun des flacons sérum, respectivement.
      3. Stériliser le dessus des bouteilles sérum avec 70 % éthanol et recouvrir d’aluminium stérilisé, étiqueter correctement et transférer dans un agitateur orbital dans un incubateur. L’agitateur orbital 150 tr/min et valeur de l’incubateur à 30 ° C. laisser incuber jusqu'à ce que les premières données de 600 OD point est pris, au sein de l’étape 1.3.3.
    3. OD obtenir 600 Points de données
      1. préparer un blanc de déposer 100 µL de stérilisée par filtration distillée désionisée (DI) de l’eau dans une cupule stérile. Envelopper de film plastique paraffine autour du dessus de la cuvette afin que l’eau ne va pas s’encrasser. Conserver à température ambiante. Ce champ avec le spectrophotomètre UV/Vis avant de prendre des points de données pour la courbe de croissance en insérant la cuvette et en appuyant sur utiliser " vide ".
        Remarque : Chaque 48 h un nouveau vide doivent être prêts à éviter des mesures erronnées, comme remplaçant régulièrement un blanc est une bonne pratique.
      2. Pour chaque point de données de 600 OD, retirer les flacons de sérum préparées à l’étape 1.3.2.3 de l’incubateur et le transfert à un GCS stérilisé. Prendre de 0,1 mL de milieu ensemencé de chaque bouteille de sérum et de dépôt en trois marqués séparément des cuves stériles.
      3. Après découpage, insérer la cuvette contenant la culture dans le spectrophotomètre UV visible (UV/Vis) et lire l' OD 600, un à la fois et enregistrer tous les trois lectures pour ce point de temps.
        Remarque : Pour S. oneidensis MR-1, les points de données ont été prises à 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 et 105 h après inoculation. La croissance est terminée lorsque la bactérie a terminé la phase de mort. Ces points devaient être ajustés en conséquence s’il y a manque de connaissances sur le temps de croissance particulier et la tendance des bactéries utilisées dans le présent protocole. S’il y a incertitude quant à la tendance de croissance, les points doivent être des données recueillies plus fréquemment, par exemple, toutes les trois heures pour les 12 premières heures, toutes les six heures pendant les 36 h, à 12 h d’intervalle pour le 100 h suivant et à intervalles de 24 h pour la finale h 124.
      4. à l’aide de l' OD 600 points de données sous l’axe des y et le temps que l’axe des abscisses, graphique une courbe de la moyenne des trois points pris avec des barres d’erreur écart-type pour chaque point de temps à l’aide d’un logiciel graphique. La courbe de croissance de S. oneidensis MR-1 est illustrée à la Figure 1 B dans la section résultats représentatifs.
      5. En utilisant le graphique établi à l’étape 1.3.3.4, déterminer le calendrier de la section de la phase logarithmique de la courbe de croissance. Pour Shewanella, c’est entre 12 et 33 h de croissance ; On peut donc déduire qu’après 24 h de croissance, Shewanella sera dans sa phase logarithmique de croissance, en supposant que la bactérie va être mis en culture en utilisant les mêmes médias et le traitement avant l’utilisation qui a été utilisé pour la courbe de croissance.

2. Cultivant les bactéries

  1. premier jour : inoculer la gélose
    Remarque : cette section de la procédure a été utilisée avec un gel d’agarose plate prendre une unité formant colonie (UFC) à phase logarithmique, au lieu de la culture de départ liquide utilisé pour la courbe de croissance. Cela pourrait supposer que pour reproduire les mêmes conditions de croissance, dû au fait que TSA sans dextrose a été utilisé et par la suite transféré à " nanofils " moyen dans la procédure de courbe de croissance et la TSA a les mêmes ingrédients qui composent le BST.
    1. Enlever GFPbacteria MR-1 S. oneidensis stock de congélateur-80 ° C et la placer dans un seau à glace, placez ce seau à l’intérieur de la BSC stérilisé.
    2. Au sein de la BSC, utiliser une anse à inoculation stérile 1 µL de gratter la surface de l’action de bactéries congelées et d’utiliser la boucle pour T-ensemencer la surface d’une plaque de gel d’agarose.
    3. Après avoir scellé les côtés de la plaque avec le film plastique paraffine, inverser la plaque et le stocker dans une étuve à 30 ° C pendant 24 h, jusqu'à apparaissent des colonies individuelles.
  2. Deuxième journée : inoculer le flacon de sérum
    1. enlever la plaque de l’incubateur et ouverts dans la GCS.
    2. Au sein de la BSC, nettoyer la surface du bouchon en caoutchouc sur une bouteille de sérum préparée à l’étape 1.1.1 avec 70 % d’éthanol dans l’eau distillée.
    3. Sélectionner un CFU individuel dans la gélose et, à l’aide d’une seringue stérile avec un joint 22 aiguille de calibre, déposer assez milieux de croissance pour déloger la colonie de la plaque sans toucher les colonies voisines et mélanger la colonie avec le milieu du bout du l’aiguille.
      NOTE : A seuls colonie doit être sélectionné qui est assez éloigné des autres bactéries de la plaque, telle que moyen peut être déposé sur celui-ci sans toucher les autres colonies.
    4. Extraire à l’aide de la même seringue, le liquide de la surface de la plaque.
    5. Après le tapement des bulles dans la seringue, injecter le liquide dans le flacon de sérum et placer sur un agitateur orbital dans les 30 ° C, fixé à 150 tr/min pendant 24 h.
      NOTE : Les bulles dans la seringue de Tapping sont important afin d’éviter d’introduire plus d’oxygène dans la bouteille de sérum, comme présentant le plus d’oxygène dans la bouteille peut changer les conditions expérimentales et réduire la cohérence entre les temps de croissance pour les bactéries.
  3. Deuxième journée : stérilisation de la Microchannel SALVI
    Remarque : afin de favoriser la stérilité du système de tuyauterie, les étapes qui nécessitent de détacher la seringue de la tubulure et le remplacement avec une nouvelle seringue doivent s’effectuer dans le BSC. Pour ce faire, simplement détacher la seringue de la pompe de seringue en dévissant le titulaire de la seringue métallique et apportent la seringue avec tuyau attaché à un GCS stérile. Quand le système de tuyauterie est mentionné dans les procédures, cela se réfère à la seringue contenant le réservoir de liquid, attaché avec un injecteur polyetheretherketon (PEEK) au tuyau PTFE, attaché à la chambre compte-gouttes, qui a un injecteur de PEEK raccord attaché à la Entrée SALVI tubes, ainsi que le conteneur de sortie que le tube de sortie SALVI est scellé à.
    1. Utiliser un nouvel appareil SALVI et fixer un raccord de PEEK et l’injecteur à une extrémité d’un tube PTFE.
      NOTE : Dispositifs SALVI sont préparés frais pour chaque expérience qui suit la fabrication de dispositifs détaillée sur des recherches antérieures et des brevets. 5 , 6 , 8 , 15
    2. tenir une seringue de 2 mL d’éthanol à 70 % et se connecter pour le montage de coup d’oeil sur le SALVI. Après avoir connecté la seringue d’un pousse-seringue et fixer la sortie de la SALVI à une bouteille pour eaux usées, laisser la solution eau éthanol DI traversent la SALVI à 20 µL/min pendant 1,5 h.
    3. Take 4 mL de DI stérilisée d’eau dans une seringue et raccorder à l’entrée de la même SALVI. Après avoir connecté la seringue d’un pousse-seringue, laisser l’eau traversent le SALVI à 20 μL/min pendant au moins 3 h
    4. Dans un BSC, ouvrir le paquet de feuilles préparé à l’étape 1.2.5 et connectez une injection PEEK stérile, raccord à l’extrémité de la seringue de 5 mL et les raccords de PEEK stériles à l’extrémité de la tubulure de TFE. Prendre ~ 3 mL de milieu stérile dans une seringue et fixer le tube de TFE. Inverser la chambre compte-gouttes de 5 mL et, à l’aide d’une seringue stérile, injecter le milieu de croissance dans la chambre compte-gouttes jusqu'à ce qu’il atteigne un volume total de 1 mL.
    5. Connectez l’extrémité de la chambre compte-gouttes de 5 mL seringue à l’entrée de la SALVI.
    6. Prélever 10 mL de milieu de culture dans une seringue stérile et raccorder à l’entrée du tuyau goutte à goutte. Après avoir connecté la seringue d’un pousse-seringue, laisser le milieu parcourent la SALVI à 20 µL/min pendant 12 h (ou pendant la nuit). Utiliser du ruban adhésif pour garantir les éléments suivants. Couvrir le flacon sortie papier ou film plastique paraffine pour minimiser la probabilité de particules de poussière et les organismes qui y figurent pour contaminer le milieu. On trouvera une description détaillée de la façon dont cette configuration devrait ressembler à la Figure 1 A.
      1. Laisser le tuyau goutte à goutte d’être vertical, ce qui signifie que le pousse-seringue doit être placé sur une surface surélevée avec goutte à goutte tube sécurisé avec du ruban adhésif et avec le SALVI fixé sur une surface plane ci-dessous.
      2. Traversent moyen le SALVI pendant 12 h pour s’assurer que toute trace d’éthanol ont été retirés des microcanaux et tuyaux de la SALVI avant d’inoculer avec bactéries.
      3. Pour une protection supplémentaire, garder la chambre de microcanaux SALVI dans une boîte de Pétri stérile, avec les bords coupés pour s’adapter à l’entrée et le tube de sortie. En outre, gardez tape toujours sur la fenêtre pour protéger la membrane de péché et le canal avant l’analyse d’imagerie.
  4. Jour trois : l’Inoculation de la Microchannel SALVI
    1. Retirez le système de tube entier (seringue connecté pour goutte à goutte chambre reliée à SALVI relié à la bouteille pour eaux usées) de la pompe seringue et l’amener à un BSC stérilisé. En outre, retirer le flacon de sérum étape 2.2.5 de l’incubateur et l’amener à la GCS.
    2. Nettoyer la surface du bouchon de bouteille de sérum avec éthanol à 70 % afin d’éviter toute contamination et ensuite utiliser une seringue stérile avec une aiguille stérile 22G pour extraire 4 mL de bactéries de la bouteille.
    3. Détacher la SALVI de la chambre de 5 mL de tuyau goutte à goutte et connecter la seringue avec inoculé directement à l’entrée de la SALVI. Laisser le tuyau goutte à goutte dans un paquet de feuille d’aluminium stérile ou dans la GCS.
    4. Connecter la seringue avec bouteille SALVI et prise de courant à la pompe de seringue pour courir à 20 µL/min pendant 3 h inoculer le canal de la SALVI, afin de permettre plusieurs variations de volume du liquide contenu dans les SALVI.
    5. Après l’inoculation, déconnecter la seringue avec SALVI le pousse-seringue et apportent à la GCS. Après avoir fixé l’entrée de la SALVI à la chambre de goutte à goutte 5 mL de l’étape 2.4.3, prélever 20 mL de milieu de culture dans une seringue stérile et fixer à l’entrée du tuyau goutte à goutte.
    6. Mettre le tuyau attaché à la SALVI des GCS de la seringue et laisser le moyen de passer à travers la tubulure à raison de 2 µL/min pendant six à dix jours, ou jusqu'à ce que l’imagerie de fluorescence (voir étape 3) montre une croissance favorable biofilm visible pour Analyse de ToF-SIMS. Remplissez un milieu frais, comme il s’épuise dans la GCS en remplissant une nouvelle seringue stérile de 10mL de milieu de croissance et en fixant à la SALVI après le milieu de croissance précédente est épuisée.
      Remarque : Après le début de l’inoculation à 2 µL/min, le débit ne doit jamais être augmenté ou diminué, comme changer la vitesse d’écoulement créerait la contrainte de cisaillement dans le chenal et détacher le biofilm. Il est essentiel que ce débit ne doit jamais être changé ; pour préparer ce, ~ 24h avant SIMS, observer le tube étroitement pour s’assurer qu'il n’y a pas de bulles afin qu’il n’y a pas besoin de pousser plus moyen à un rythme plus rapide tout au long de la tubulure.
      1. Eviter bulles dans le microcanaux, comme ils peuvent pousser le biofilm sorti du chenal. Il est important d’être prudent lorsque des bulles dans le bas du tuyau goutte à goutte 5 mL où elle se raccorde au tuyau SALVI. Un milieu frais peut être injecté dans l’extrémité de l’injecteur PEEK pour s’assurer qu’aucun flux d’air ne sera forcé dans la SALVI.

3. Optique d’imagerie du Biofilm dans les microcanaux SALVI

  1. Microscopie de Fluorescence Imaging
    Remarque : l' Shewanella utilisée comme organisme modèle dans le présent protocole est muté pour exprimer la GFP ; par conséquent, il ne nécessite pas la coloration. Si les bactéries exigent une coloration, cela devrait toujours se faire au même débit (p. ex., 2 µL/min) pour éviter le détachement du biofilm. En outre, quand les cellules vont sans la disponibilité des nutriments, ils seront détachera. Par conséquent, si un marquage supplémentaire est nécessaire, la tache doit être injectée au milieu de croissance plutôt que l’eau avant de fournir pour souiller les cellules.
    1. Détacher la SALVI du goutte à goutte tube à l’intérieur de la BSC et fermer le SALVI en vissant les raccords de PEEK pour serrez l’union PEEK.
    2. Tape le tube de la chambre de microcanaux SALVI solidement sur une lame de verre, telle que la fenêtre est complètement plat et orienté vers le haut. Retirez la pellicule protectrice de la fenêtre. Fixez la lame sur la scène du microscope en plaçant la lame de verre entre les mâchoires de phase sur la plate-forme.
    3. Plus bas la scène du microscope telle que la partie supérieure de la SALVI est positionnée assez proche de l’extrémité de l’objectif 10 X, où réglage du focus ne causera pas l’objectif de toucher la fenêtre.
    4. Interrupteur sur le rétro-éclairage et de trouver le canal à l’aide de la 10 x objectif de microscope en ajustant la mise au point. Pour l’instant, assurez-vous que la présence de l’attachement des bactéries à la fenêtre de péché de la SALVI est apparente par rapport à la fenêtre d’un canal de contrôle avec aucune des bactéries inoculées. Pour l’imagerie plus près des cellules, basculez vers l’objectif 20 x. Par rapport à un canal vide de SALVI, la présence de bactéries, attaché à la fenêtre doit avoir une forte fluorescence verte.
    5. Désactiver le rétro-éclairage et allumez la source de mercure microscope. Attendre 2-3 min et passer au filtre FITC situé sur le microscope à vue et capture des images du biofilm attaché à la fenêtre. À titre d’exemple de ce que le biofilm ayant subi une maturation va ressembler une fois prêt, voir Figure 1 C.
    6. Tour de la source de mercure et détacher la SALVI de la diapositive. Si nécessaire, joindre au 2 µL/min Débit moyen une fois de plus pour permettre une croissance plus avant encore d’imagerie, ou transférer le SALVI à usage de confinement secondaire pour l’analyse de ToF-SIMS. Ceci est nécessaire si l’épaisseur du biofilm est conclu pour ne pas être assez épais, et plus de temps pour la croissance est nécessaire avant l’analyse par ToF-SIMS. Pour joindre au débit moyen une fois de plus, reportez-vous à l’étape 2.3.6.
      Remarque : Si remis en vertu de l’écoulement moyen, imagerie de fluorescence doit être effectué à nouveau avant l’analyse par ToF-SIMS.
      1. Donner le biofilm croissance moyenne à le nourrir jusqu'à ce que ToF-SIMS peuvent être analysés. Bien que ne pas recommandée, si nécessaire, le SALVI fermée peut être conservé à 4 ° C durant la nuit, mais devrait pouvoir se réchauffer à température ambiante avant de l’insérer à la chambre à vide de la ToF-SIMS. Toutefois, analyser le biofilm immédiatement après détaché de débit moyen pour réduire le biofilm détachement.

4. Acquisition de données de ToF-SIMS

Remarque : cette section sert à une vue d’ensemble et est discutée plus en détail dans notre protocole antérieure décrivant analyse de SIMS liquide de la molécule adsorbée protéine. 12

  1. SALVI installer dans la chambre de Loadlock ToF-SIMS
    Remarque : gants doivent être portés à tout moment lorsque l’appareil SALVI et installation sur la ToF-SIMS stade afin d’éviter des contaminations potentielles au cours de la surface analyse.
    1. SALVI de monter sur scène et fixez-le avec plusieurs vis. Assurez-vous que la fenêtre de péché est plat par serrage de vis réglage et insertion plaquette de silicium morceaux au fond de la chambre de microcanaux PDMS. Retirer la pellicule protectrice de la fenêtre, puis chargez la scène dans la chambre de loadlock ToF-SIMS.
    2. Ouvrir la loadlock ToF-SIMS, organiser et préparer un horizontalement sur la rampe de chargement et fermer la porte de loadlock. Amorcer la pompe à vide et attendre pour s’assurer que ce vide approprié est atteint.
    3. Déplacer la SALVI dans la chambre principale, une fois que le vide est stabilisé à 1 x 10 -7 mbar.
  2. Profondeur de profilage et de Points de données de collecte
    1. trouver le canal microfluidique à l’aide du microscope optique équipé en ToF-SIMS.
    2. Sélectionner le mode positif ou négatif avant l’acquisition de données. Utilisation le 25 keV Bi 3 + du faisceau comme le faisceau d’ions primaires dans toutes les mesures et utiliser le canon à électrons inondation pour neutraliser la surface de charge au cours de toutes les mesures.
    3. Balayage du faisceau de 3 + Bi avec une impulsion de ns 150 largeur sur une zone ronde d’un diamètre de ~ 2 µm avec 64 pixels par 64 pixels de résolution. Après avoir percé à travers la fenêtre de SiN 100 nm, continuer à rechercher un autre 150 s pour recueillir des données de haute intensité pour l’imagerie. Après distancia, comtes augmentera de manière significative dans la profondeur, région de profilage. Après la stabilisation, ceci peut être dénommé la région de haute intensité.
    4. Réduire la largeur d’impulsion de 50 ns pour la collecte de données d’acquérir des spectres avec une meilleure résolution de masse. Continuer cette acquisition pour environ 200 un autre s.
    5. Répétez ces étapes pour recueillir au moins trois résultats positifs et trois points de données négatives.
      Remarque : N’oubliez pas d’espacer les zones distancia, telle que la fenêtre de péché ne cassera pas et fuite dans la chambre du vide du compromis fenêtre intégrité.

5. Analyse de données de ToF-SIMS

  1. masse d’étalonnage à l’aide de logiciel de IonToF
    1. Ouvrez le logiciel d’analyse de ToF-SIMS (mesure Explorer), puis cliquez sur le " profils ", " les spectres " et " image " boutons, respectivement, au profil de profondeur des processus, spectre de m/z et des données image.
    2. Ouvrir les fichiers de données obtenues tout au long de l’acquisition de données de ToF-SIMS.
    3. Sélectionner la profondeur de profilage des données d’intérêt et de reconstruire les spectres selon la série temporelle du profil profondeur.
    4. Presse " F3 " pour ouvrir le " masse de calibrage " fenêtre. Choisissez des pics pour l’étalonnage basé sur des composés chimiques qui sont censées exister dans l’échantillon spécifique.
  2. Pics de sélection de l’intérêt
    1. sélection de pointe étant nécessaire pour l’analyse de l’échantillon, déterminer pics caractéristiques de l’échantillon selon la littérature ou des autres, le cas échéant. Comparer l’intensité des pics d’intérêt dans les spectres de m/z. Si nécessaire, ajouter de nouveaux pics ou supprimer des pics d’interférence dans la liste PIC.
    2. Clic sur un pic, trouver les lignes rouges à la fenêtre en bas à gauche. Déplacer les lignes rouges pour encadrer le sommet entier.
    3. Sélectionner un pic correspondant à la formule chimique dans la fenêtre principale de spectre, puis de cliquer sur le " ajouter pic " bouton au-dessus de la fenêtre. < /Li >
  3. Exporter les données calibrées masse
    1. pour exporter une liste de pointe, dans le " Peak liste " menu, sélectionnez " sauver … " la liste PIC dans le " itmil " format.
    2. D’exporter un profil de profondeur, dans le " profil " fenêtre, cliquez sur le " fichier " menu, puis sélectionnez " exportation ", puis sélectionnez " enregistrer en tant que " un " .txt " fichier.
    3. D’exporter un fichier du spectre de m/z, dans le " Spectra " fenêtre, cliquez sur le " fichier " menu, puis sélectionnez " exportation ", puis sélectionnez " enregistrer en tant que " un " .txt " fichier.
    4. D’exporter un fichier image, dans la " Image " fenêtre, Impr écran et enregistrer le fichier image.

6. ToF-SIMS données traçant et présentation

  1. utiliser un outil graphique pour importer les données.
  2. Faire un tracé à l’aide de m/z comme l’axe des abscisses et le pic intensité comme l’axe des ordonnées pour montrer le spectre reconstitué. Un exemple est donné dans la Figure 2 A.
  3. Combine reconstruit des images bidimensionnelles (2D) de différente m/z et forme une matrice pour afficher chaque mappage d’ion positif ou négatif. Un exemple est donné dans la Figure 2 B.

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Résultats

Ces résultats représentatifs servent à montrer comment le profil chimique du biofilm ci-joint peut être identifié et interprété, obtenus par le biais de ToF-SIMS. Après traçage des spectres de masse d’acquisition de données de ToF-SIMS, a souligné brièvement dans la section procédures, identification des pics devrait être effectuée afin d’affecter des identités à chaque valeur de m/z respectifs. Ceci est possible grâce à l’analyse documentaire approfondie sur la spectrométrie de masse sur...

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Discussion

Après inoculation à la phase logarithmique, il est important de tester le nombre de jours et de la température à laquelle le biofilm devrait croître avant qu’il soit sain et assez épais pour l’imagerie, comme indiqué au point 3.1. Cette procédure couvre spécifiquement cultivant un S. oneidensis MR1 biofilm à température ambiante ; Cependant, des températures ambiantes différentes peuvent influencer le taux de croissance. Par conséquent, il est essentiel d’utiliser l’imagerie optique pour comprendre si le biofilm est prêt...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à la Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) la terre et des Sciences biologiques (EBD) mission réalisé laboratoire de recherche et développement (LDRD) Fonds d’amorçage pour la prise en charge. Accès instrumental a été fourni par une proposition d’utilisation générales de W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL est une installation utilisateur scientifique national parrainée par la Office of Biological and Environmental Research (BER) à PPNL. Les auteurs remercient Dr Yuanzhao Ding pour preuve lire le manuscrit et fournir une rétroaction utile. PPNL est exploité par Battelle pour l’entité opérationnelle désignée en vertu du contrat DE-AC05-76RL01830.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ToF-SIMSIONTOFTOF. Résolution SIMS 5: >10 000 m/&Delta ; m pour résolution de masse ; >4 000 m/&Delta ; Système
d’analyse à l’interface du vide liquide (SALVI)Pacific Northwest National LaboratoryN/ASALVI est un outil d’analyse unique, autonome et portable qui, pour la première fois, permet à des instruments scientifiques basés sur le vide tels que la spectrométrie de masse d’ions secondaires à temps de vol (ToF-SIMS) d’analyser les surfaces liquides à l’état naturel au niveau moléculaire.
-80° ; C FreezerNew Brunswick ScientificN/AU410 Congélateur à ultra-basse température économe en énergie de qualité supérieure
4 ° C RéfrigérateurBioCold ScientificN/ACOLDBOX1
Orbital ShakerNew Brunswick ScientificN/AInnova 4900 Agitateur environnemental à plusieurs niveaux, réglé à 30 degrés Celsius pour la culture de bouteilles de sérum et de flacons, réglé à 150 tr/min.
Pousse-seringueCole-ParmerEW-74905-02Pousse-seringue Cole-Parmer, perfusion uniquement, commande à écran tactile 74905-02, utilisé pour injecter du liquide dans le système de tuyauterie et SALVI à un débit constant.
IncubateurBarnstead InternationalLT1465X3Incubateur Lab-Line, réglé à 30 degrés Celsius pour la culture sur plaques.
AutoclaveGetinge533LSUtilisé pour stériliser les raccords PEEK, les systèmes de tubulures, les flacons de sérum et le fluide. Modèle 533LS Spectrophotomètre de stérilisateur à vapeur sous vide
Thermo Fisher Scientific4001-000Spectrophotomètre GENESYS 20 pour lectures OD600 de cuvettes pour les courbes de croissance.
Armoire de sécurité biologiqueThermo Fisher Scientific1385Série 1300 AZ Microscope à fluorescence de l’armoire de sécurité biologique
NikonN/AMicroscope à fluorescence Nikon OPTIPHOT-2 avec caméra et alimentation à lampe au mercure à très haute pression.
pH-mètreMettler Toledo51302803Utilisé pour tester le pH du " nanofils" Moyen après finition et avant autoclavage.
Union PEEKValcoZU1TPKPour connecter l’entrée et la sortie de SALVI, la seringue au système de tuyauterie et l’entrée de la SALVI à la chambre d’égouttage du système de tuyauterie.
platine d’échantillonnage à 5 axesIONTOFN/Aest fabriquée par nos soins pour le montage de SALVI en ToF-SIMS.
Système de purification d’eau Barnstead NanopureThermo Fisher ScientificD11921Module de filtration par osmose inverse ROpure LP (D2716)
PipetteThermo Fisher Scientific21-377-821Plage : 100 à 1 000 µ ;L.
Pointe de pipetteNeptune2112.96.BS1 000 & micro ; Pointes de pipette L
Poignée de lame de rasoirStanleyN/AGrattoir à lame de rasoir Stanley Bostitch avec 5 lames à simple tranchant, utilisé pour couper des tubes en PTFE
SeringueBD 3096591 mL
SeringueBD3096573 mL
SeringueBD3096465 ml ; Utilisé pour la fabrication de la seringue à chambre d’égouttement
BD30960410 mL
SeringueBD30283020 mL
Pipette jetableThermo Fisher Scientific13-678-1125 mL Fisherbrand&trade ; Pipettes sérologiques jetables en polystyrène stérile avec bande de loupe, pour le remplissage de flacons de sérum.
Remplisseuse de pipettes électriquePipet-aidP-57260Pression sous vide Remplisseuse de pipette sérologique électrique
Flacon de sérumSigma33109-UContient environ 69 ml de liquide pour la croissance de la culture, optimal pour l’utilisation de 20 ml de culture par bouteille.
Tube de culture anaérobieVWR89167-178Tubes anaérobies, 18 x 150 mm, fournis avec un bouchon en caoutchouc butyle bleu de 20 mm et un joint en aluminium.
Bouchon en caoutchoucSigma27235-UBouchon en silicone, utilisé pour sceller les flacons de sérum et pour créer le système de tubulure/chambre d’égouttement.
Joint de sertissage en aluminium (sans septum)Sigma27227-UJoint en aluminium pour le haut de la bouteille de sérum à utiliser avec la sertisseuse de bouteille de sérum.
Serum Bottle Aluminum SealCrimper Wheaton224307sertisseuse de 30 mm avec joint standard.
Tube en PTFESupelco58697-U1,58 mm OD x 0,5 mm ID Tube en téflon PTFE de 50 pieds, utilisé pour créer le système de tubes.
Cuvettes jetablesGMBH759085D1,5 ml pour utilisation avec spectrophotomètre.
AiguilleBD30301522G ; utilisée pour l’injection de sérum en flacon.
AiguilleBD30512023G ; utilisée pour le poinçonnage d’un bouchon en caoutchouc pour créer un système de tuyau d’égouttement.
Shewanella oneidensis MR-1 avec GFPN/A/AMatthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction de vecteurs GFP pour utilisation dans les bactéries à Gram négatif autres qu’Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1) :87-94.  ;
ÉthanolThermo Fisher Scientific  ; S25310A95 % de
de soja TSABD212305dénaturée pour la culture de l’organisme modèle (S. oneidensis) utilisé dans ce protocole
PIPES BufferSigmaP-1851Utilisé pour " nanofils" medium {Hill, E.A. 2007}
Hydroxyde de sodiumSigmaS-5881Utilisé pour " nanofils" medium {Hill, E.A. 2007}Chlorure
d’ammoniumSigmaA-5666Utilisé pour " nanofils" medium {Hill, E.A. 2007}
Chlorurede potassium SigmaP-4504Utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Phosphate de sodium monobasiqueSigmaS-9638Utilisé pour " nanofils" medium {Hill, E.A. 2007}
Chlorure de sodiumThermo Fisher ScientificS271-3Utilisé pour " nanofils" et utilisé pour fabriquer une solution minérale utilisée pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Lactate de sodiumSigmaL-137560 % (p/p) @ pur à 98 %, d = 1,3 g/mL, 7M, utilisé pour « nanofils" medium {Hill, E.A. 2007}Bicarbonate
sodiumSigmaS-5761Utilisé pour fabriquer une solution ferrique de NTA, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Acide nitrilotriacétique Sel trisodiqueSigmaN-0253Utilisé pour fabriquer une solution ferrique de NTA, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Chlorure de fer (III)Sigma451649Utilisé pour fabriquer une solution ferrique de NTA, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Sulfate de magnésiumSigma208094Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Sulfate de manganèse (II) monohydratéSigmaM-7634Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Sulfate de fer(II) HeptahydrateSigma215422Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}Chlorure
calcium dihydratéSigma223506Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour « nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}Chlorure
cobalt(II)Sigma60818Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Chlorure de zincSigma229997Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Sulfate de cuivre(II) PentahydrateSigmaC-8027Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Sulfate d’aluminium et de potassium dodécahydrate237086Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Acide boriqueSigmaB-6768Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Molybdate de sodium DihydrateSigma331058Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Chlorure de nickel(II)Sigma339350Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate DihydrateSigma14304Utilisé pour fabriquer une solution minérale, utilisé pour " nanofils" medium {Hill, E.A. 2007}
D-BiotinSigma47868Utilisé pour fabriquer une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" medium {Hill, E.A. 2007}
Acide foliqueSigmaF-7876Utilisé pour fabriquer une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}Chlorhydrate
pyridoxineSigmaP-9755Utilisé pour fabriquer une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavine (B2)Sigma47861Utilisé pour fabriquer une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}Chlorhydrate
thiamineSigmaT-4625Utilisé pour fabriquer une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Acide nicotiniqueSigmaN4126Utilisé pour fabriquer une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Acide D-pantothénique Sel hémicalciqueSigma21210Utilisé pour fabriquer une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Vitamine B12SigmaV-2876Utilisé pour faire une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Acide 4-aminobenzoïqueSigmaA-9878Utilisé pour fabriquer une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
Acide thioctiqueSigmaT-1395Utilisé pour fabriquer une solution vitaminique, utilisé pour " nanofils" moyen {Hill, E.A. 2007}
La Ngélose tryptique sirop à de de de de de

Références

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