Analyse automatisée d'un essai de préférence chimiosensible basée sur la population à base de nématodes

Résumé

Nous présentons une configuration et un protocole d'enregistrement du comportement qui permettent une analyse automatisée du nématode, la préférence de Caenorhabditis elegans pour les composés solubles dans un dosage basé sur la population. Cet article décrit la construction d'une chambre de comportement, du protocole d'analyse comportementale et de l'utilisation d'un logiciel d'analyse vidéo.

Résumé

Le nématode, le système nerveux compact de Caenorhabditis elegans de seulement 302 neurones, sous-tend un répertoire diversifié de comportements. Pour faciliter la dissection des circuits neuronaux sous-jacents à ces comportements, le développement de tests comportementaux robustes et reproductibles est nécessaire. Les études antérieures antérieures de C. elegans ont utilisé des variations d'un «test de chute», d'un «test de chimiotaxie» et d'un «essai de rétention» pour enquêter sur la réponse de C. elegans aux composés solubles. La méthode décrite dans cet article cherche à combiner les forces complémentaires des trois essais précités. En bref, un petit cercle au milieu de chaque plaque de dosage est divisé en quatre quadrants avec le contrôle et des solutions expérimentales placées alternativement. Après l'addition des vers, les plaques de dosage sont chargées dans une chambre de comportement où les caméras de microscope enregistrent les rencontres de vers avec les régions traitées. L'analyse automatisée de la vidéo est ensuite effectuéeEt une valeur d'indice de préférence (PI) pour chaque vidéo est générée. L'acquisition vidéo et les fonctionnalités d'analyse automatisée de cette méthode minimisent la participation de l'expérimentateur et les erreurs associées. En outre, des quantités minimes du composé expérimental sont utilisées par dosage et la configuration multi-caméras de la chambre de comportement augmente le débit expérimental. Cette méthode est particulièrement utile pour conduire des écrans comportementaux de mutants génétiques et de nouveaux composés chimiques. Cependant, cette méthode n'est pas appropriée pour étudier la migration de gradient de stimulus en raison de la proximité étroite des régions de contrôle et de solution expérimentale. Il ne devrait pas non plus être utilisé lorsque seule une petite population de vers est disponible. Bien que approprié pour analyser les réponses uniquement aux composés solubles sous sa forme actuelle, cette méthode peut être facilement modifiée pour tenir compte de l'interaction sensorielle multimodale et des études optogénétiques. Ce procédé peut également être adapté pour analyser les réponses chimiosensorielles d'autres espèces de nématodes.

Introduction

Les animaux à fourrage doivent intégrer les intrants à partir de multiples modalités sensorielles et choisir des stratégies comportementales appropriées afin de naviguer avec succès dans leur environnement. Comprendre comment les entrées sensorielles externes sont reçues et transduites en information neurale pour guider la sélection d'action est un objectif central dans le domaine de la neurobiologie. Le nématode génétiquement traitable, C. elegans , est un organisme modèle attrayant dans lequel étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents à la biologie sensorielle et l'intégration multimodale. Bien que C. elegans ait seulement 302 neurones, il peut détecter et discriminer entre une grande variété de stimuli environnementaux, y compris les composés solubles, les odeurs volatiles et la température ambiante ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . leLe nématode C. elegans s'appuie fortement sur son appareil chimiosensible pour localiser les sources de nourriture et pour s'alourdir des menaces potentielles. Ainsi, les tests comportementaux conçus pour filtrer les réponses des C. elegans de type sauvage et mutant aux stimuli chimiques jouent un rôle crucial dans la dissection des mécanismes génétiques, cellulaires et neuronaux qui sous-tendent les capacités sensorielles remarquables de C. elegans .

Pour analyser la réponse aux composés solubles, on a décrit trois types d'essais: le test de chute, le dosage de chimiotaxie et le dosage de rétention. Dans le test de chute, une petite goutte du composé est placée à la queue d'un ver mobile et la décision du ver pour inverser ou avancer une fois que le liquide atteint l'appareil sensoriel antérieur est marquée ⁴ . Le test de chute nécessite peu de préparation expérimentale et est utile lorsque la taille de l'échantillon de vers est faible, comme dans le cas des vers à laser. Cependant, comme un seul verPeut être testé à la fois et l'expérimentateur doit être présent pendant toute la durée de l'essai, le test de chute peut prendre beaucoup de temps. Le test de chute est également vulnérable aux variations de la livraison de la goutte entre chaque ver dans un échantillon, ce qui peut influencer les résultats globaux du dosage. Une autre limitation du test de chute est qu'il ne peut être utilisé que pour analyser la réponse du ver à des composés aversifs car il n'est pas possible de discriminer entre un effet attractif ou neutre du composé à partir du mouvement vers l'avant du vers.

Le dosage de la chimiotaxis pour les composés solubles implique généralement la division d'une plaque de gélose en quatre quadrants, la solution expérimentale étant mélangée dans l'agar de deux quadrants opposés et la solution témoin mélangée dans les deux autres quadrants ^{8 , 9} . Au début de l'analyse, une goutte de tampon contenant des vers est placée au centre de la plaque et le nombre de vers dans Chaque quadrant est marqué à différents moments. Le dosage de la chimiotaxie fournit une plus grande puissance statistique par rapport au test de chute, car un grand nombre de vers sont testés dans chaque essai. Cependant, une limitation de cette méthode est que la préparation des plaques de dosage de chimiotaxis nécessite de grandes quantités du composé expérimental. Cela rendra difficile la réalisation d'écrans de comportement à grande échelle si un processus de purification complexe avec des rendements limités est nécessaire pour obtenir le composé d'intérêt, comme dans le cas des molécules de signalisation d'ascaroside ¹⁰ . En outre, le comptage manuel des vers tout au long de l'analyse est susceptible d'erreurs et la perturbation des plaques pendant le processus de comptage peut affecter les résultats.

Contrairement aux deux procédés susmentionnés, le dosage de retenue utilise une vision mécanique, qui minimise l'erreur lors du processus de notation et réduit l'interférence de l'expérimentateur pendant l'essai > 11. L'analyse informatisée des enregistrements vidéo du comportement des vers peut également révéler des dynamiques comportementales plus subtiles qui seront manquées lorsque la notation est effectuée uniquement sur quelques points temporels discrets. Dans le dosage de rétention, deux points de solutions sont ajoutés sur les côtés opposés d'un petit patch alimentaire bactérien circulaire, suivi du placement d'un petit nombre de vers dans le milieu du patch alimentaire. Le comportement des vers est ensuite enregistré, analysé, et une valeur d'indice de préférence est calculée en fonction du nombre total de pixels de ver dans chaque région de solution. Bien que la présence d'un patch alimentaire attrayant permet d'utiliser de plus petites populations de vers dans chaque essai, les aliments ont déjà montré qu'ils sensibilisent les agents de répulsion aux répulsifs solubles ¹² . En outre, les vers affichent une réponse photophobe à la lumière à courte longueur d'onde et l'utilisation de sources lumineuses au microscope qui émettent de la lumière blanche dans l'installation de l'enregistrement du comportement peut affecter le comportementS = "xref"> 13.

Le but de la méthode décrite dans cet article est d'enregistrer et d'analyser la préférence de C. elegans pour les composés solubles en utilisant un dosage basé sur la population. À cette fin, la méthode actuelle intègre et améliore les aspects des trois méthodes décrites précédemment. Il permet de tester de grandes populations de vers et ne nécessite que de petites quantités de la solution expérimentale à utiliser dans chaque essai. En outre, l'analyse est effectuée dans une chambre de comportement fermée personnalisée avec rétro-éclairage à infrarouge pour minimiser les effets de la lumière à courte longueur d'onde sur le comportement. Chaque chambre peut également être équipée de caméras microscopiques multiples, ce qui augmente le débit expérimental sans compromettre l'espace de banc. Enfin, le logiciel d'analyse vidéo affiche la valeur de l'indice de préférence pour chaque vidéo ainsi qu'un graphique d'occupation du ver accompagnant pour visualiser la dynamique du comportement de la population au fil du temps. La configuration de la chambre et unLe protocole Ssay peut être modifié pour étudier les réponses au comportement multimodal telles que l'effet des odorants ou la température sur les comportements chimiosensibles.

Cet article décrit la construction de la chambre de comportement et le protocole d'essai. Il démontre également l'utilité de cette méthode dans le dosage de la réponse de vers de type sauvage et de mutants défectueux chimiosensibles au répulsif soluble connu, ions de cuivre ⁴ . Enfin, le processus d'analyse vidéo utilisant le logiciel fourni est détaillé.

Protocole

1. Assemblée de la Chambre de Comportement

REMARQUE: La chambre de comportement se compose d'un cadre approximativement en forme de cube en barres en aluminium extrudé, recouvert de housses en tissu opaque, avec un fond acrylique transparent et des supports de caméra. Les articulations entre les barres en aluminium extrudé formant la chambre de comportement sont toutes perpendiculaires et sont sécurisées à l'aide de supports de coin en "L" (1 pouce de largeur avec 1 pouce de jambes) qui fixent une jambe de support d'angle à chaque barre avec des vis et une glissière T-nuts. Chaque joint est sécurisé avec un ou deux supports d'angle comme décrit ci-dessous. Les housses de tissu qui recouvrent la chambre sont fixées aux barres de châssis en aluminium avec les mêmes vis et écrous T coulissants mais à travers des œillets dans les coins du tissu. Les vis sont correctement insérées dans le côté frais des écrous T coulissants, et non sur le côté avec la lèvre en saillie. Lors de la fixation d'un assemblage de vis / écrou à écrou en T sur une barre en aluminium, faites glisser l'écrou en T dans le canalSur la face appropriée de la barre avec la tête de la vis sortant de la fente.

1. Préparez les couvertures en tissu.
   1. Utilisez des ciseaux pour couper cinq morceaux de tissu de polyester opaque pour couvrir le dessus et les quatre côtés de la chambre.
      1. Couper un carré de 14 x 14 pouces ² feuilles de tissu pour le haut de la chambre. Coupez quatre feuilles de tissu rectangulaires de 11 x 14 pouces ² pour les côtés de la chambre.
   2. Installer les oeillets aux coins des feuilles de tissu.
      1. Marquez une ligne de référence à 0,5 pouce de chaque bord des cinq feuilles de tissu en polyester à l'aide d'un crayon et d'un rayon.
      2. Pour les quatre feuilles rectangulaires, utilisez des pinces à passe-bande pour insérer des oeillets centrés là où les lignes de crayon se croisent à chaque coin (c'est-à-dire 4 grommets par feuille).
      3. Pour la feuille carrée, insérez deux oeillets le long de chaque bord avec chaque oeillet centré sur la ligne de crayon et situé à 1,5 pouce de la fin de chacun desLes quatre lignes de crayon (soit 8 grommets au total, deux près de chaque coin).
   3. Insérez une vis dans chaque trou de passe-bouchon et attachez légèrement un écrou en T à chacun.
2. Fabriquer des barres de montage de caméra.
   1. Utilisez une scie à ruban ou équivalente pour couper une pièce d'extrusion en aluminium de 2 pouces de long pour chaque caméra, ce qui garantit que l'extrémité coupée de la barre est perpendiculaire à la longueur de la barre pour faciliter l'assemblage ultérieur.
   2. Utilisez une perceuse avec un foret de 0,25 pouce de diamètre pour forer un trou à travers les bandes centrales de chaque barre de montage de la caméra, à 0,75 pouce d'une extrémité de sorte que le trou soit perpendiculaire aux faces supérieure et inférieure et passe à travers l'axe de la barre . En option, percez le trou à l'aide d'une perceuse électrique portative avec un foret de 0,25 pouce, mais assurez-vous que le trou est perpendiculaire aux faces supérieure et inférieure de la barre.
3. Préparez tous les supports d'angle.
   1. Insérer une vis dans le trou dansChaque jambe de support d'angle, en insérant la vis du côté de l'angle intérieur. Enfiler légèrement un écrou en T sur chaque vis.
4. Préparez l'ensemble de montage de la caméra ( Figure 1B , couche 2).
   REMARQUE: L'ensemble de montage de la caméra est un assemblage en forme de "H" qui prend en charge les trois étuis de caméra.
   1. Fixez les barres de montage de la caméra à la barre centrale de l'ensemble de montage de la caméra.
      1. Disposez les trois barres de montage de la caméra fabriquées à l'étape 1.2 avec les trous forés orientés verticalement. Glissez deux supports d'angle sur les côtés de chaque barre de montage à l'extrémité la plus éloignée du trou percé.
      2. Placez les supports d'angle avec les jambes des brackets alignés avec l'extrémité de la barre et serrez les vis pour la fixer en place. Cela forme une forme "T" avec le trou percé au bas du "T".
      3. Posez une extrusion en aluminium de 1 pied sur la surface de travail. Glisser les écrous en T d'une barre de montage de caméra(De l'étape précédente) sur un côté de la barre de 1 pied. Centrez la barre de montage le long de la longueur de la barre de 1 pied et serrez les vis pour la fixer en place. Glissez les deux autres barres de montage sur le côté opposé de la barre de 1 pied.
      4. Placez les deux barres équidistantes du milieu de la barre de 1 pied, avec leurs supports de coin internes à environ 2,5 pouces d'écart. Glisser les supports d'angle sur les côtés de la barre de 1 pied, deux à chaque extrémité de la barre. Placez les supports d'angle avec les jambes des crochets alignés avec les extrémités de la barre et serrez les vis pour la fixer en place.
   2. Fixez les barres d'extrémité à la barre centrale.
      1. Glisser deux extrusions en aluminium de 1 pied sur les écrous en T à chaque extrémité de l'ensemble de l'étape précédente en formant une forme "H". Centrez chaque barre d'extrémité sur la barre centrale et fixez-la en serrant les quatre vis.
      2. Glisser quatre supports d'angle sur le dessus des deux barres d'extrémité ajoutées à l'étape précédente, une à chaque extrémitéDe chaque barre. Placez les supports d'angle avec les jambes des brackets affleurant les extrémités des barres et serrez les vis pour la fixer en place.
   3. Fixez les supports de caméra et les étuis à l'ensemble de montage de la caméra.
      1. Pour chacun des trois supports de caméras de microscope, retirez l'étui de l'appareil photo en desserrant la vis à main et en faisant glisser la tige de support.
      2. Pour chaque barre de montage de la caméra (maintenant fixée à la barre centrale du "H"), placez une rondelle sur une vis à tête ronde, glissez la vis à travers le trou percé dans la barre de montage de la caméra et placez une autre rondelle vers le bas sur la vis . Enfilez le trou taraudé de la tige du support de la caméra sur la vis, serrez fermement contre la barre de montage de la caméra.
      3. Répétez les étapes 14.3.2 pour les deux autres barres de montage de la caméra.
      4. Glissez un étui de caméra sur chaque barre de support de caméra avec l'ouverture plus large orientée vers la barre de montage de la caméra et la vis. Fixez temporairement l'étui au support de l'appareil photo rAvec la vis à main de l'étui.
         REMARQUE: La position de fonctionnement finale sera définie dans la section 2.
5. Assembler le cadre de la chambre de comportement ( Figure 1A ).
   REMARQUE: Pour faciliter la construction, montez le cadre à l'envers, en commençant par le "haut" du cadre de la chambre sur la surface de travail ( Figure 1B , couche 1) et travaillez vers le haut vers les "pieds" du cadre ( Figure 1B , couche 3).
   1. Pour assembler la couche supérieure de la chambre de comportement, fixez quatre barres en aluminium extrudé de 1 pied sur la feuille de polyester carrée ( figure 1B , couche 1).
      1. Faites glisser une barre sur les deux écrous en T le long de chaque bord de la feuille de tissu, en centrant la barre le long de la largeur du tissu. Serrez les attaches pour fixer la feuille de tissu à chaque barre.
      2. Étaler la feuille de polyester carrée sur la surface de travail wiLes quatre barres en aluminium attachées en haut. Glissez huit supports d'angle sur les surfaces supérieures des quatre barres en aluminium, une à chaque extrémité de chaque barre. Placez les supports d'angle sur les barres avec les jambes verticales des crochets alignées avec les extrémités des barres. Assurez-vous en serrant les vis dans les écrous T.
   2. Dans chaque coin, placez une extrusion d'aluminium supplémentaire de 1 pied en position verticale, glissant l'extrusion sur les écrous en T sur les deux branches du support d'angle.
   3. Fixez la barre verticale aux barres horizontales en serrant les attaches, en joignant ainsi les deux barres horizontales adjacentes.
      REMARQUE: Une fois terminé, les huit extrusions (quatre horizontales et quatre verticales) formeront une bague carrée sur la table avec quatre posts collés vers le haut ( Figure 1B , couche 1).
   4. Glissez les écrous en T lâchés de l'ensemble de montage de la caméra en "H" de la section 1.4 vers le bas dans les montants du cadre de l'étape précédente. Laissez le "H & #34; Glisse tout le chemin vers le bas pour vous reposer sur les supports d'angle à chaque coin du cadre. Fixez l'ensemble de montage de la caméra en place en serrant les quatre vis du support de coin.
   5. Assembler la couche inférieure de la chambre à l'aide des quatre barres d'aluminium extrudées de 1 pied définies ( Figure 1B , couche 3).
      1. Glissez un support d'angle sur chaque extrémité de chaque barre de 1 pied, placez les supports d'angle avec les jambes des crochets alignés avec les extrémités de la barre et serrez les vis pour la fixer en place.
      2. Faites glisser les barres entre les montants de l'image avec les écrous T en vrac dans les canaux des montants. Placez les barres de sorte que les bords supérieurs de leurs supports d'angle soient à 1 pouce au-dessous de l'extrémité ouverte des montants et fixés en place en serrant les vis du support d'angle.
6. Glisser les écrous en T des quatre feuilles de polyester rectangulaires dans les canaux sur les barres d'extrusion verticales pour recouvrir les côtés du chambeR et serrer les attaches pour la sécuriser en place.
7. Sélectionnez un côté pour être une porte pour accéder à l'intérieur de la chambre et retirez les deux vis et écrous en T à la couche inférieure de la chambre.
   REMARQUE: Lorsque le cadre est tourné vers le haut, le fond de ce couvercle se détache en bas et peut être soulevé pour accéder à l'intérieur de la chambre.
8. Placez un capuchon en plastique sur l'extrémité supérieure de chaque élément d'angle pour servir de pieds pour le cadre terminé. Tournez le cadre droit vers le haut. Insérez deux supports de panneau par côté à l'intérieur de la couche de base du cadre et tournez-vous pour les fixer en place ( Figure 1B , couche 3). Placez une acrylique transparente de 12 x 12 pouces ² sur les supports du panneau pour fournir une étape pour les plaques de dosage ( Figure 1B , couche 3).

2. Positionnement du modèle de caméra et de scène

1. Téléchargez et installez le logiciel d'acquisition vidéo du caméscope au microscope sur l'ordinateurDu site Web du fabricant.
2. Glissez une caméra de microscope dans chacun des trois étuis de caméra avec l'optique de la caméra orientée vers le stade acrylique et le rétro-éclairage. Connectez les caméras aux ports USB de l'ordinateur. Positionnez le panneau de rétroéclairage de la LED à infrarouge sous le cadre, en vous concentrant sous la scène. Branchez le rétro-éclairage pour allumer.
3. Imprimez les modèles fournis pour la mise en place et l'alignement des plaques sur les feuilles de transparence (voir Fichier supplémentaire ).
   REMARQUE: sur le modèle de placement de solution, le cercle de périmètre de la plaque mesure 3,8 cm de diamètre et le cercle d'intérêt intérieur de l'ordre de 0,9 cm de diamètre.
4. Coupez les lignes de quadrillage pour obtenir des pièces de transparence rectangulaires contenant les gabarits circulaires.
5. Démarrez le logiciel d'acquisition vidéo et cliquez sur les vignettes numérotées en haut de la fenêtre pour afficher les flux des caméras.
6. Ajustez l'alignement et l'agrandissement de la caméra au microscope.
7. Placez un gabarit d'alignement de plaque sous une lentille de caméra de microscope ( Figure 2B ).
8. Changez la distance de travail en glissant verticalement l'étui de l'appareil photo le long de la tige du support de l'appareil photo et ajustez le grossissement de la caméra en tournant la molette de grossissement de la caméra jusqu'à ce que les marqueurs de numéros du modèle soient clairement visibles aux bords du champ de vision de la caméra.
9. Tapez le gabarit d'alignement des plaques au stade acrylique.
10. Placez une assiette d'échantillons de vers sur le modèle d'alignement de la plaque sous la caméra du microscope et affinez encore davantage le grossissement et la distance de travail jusqu'à obtenir une image nette des vers tout en maintenant les marqueurs de numéros dans le champ de vision.
11. Répétez les étapes 2.6.1-2.6.4 pour les deux autres caméras de microscope.

3. Croissance et synchronisation des nématodes

1. Quatre jours avant les expériences, semer vingt-quatre 60 mmPlaques de gélose Nematode Growth Media (NGM) avec 50 μL d'OP50 Escherichia coli dans du bouillon Luria-Bertani (LB) (voir la section 5 pour la recette).
   REMARQUE: Chaque plaque de 60 mm fournira suffisamment de vers pour une plaque de dosage. L'acquisition de six répétitions par traitement ou génotype est recommandée.
2. Laisser sécher les assiettes ensemencées avec les couvercles allumés, la nuit à température ambiante.
3. Le lendemain, transférez quinze hermaphrodites gravides bien nourris sur chaque assiette ensemencée et permettent aux vers de cueillir des œufs pendant six heures. Cela donnera> 360 oeufs par assiette.
4. Après 6 h, retirer les vers provenant des assiettes ensemencées et laisser passer la progéniture pendant trois jours chez les adultes à 20 ° C.

4. Test de préférence chimiosensorielle

1. La veille de l'expérience, préparez des plaques d'essai de gélose NGM de 35 mm.
   1. Préparer 250 ml d'agar NGM (voir la section 5 pour la recette).
   2. Disposez vingt-huit assiettes vides de 35 mm en piles de cinq ou moins sur un montant platRface. Remplir chaque plaque de dosage avec 5 ml d'agar NGM. Laisser les plaques d'essai sécher vers le bas avec les couvercles allumés, pendant la nuit à température ambiante.
      NOTE: En règle générale, préparez une plaque de dosage supplémentaire pour chaque traitement ou génotype à analyser en cas de contingence.
2. Le jour de l'expérience, allumez le rétro-éclairage, démarrez l'ordinateur et lancez le logiciel de capture vidéo de la caméra au microscope.
3. Connectez une caméra au microscope à l'ordinateur et ajustez les paramètres d'enregistrement vidéo.
   1. Cliquez sur la vignette numérotée de la caméra en haut de la fenêtre du logiciel pour afficher la vidéo en direct de la caméra.
   2. Retirez le menu 'Format vidéo' dans le coin supérieur gauche de l'alimentation de l'appareil photo et sélectionnez 'MJPG 1280 x 1024'. Abaissez le menu «Dossier» à côté du menu «Format vidéo» et sélectionnez un dossier dans lequel enregistrer les fichiers vidéo.
   3. Cliquez sur l'icône «Exposition automatique» dans le coin supérieur droit deL'alimentation de la caméra et éteignez l'exposition automatique. Cliquez sur l'icône 'LED' immédiatement à droite de l'icône 'Exposition automatique' pour éteindre les voyants de l'appareil photo intégré au microscope. Cliquez sur l'icône «Paramètres» adjacente: Sélectionnez «Monochrome», maximisez le «Contraste» et réglez «Luminosité» jusqu'à ce que les vers apparaissent distincts de l'arrière-plan.
4. Acquérir des vidéos d'étalonnage.
   1. Alignez un modèle de placement de solution sur un modèle d'alignement de plaque d'étape ( Figure 2A ). Cliquez sur l'icône d'enregistrement «Time-Lapsed Video» sur le côté gauche de l'alimentation de la caméra et entre '5' s pour la durée et '1' pour l'intervalle pour enregistrer une vidéo de 5 s à 1 image / s. Cliquez sur 'Démarrer' pour commencer l'enregistrement vidéo.
5. Répétez les étapes 4.3 et 4.4 pour les deux autres caméras microscopiques.
6. Retirez le modèle de placement de solution de la chambre.
8. Utilisez une pipette en verre de 5 mL pour ajouter 1,2 ml de tampon NGM à une plaque de vers synchronisé et agitez doucement la plaque pour déplacer les vers dans le tampon. Pipettez le tampon de la plaque et déposez les vers dans un tampon dans un tube de microcentrifugeuse propre.
   NOTE: Les vers sont sensibles aux écarts par rapport à leur concentration en sel de gélose cultivée ¹⁴ . Pour minimiser les changements dans la concentration de sel d'agar après le passage du ver, il est conseillé d'utiliser le tampon NGM pour le lavage (voir la section 5 pour la recette). N'utilisez pas de pipettes en plastique pour enlever les vers des plaques, car les vers se colleront sur les côtés. Préparez un nombre équivalent de tubes car le nombre de plaques d'essai doit être exécuté simultanément.
9. Laissez les trois tubes pendant 1-2 minutes pour permettre aux vers de s'installer vers le bas. Utilisez une pointe de pipette en plastique pour éliminer autant de tampon de lavage que possible des tubes sans déranger la pastille d'agrégatVers au bas des tubes. Rechargez les tubes avec 1 mL de tampon NGM propre.
10. Répétez l'étape 4.7.2 une fois.

Ajouter des solutions tampon 10 mM de CuCl ₂ et M13 aux plaques de dosage (voir la section 5 pour les recettes).

1. Tapez un modèle de placement de solution sur le dessus du stade du microscope à dissection.
2. Placez une bande de ruban adhésif double face de chaque côté d'un gabarit d'alignement de plaque. Assurez-vous que la bande se chevauche avec le cercle périmétrique de la plaque mais n'obstrue pas la région d'enregistrement d'intérêt au centre du gabarit.
3. Alignez le périmètre de la plaque de dosage avec le cercle sur le gabarit d'alignement de la plaque et appuyez vers le bas jusqu'à ce que le gabarit adhère au fond de la plaque. Alignez les marqueurs de numéro de modèle de plaque d'essai avec les marqueurs de modèle de solution-placement sur le microscope de dissection.
4. Utilisez une pipette P2 et une pointe en plastique pour placer 1 μL du tampon M13 chacun dans les quadrants 1 et 4 ( 2 chacun dans les quadrants 2 et 3 ( Figure 2A ).
5. Répétez les étapes 4.8.2-4.8.4 pour les deux autres plaques de dosage.

Une fois que la solution a chuté a été complètement absorbée dans la gélose, utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer les vers cachés de chaque tube de microcentrifugeuse dans la plaque de dosage correspondante.

Placez une goutte de vers chacun sur la zone située au-dessus et en dessous de la région traitée circulaire. Pliez un tissu quatre fois et utilisez le bord émoussé pour absorber l'excès de tampon de lavage sur toutes les plaques d'essai.

Disposer immédiatement les trois plaques d'essai sous les caméras de microscope dans la chambre de comportement en alignant les nombres sur les coins du modèle. Attendez 2-3 minutes pour permettre aux vers d'acclimater aux plaques de dosage.
REMARQUE: Assurez-vous que le volet de la porte de la chambre de comportement est fermé avant d'amorcer l'enregistrement vidéo à l'étape suivante.

Répétez les étapes 4.7-4.12 pour la prochaine série de plaques de dosage. Acquérir au moins six répétitions ou deux cycles d'enregistrement pour chaque traitement ou génotype.

5. Préparation des réactifs

1. Préparer l'agar et le tampon NGM.
   1. Dans une bouteille en verre de 1 L, ajouter 1,5 g de chlorure de sodium, 8,5 g d'agar et 1,25 g de peptone. Ajouter 500 ml d'eau distillée et une barre d'agitation sur la bouteille. Autoclave bouteille avec contenu.
   2. Placez la bouteille sur une plaque d'agitation et allumez la fonction d'agitation.
   3. Ajouter en ordre en utilisant une technique stérile: 0,5 ml de cholestérol 5 mg / mL, 0,5 ml de calcium 1 MChlorure, 0,5 ml de sulfate de magnésium 1 M et 12,5 ml de phosphate de potassium 1 M.
   4. Répétez les étapes 5.1.1 à 5.1.2 pour créer un tampon NGM mais laissez l'agar et la peptone à l'étape 5.1.1.
2. Préparez le bouillon LB.
   1. Dans une bouteille en verre de 1 L, ajouter 5 g de tryptone, 2,5 g d'extrait de levure, 2,5 g de chlorure de sodium, 500 ml d'eau distillée et 0,5 ml d'hydroxyde de sodium 1 N. Autoclave bouteille avec contenu.
3. Préparer le tampon M13.
   1. Dans une bouteille en verre de 1 L, ajouter 1,817 g de Tris, 2,922 g de chlorure de sodium, 0,373 g de chlorure de potassium et 500 ml d'eau distillée. Autoclavez la bouteille avec le contenu.
4. Préparer une solution de chlorure de cuivre (CuCl ₂ ).
   1. Peser 0,134 g de CuCl ₂ . Ajouter un soluté à 10 ml de tampon M13 dans un tube en plastique de 15 ml pour obtenir une solution stock de CuCl ₂ 100 mM. Inverser le tube en plastique jusqu'à ce que tout le soluté ait des.
   2. Utilisez une seringue et un filtre à membrane de 0,2 μm pour filtrer purifiez la solution 100 mM de CuCl ₂ dans un tube de plastique propre de 15 ml.
   3. Pour 10 mM solution CuCl _2, ajouter 900 pi de tampon M13 et 100 pi de 100 mM CuCl solution à ₂ actions à un microtube. Inverser le tube de microcentrifugeuse pour bien mélanger.

6. Analyse vidéo

1. Téléchargez Python 3 (https://www.python.org/downloads/) et la bibliothèque du logiciel OpenCV (http://opencv.org/downloads.html).
2. Téléchargez les trois scripts Python pour l'analyse (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   REMARQUE: assurez-vous que tous les fichiers vidéo à utiliser sont au format mp4 avant de continuer.
3. Pour afficher la fonction et les descriptions des paramètres, tapez 'help (entrer le nom de la fonction)' dans la console et appuyez sur Entrée. Par exemple, tapez 'help (calibration)' et appuyez sur Entrée.
4. Exécuter la fonction d'étalonnageAvec des paramètres d'entrée pour définir les régions d'intérêt vidéo (ROI).
   1. Entrez le nom de fichier de la vidéo d'étalonnage prise dans la section 4 pour la variable 'mp4filename'. Incluez les guillemets lors de la saisie du nom de fichier.
   2. Commencez par les valeurs 600 et 360 pour les variables 'Q * x' et 'Q * y'. * Entrez les éléments du quadrant 1 à 4. Commencez par la valeur 310 pour la variable 'rad'. Réglez les valeurs des variables jusqu'à ce que les masques ROI s'alignent avec les contours du quadrant sur le modèle.
   3. Enregistrez le nombre total de pixels dans chaque ROI qui sera imprimé dans la console lors de l'exécution de cette fonction. Saisissez cette valeur pour le paramètre 'ROI_size' dans la fonction preference_index.
5. Exécutez la fonction threshold_constant pour déterminer la constante de seuillage appropriée. Ajustez la valeur "constante" jusqu'à ce que les vers (blanc) puissent être vus clairement et qu'il y ait un bruit minimal de sel et de poivre en arrière-plan (noir).
6. Exécutez la fonction preference_index pour générer une feuille de données csv, l'index de préférence de la vidéo et le tracé d'occupation du ver.
   1. Utilisez les valeurs «Q * x», «Q * y», «rad», «ROI_size» et «constante» déterminées à partir des étapes 6.4 et 6.5 comme paramètres d'entrée pour la fonction preference_index.
      REMARQUE: pour chaque image vidéo, la fonction preference_index compte le nombre de pixels sans fin dans chaque ROI et calcule le pourcentage de pixels sans vis du nombre total de pixels ROI. La fonction génère alors une valeur d'index de préférence pour chaque image vidéo en utilisant la formule:
      
      REMARQUE: Une fois que le programme a analysé toutes les images de la vidéo, une valeur d'indice de préférence moyenne est générée pour la vidéo. Un parcours d'occupation des vers avec l'index de préférence de la vidéo imprimé en haut ainsi qu'une fiche technique csv contenantLe pixel de ver, le pourcentage de valeurs d'occupation des vers, et l'index de préférence pour chaque image vidéo sera sauvegardé dans le dossier désigné une fois le programme terminé.

Résultats

La figure 3A montre les valeurs d'indice de préférence obtenues pour différents types de génotypes et d'appariements de traitement. Une valeur d'indice de préférence de 1 indique une forte attraction pour la solution placée dans le ROI expérimental alors qu'une valeur d'indice de préférence de -1 indique une forte répulsion. Un indice de préférence de 0,02 a été obtenu lorsque la solution tampon M13 a été placée à la fois dans les ROI de contrôle et expérimental, ce qui démontre qu'il n'y a pas de biais spatial vers un ROI. Les vers N2 ont fortement évité les ions de cuivre, ce qui donne un indice de préférence de -0,67, ce qui confirme les constatations antérieures selon lesquelles les ions de cuivre sont fortement répulsifs ( film supplémentaire 1 ) ⁴ . Les mutants osm-3 , qui ne présentent pas une formation adéquate des segments distal des cils sensoriels, ont montré une diminution significative de l'élimination des ions de cuivre (PI = -0,19) ¹⁵ . Ocr-2 mutants, qui sont les Dans de nombreuses réponses nociceptives médiées par ASH, y compris l'évitement du cuivre, présentent également une diminution significative de l'évitement et même une légère attraction pour les ions de cuivre (PI = 0,19) ( film supplémentaire 2 ) ¹⁶ .

La figure 3B montre des parcelles représentatives d'occupation des vers, qui indiquent la densité des vers dans le contrôle par rapport aux ROI expérimentaux dans le temps dans chaque vidéo. Plus la couleur de la zone de traçage est sombre, plus le nombre de pixels de ver dans le ROI est grand. Le tracé d'occupation pour les vers N2 traités avec le contrôle tampon M13 montre que le nombre de vers dans les deux ROI reste similaire tout au long de l'essai. Cependant, le parcours d'occupation pour les vers N2 traités avec des ions de cuivre indique que les vers répandent fortement et systématiquement le ROI expérimental tout au long de l'analyse.

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Figure 1: Représentation photographique et schématique de la conception de la chambre de comportement. ( A ) Vue de face de la configuration de la chambre de comportement (gauche) et de la représentation schématique correspondante du cadre de la chambre (à droite). Les feuilles de polyester opaques enferment la chambre sur toutes les faces sauf la face inférieure, ce qui permet de passer la lumière à partir du panneau de contre-jour infrarouge. Les nombres 1, 2 et 3 correspondent aux couches d'extrusion dans (B). ( B ) Schéma de la vue de dessus des couches d'extrusion comprenant le cadre de chambre de comportement. Cela comprend la couche supérieure (1), la couche d'assemblage de la caméra du milieu (2) et la couche du niveau inférieur (3). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Modélisation de la solution et modèles d'alignement des plaques. ( A ) Le modèle de solution-placement comporte quatre marqueurs d'alignement de quadrants et de nombres. La solution de contrôle est placée dans les quadrants supérieur gauche et inférieur droit tandis que la solution expérimentale est placée dans les quadrants supérieur droit et inférieur gauche. ( B ) Le modèle d'alignement de plaque ne comporte que des marqueurs d'alignement de nombres pour minimiser l'occlusion des vers dans le champ de vision lors de l'enregistrement et de l'analyse vidéo. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Exemple de données recueillies à l'aide de cet essai. ( A ) Valeurs de l'indice de préférence (PI) pour N2 de type sauvage et C. elegans mutant M> en réponse au tampon M13 et à 10 mM de CuCl ₂ . Les vers N2 n'ont pas montré de préférence entre le contrôle et les ROI expérimentaux lorsque la solution de contrôle M13 a été placée dans les deux ROI mais a fortement évité le ROI expérimental lorsque des ions de cuivre ont été placés (PI = 0,02 et -0,67, respectivement). Les mutants osm-3 (p802) et les mutants ocr-2 (ak47) ont montré une diminution significative de l'évitement des ions de cuivre par rapport à N2 (PI = -0,1 et 0,2, respectivement). N = 6 analyses pour chaque couple génotype-traitement,> 360 vers par analyse, les barres d'erreur indiquent ± 1 SEM, *** p <0,001, ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test post-hoc Tukey Honestly Distributor (HSD). ( B ) Les parcelles d'occupation de vers visuelles représentatives pour les vers N2 avec tampon M13 dans les ROI (en haut) et les vers N2 avec tampon M13 dans le ROI de contrôle et les ions de cuivre dans le ROI expérimental (en bas). L'échelle de couleurs sous chaque parcelle d'occupation représente le nombre de pixels sans fin.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Film supplémentaire 1: Réponse comportementale des vers N2 à 10 mM de chlorure de cuivre. Les vers sont attirés par les quadrants de contrôle avec le tampon M13 (supérieur gauche et inférieur droit) mais évitent fortement les quadrants contenant des ions de cuivre dissous dans le tampon M13 (en haut à droite et en bas à gauche). La vidéo a été enregistrée à 1 image par seconde et a accéléré 15x. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 2: Réponse comportementale de ocr-2 (ak47) vers à 10 mM de chlorure de cuivre. Les vers se déplacent à peu près dans les deux rangs de contrôle avec le tampon M13 (supérieur gauche et inférieur droit) et le quadrantS contenant des ions de cuivre dissous dans le tampon M13 (en haut à droite et en bas à gauche) tout au long de la durée d'enregistrement. Les mutants présentent une légère préférence pour les quadrants contenant des ions de cuivre au début de l'enregistrement. La vidéo a été enregistrée à 1 image par seconde et a accéléré 15x. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire: Modèles de placement de solution et d'alignement de plaques. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Une étape critique dans le protocole est de s'assurer que les plaques de dosage ont un niveau de sécheresse constant pendant les différents jours expérimentaux. Différents niveaux de dessèchement entraîneront différents taux de diffusion de la solution dans la gélose et, par conséquent, des variations dans les résultats comportementaux. Ainsi, les plaques de dosage devraient toujours être fraîches l'après-midi avant les expériences. Le nombre de vers testés par dosage devrait également être réglé pour faciliter la comparaison entre les traitements. Pour référence, un ver de type sauvage établit 4-10 oeufs / h en moyenne donnant 360 vers par analyse si le protocole de synchronisation de ver ci-dessus est suivi ¹⁷ . Si certaines souches mutantes sont endommagées par les œufs, choisissez plus de vers adulte gravide pour la ponte pour atteindre le nombre cible de progéniture. Une autre étape importante dans le protocole est de gérer les vers doucement pendant le processus de lavage et le passage du ver. Les vers sont sensibles aux stimuli mécaniques, qui provoquent des réponses au stress S inversions et inhibition de la ponte ¹⁸ . En outre, il faut prendre soin de définir le ROI avec précision et de déterminer la valeur constante de seuil optimale pour des conditions d'éclairage spécifiques avant de procéder à l'analyse vidéo. Il est également recommandé que les processus d'étalonnage et de seuillage soient répétés si une longue période de temps s'est écoulée depuis la dernière expérience.

Une limitation de cette méthode est qu'il n'est pas approprié pour le dosage de petites populations de vis sans fin. Cependant, si les contrôles appropriés pour déterminer l'influence de la présence de nourriture sur le comportement sensoriel sont effectués, l'utilisation de nourriture pour restreindre l'emplacement exploratoire spatial des vers, comme dans le test de rétention est également possible avec cette configuration. En outre, cette méthode n'est pas destinée à étudier la navigation par gradient de stimulation en raison de la proximité et de petites quantités de gouttes de contrôle et de solution expérimentale utilisées.

E_content "> À l'avenir, le logiciel de programmation qui permet le suivi des absences multiples et l'extraction des fonctionnalités à un seul défaut peut être intégré dans ce système ^{19 , 20. L'} enregistrement de paramètres de comportement subtiles du comportement de ver unique comme les vitesses d'inversion et l'amplitude des courbes corporelles fournira Une image plus détaillée du comportement chimiosensoriel d'un ver individuel dans le contexte d'un dosage basé sur la population. Le dosage peut également être modifié pour étudier l'habituation par des trous de forage à travers le ROI à l'aide d'aiguilles de seringues avec la taille appropriée et remplissant les trous avec de l'agar Avec le composé expérimental ou le tampon de contrôle. Cela assurera une concentration superficielle plus constante du composé sur une période de temps d'enregistrement plus longue, comme cela est nécessaire pendant les études d'habitude. Une autre application possible de cette méthode est de mener des études de comportement comparatives chez différentes espèces de nématodes. De plus, la chambre de comportementPeut être modifié de multiples façons d'étudier les réponses comportementales aux stimuli multimodaux. Pour les applications opto-génétiques, des tableaux LED à haute intensité peuvent être attachés à côté de la monture de la caméra pour activer sélectivement les neurones d'intérêt pendant l'essai. Les éléments de chauffage, les systèmes de refroidissement et les capteurs de température peuvent également être ajoutés à la configuration pour étudier les effets de la température sur les comportements sensoriels. En outre, des systèmes de distribution d'odeurs peuvent être installés à l'intérieur de la chambre pour étudier les interactions entre les modalités odéronégatives et chimiosensorielles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Extrusions de charpente en aluminium à rainures en T	McMaster-Carr	47065T101	Profil simple, taille 1 », plein
Supports	McMaster-Carr	47065T236	1 » de long pour extrusions à profil unique de 1 » de haut Fixations
compactes à alimentation en bout	McMaster-Carr	47065T139	1 » (simple), paquet de 4
supports de panneaux pleins à visser	McMaster-Carr	47065T251	Pour
embouts en plastique	McMaster-Carr	47065T91	de haut
Feuille d’acrylique coulée optiquement transparente	McMaster-Carr	8560K211	3/16 » d’épaisseur, 12 » x 12
Tissu de polyester enduit de vinyle	McMaster-Carr	88505K57	0,027 » d’épaisseur, 61 » de largeur,
noir Œillets	en laitonMcMaster-Carr	9604K22	Taille commerciale 0, 0,545 » diamètre extérieur
Rondelles en acier	McMaster-Carr	90107A029	Vis 1/4 »
Vis à tête arrondie	McMaster-Carr	90272A546	1/4 » - 20 filetage, 1 - 1/2 » de long
Rétroéclairage de fonctionnement standard	Lumières Smart Vision	Voir le fournisseur local	8 » x 8 », infrarouge 850 nm
IVP-C1 Pot à commande variable	Smart Vision Lights	Voir le fournisseur
T1 Power	Supply Smart Vision Lights	Voir le fournisseur
Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite Digital Microscope	Voir le fournisseur
MS09B microscope	Dino-Lite Digital Microscope	Voir le fournisseur local