In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana

Résumé

Ce manuscrit décrit une in vitro ovule méthode de culture qui permet l’imagerie de cellules vivantes des Arabidopsis zygotes et des embryons. Cette méthode est utilisée pour visualiser la dynamique intracellulaire au cours de la polarisation du zygote et la spécification des cellules sort dans le développement des embryons.

Résumé

Dans la plupart des usines fleurissantes, le zygote et les embryons sont cachés profondément dans les tissus de la mère, et donc il a longtemps été un mystère de comment ils se développent dynamiquement ; par exemple, comment le zygote se polarise à établir l’axe du corps et comment l’embryon spécifie divers destins cellulaires au cours de la formation des organes. Ce manuscrit décrit une méthode in vitro ovule culture pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes du développement des zygotes et des embryons d’Arabidopsis thaliana. Le milieu de culture optimisé permet de zygotes ou jeunes embryons d’évoluer vers des plantes fertiles. En le combinant avec un dispositif de tableau de micropillar de poly(dimethylsiloxane) (PDMS), l’ovule se tient dans le milieu liquide dans la même position. Cette fixation est cruciale d’observer l’ovule même sous un microscope pour plusieurs jours de la division zygotique à la fin du stade embryonnaire. L’imagerie de cellules vivantes qui en résulte peut être utilisé pour surveiller la dynamique en temps réel de la polarisation du zygote, tels que la migration nucléaire et réarrangement du cytosquelette et aussi le calendrier de la division cellulaire et la spécification sort des cellules au cours de la structuration de l’embryon. En outre, ce système de culture ovule peut être combiné avec des traitements d’inhibiteur pour analyser les effets de divers facteurs sur le développement de l’embryon et avec les manipulations optiques telles que des perturbations de laser d’examiner le rôle de la communication de cellule-cellule.

Introduction

Le plan de base du corps d’un organisme se développe à partir un zygote unicellulaire. Dans la plupart des usines fleurissantes, division zygotique génère une apicale et un baso-cellulaire, qui se développent dans les pousses et des racines, respectivement¹. Par conséquent, il est important de comprendre comment le corps de la plante est formé au cours de l’embryogenèse, mais il n’a pas été un outil efficace d’observer directement la dynamique de vie zygotes et des embryons parce qu’ils développent profondément dans la fleur. Chez plusieurs espèces de monocotylédones, telles que le maïs et le riz, une méthode de fécondation in vitro a ....

Protocole

1. préparation du milieu de Culture In Vitro Ovule

1. faire le milieu liquide pour l’in vitro culture ovule (" N5T moyenne ") contenant 1 x Nitsch basale mélange de sel, 5 % (p/v) dihydrate de tréhalose, 0,05 % (p/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acide (MES)-KOH (pH 5,8) et 1 x Gamborg ' solution de vitamines de s.
2. Ajuster le pH à 5,8 avec KOH.
3. Stériliser le milieu autoclavage (121 ° C, 20 min) ou filtrer à travers un filtre de 0,22 µm.
   Remarque : Le milieu stérilisé peut être stocké à 4 ° C pendant 2 à 3 mois.

2. Préparation de l’appareil tableau de PDMS Micropillar

Résultats

Grâce à ce système de culture ovule, cette méthode peut suivre la dynamique de la vie de polarisation du zygote et de structuration de l’embryon. Il s’agit d’une réalisation parce qu’auparavant il n’y avait aucune technique pour visualiser le comportement en temps réel le zygote et de l’embryon, qui sont cachés profondément dans les tissus de la mère. Figure 3 a et supplémentaire 1 vidéo montrent que les microtubules (MTs) dans le zygote jeun.......

Discussion

Ce manuscrit présente un simple in vitro ovule culture protocole qui est efficace pour une utilisation dans l’imagerie de cellules vivantes du développement des zygotes et des embryons.

La conception de l’appareil PDMS peut être nécessaire d’optimisation en fonction du stade de l’embryon. Le premier appareil développé était un tableau de microcage pour régler l’orientation et de fixer la position des ovules⁹, et ensuite un dispositif de micropillar a été constr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nitsch mélange de sels de base	Duchefa	N0223
tréhalose dihydraté	Wako Pure Chemical	206-18455
MES	Dojindo	345-01625
Gamborg' solution vitaminique	Sigma-Aldrich	G1019
Plat à fond en verre de 35 mm	Matsunami Plat	en verre D111300
de 35 mm	Corning	430588
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
76 × ; 26 mm verre diapositive	Matsunami Glass	S1225
18 × ; verre diapositive 18 mm	Matsunami Aiguille	C018181
(calibre 0,40 mm)	Terumo	NN-2719S
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
A1R MP	Nikon	A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF
CSU-W1	Yokogawa Electric		Il s’agit d’un équipement personnalisé, et donc le numéro de catalogue n’est pas disponible.
CV1000	Yokogawa Electrique	CV1000-SP84

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