Article de méthode

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

DOI :

10.3791/55982

⸱

4 octobre 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la fabrication de microcryogels élastique macroporeux 3D en intégrant la microfabrication avec la technologie cryogelation. Lorsqu’il se charge avec des cellules, microtissues 3D sont générés, qui peut être facilement injecté in vivo pour faciliter la thérapie régénérative ou assemblés dans des tableaux pour in vitro le dépistage des drogues de haut débit.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour mettre à niveau de culture cellulaire 2D traditionnel pour la culture cellulaire 3D, nous avons intégré microfabrication avec technologie cryogelation pour produire macroporeux microscale criogels (microcryogels), qui peuvent être chargés avec une variété de types de cellules pour former des microtissues 3D. Ici, nous présentons le protocole pour fabriquer polyvalent microtissues 3D et leurs applications en thérapie régénératrice et de dépistage des drogues. Taille et forme contrôlable microcryogels peuvent être fabriqués sur une puce de tableau, qui peut être récoltée hors puce comme individuels transporteurs chargés en cellule pour la thérapie régénérative injectable ou être plus assemblé sur puce en tableaux micro-culture 3D à haut débit dépistage des drogues. En raison de la nature élastique haute de ces criogels a petite Echelle, les 3D microtissues pièce grande injectabilité de thérapie cellulaire mini-invasive en protégeant les cellules de la force de cisaillement mécanique pendant l’injection. Cela garantit la survie cellulaire accrue et un effet thérapeutique chez la souris limb ischémie. Pendant ce temps, assemblage des matrices 3D micro-culture dans un format standard de multi-384 puits facilite l’utilisation de laboratoires communs et l’équipement, permettant à haut débit drug screening sur cette plate-forme de culture cellulaire 3D polyvalent.

Introduction

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La culture cellulaire traditionnel sur aplatie à deux dimensions (2D) des surfaces comme une boîte de Petri ou plaques multipuits, peut susciter guère les comportements de cellule à proximité de leurs États indigènes. Précise récapitulation des micro-environnements cellulaires natives, qui comprennent des divers types de cellules, matrices extracellulaires et bioactifs facteurs solubles dans des architectures en trois dimensions (3D)1,2,3 ,4, il est essentiel de construire biomimicking tissus in vitro pour des applications en médecine de génie, régénératrice tissulaire, biologie fondamentale recherche et drogue découverte5,6,7 ,8,9.

Au lieu de la culture de cellules 2D, culture cellulaire 3D est employé couramment pour faire avancer la biomimétique micro-architecturales et des caractéristiques fonctionnelles des cellules cultivées in vitro. Une méthode de culture cellulaire 3D populaire est aux cellules agrégées en sphéroïdes7,8,9,10. Sphéroïdes cellulaires pourraient être injectés à des tissus lésés avec rétention cellulaire améliorée et la survie en comparaison de l’injection de cellules dispersées. Toutefois, tailles de sphéroïde non uniforme et une lésion mécanique inévitable imposée sur des cellules par la force de cisaillement fluide pendant l’injection de conduisent à cellule pauvres effets thérapeutiques11,12,13. De même, la non-uniformité inhérente au cours de l’agrégation des sphéroïdes a fait sa traduction à base de cellules 3D haut débit médicament dépistage difficile10.

Une autre méthode pour la culture cellulaire 3D est réalisée avec l’aide de biomatériaux, qui généralement encapsule les cellules d’hydrogels aqueux ou échafaudages poreux. Il permet une plus grande marge de manœuvre dans la construction d’architectures 3D. Pour la thérapie, les cellules encapsulées dans les échafaudages en vrac sont généralement livrées à corps animal par implantation chirurgicale, qui est envahissant et traumatique, limitant par conséquent sa traduction large au chevet du patient. En revanche, hydrogels aqueuses permettent la thérapie mini-invasive en injectant des cellules en suspension dans la solution de précurseur d’hydrogel dans des organes animaux, permettant en situ gélification par thermo-, réticulation chimique ou enzymatique11. Cependant, comme les cellules sont livrées tandis que les précurseurs de l’hydrogel sont encore dans un État aqueux, ils sont également exposés à cisaillement mécanique pendant l’injection. Non seulement cela, réticulation chimique ou enzymatique au cours in situ la gélification de l’hydrogel pourrait aussi imposer des dommages aux cellules à l’intérieur. Pour le dépistage des drogues, des cultures de cellules de biomatériau assistée rencontrent des difficultés uniformité, de débit et de contrôlabilité. Utilisent de l’hydrogel, cellules sont généralement impliqués au cours de la gélification, par laquelle le processus peut affecter de fonction et la viabilité cellulaire. Gélification au cours de l’ensemencement de la cellule entrave également l’utilisation par la plupart des équipements haut débit, car l’hydrogel peut doivent rester sur la glace pour empêcher la gélification avant l’ensemencement de cellule, et l’hydrogel peut se coincent conseils de distribution, qui sont généralement très minces pour assurer l’exactitude des criblage à haut débit. Échafaudages préformés pourraient séparer potentiellement des procédures de fabrication biomatériau de culture cellulaire, mais la plupart produits axés sur l’échafaudage sont disponibles en vrac avec relativement plus faible débit14.

Pour surmonter certains des inconvénients des méthodes de culture 3D actuelles, nous avons développé une technologie de microfabrication-cryogelation intégré pour fabriquer un tableau de microcryogel standard et convivial puce15. Dans ce protocole, la gélatine est sélectionnée pour illustrer la technique de fabrication de microcryogel car il est biocompatible, dégradable et rentable, et aucune modification supplémentaire n’est nécessaire pour la fixation des cellules. Autres polymères de sources naturelles ou synthétiques pourraient également être utilisés pour la fabrication, selon l’application. Grâce à cette technologie, nous pouvons fabriquer microcryogels miniaturisée et très élastique avec mise en page, la forme et la taille contrôlable. Lors du chargement d’une variété de types de cellules, microtissues 3D pourrait être formé pour diverses applications. Ces caractéristiques uniques permettent d’injectabilité désirée, de la protection des cellules et de rétention dirigée après injection en vivo pour des effets thérapeutiques. Non seulement cela, les microcryogels pourraient être traitées ultérieurement pour former des tableaux micro-culture 3D compatibles avec les équipements communs de laboratoire et instruments pour réaliser la culture de cellules de haut débit pour le dépistage des drogues polyvalent et autres analyses cellulaires. Ici, nous allons détailler le processus de fabrication de microcryogels et son post traitement individuel microtissues 3D ou 3D micro-culture tableaux pour deux applications importantes, de thérapie cellulaire et de dépistage des drogues, respectivement10,15 .

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Protocole

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l’expérimentation animale suivi strict protocole approuvé par le Comité d’éthique animale sur le centre d’analyse biomédicale, Université de Tsinghua. En vertu de l’approbation du Comité d’éthique, le tissu adipeux humain a été obtenu du département de chirurgie plastique de Peking Union Hospital avec le consentement éclairé des patients.

1. fabrication de 3D Microcryogels

  1. conception et la fabrication de puces de tableau de microstencil
    1. utiliser un logiciel commercial à des tableaux de conception de géométries spécifiques, tels que les cercles, ellipses, triangles ou trèfles à 14, selon la demande ultérieure.
      Remarque : Reportez-vous à l’article 2 du protocole pour la médecine régénérative et de l’article 3 du protocole de dépistage des drogues pour plus de détails de conception.
    2. Importer la conception dans le logiciel livré avec la machine de gravure laser de gravure au laser. En utilisant les paramètres laser conformément aux recommandations de l’usine pour la machine de gravure laser, laser-graver le motif importé sur Poly (Méthyméthacrylat) (PMMA) feuilles.
    3. Laver les microstencil tableau puces avec de l’eau déminéralisée pour nettoyer les débris de la gravure laser. Sec le tableau microstencil puces à 60 ° C. magasin dans un sac scellé à température ambiante pendant des mois.
  2. Fabrication de puces de tableau de microcryogel
    1. microstencil 4 Place tableau sculpté sur le plateau de l’échantillon et introduire dans le plasma nettoyeur. Fermer la porte de l’appareil et tourner sur la pompe à vide pendant 2 min, puis allumez la puissance RF (18 W) pour traiter les puces de tableau de microstencil dans le plasma nettoyant pendant 3 min à température ambiante pour augmenter hydrophilicité.
    2. Ajouter 0,06 g de gélatine à 1 mL d’eau désionisée pour former 6 % (wt/vol) solution de précurseur gélatine (assez pour faire les 5 jetons). Chaude à 60 ° C dans un bain d’eau pour dissoudre correctement. Incuber sur glace pendant 5 min.
    3. Ajouter 3 µL de glutaraldéhyde dans la solution de précurseur de gélatine pour une concentration finale de 0,3 %. Mélanger soigneusement.
    4. Pipette 200 µL de solution de précurseur au glutaraldéhyde sur l’extrados de la puce de tableau de microstencil.
      NOTE : 200 µL est suffisant pour une puce de 75 × 25 mm indépendamment de conception. Surface de la puce est augmentée augmente le montant proportionnellement.
    5. Manuellement répartir la solution sur la puce en grattant le dos et vient avec une tige de verre courbé à 2 à 3 fois.
      NOTE : Chaque micro-puits sur la puce de microstencil peut être rempli de solution de précurseur en raison de leur nature hydrophile après traitement plasma.
    6. Placer immédiatement la puce tableau rempli de solution-précurseur dans un congélateur à-20 ° C pendant 16 h pour les cryogelation.
    7. Régler le lyophilisateur à-40 ° C pendant 30 min. Placer les jetons de tableau après cryogelation dans le lyophilisateur et lyophiliser les puces tableau pendant 2 h dans le vide.
      Remarque : Microcryogels de gélatine avec des macropores interconnectés se forment parce que la glace s’est formée au cours de la cryogelation sublimes dans le lyophilisateur.
    8. Passez à la section 2 pour le traitement de l’ischémie des membres critiques (CLI) et l’article 3 pour le dépistage de drogue de haut débit.

2. Récolte des Microcryogels individuels à Microtissues 3D forme Injectable pour le traitement de la CLI

  1. récolte microcryogels individuel
    1. Design tableaux (75 × 25 mm) de 600 cercles, chacun avec 400 µm de diamètre, en logiciels commerciaux pour injectable micro-culture 3D construction. Utilisez le PMMA de 300 µm d’épaisseur pour la fabrication de microstencil tableau puce comme indiqué au point 1.1.
    2. Fabriquer des puces tableau microcryogel qu’à l’article 1.2.
    3. Fabriquer un tableau de PDMS goupille d’éjection avec le même design que dans l’étape 2.1.1 par Lithographie douce standard 16 , 17.
    4. De superposition la puce de tableau de microcryogel sur le dessus du tableau de la goupille d’éjection de PDMS, alignant chaque microcryogel avec une goupille d’éjection sur le tableau. Appuyez sur la puce de tableau de microcryogel vers le tableau de broche éjecteur pour pousser la microcryogels hors les puits avec les broches qui dépasse sur la baie de broche PDMS éjecteur de récolter individuels microcryogels.
    5. Récolter la microcryogel dans l’eau et à leur rassemblement à l’aide de tamis cellulaire. Une crépine d’aspiration permet de recueillir les microcryogels d’une seule puce (c.-à-d., 600 microcryogels).
    6. Microcryogels de lavage avec 0,1 M NaBH 4 sur la glace pendant 20 min étancher tout résidu d’aldéhyde réticulé. Utiliser 5 mL de 0.1 M NaBH 4 par puce. Jetez NaBH 4 et laver avec 5 mL d’eau désionisée pendant 3 à 5 fois, 15 minutes chaque fois.
    7. Jeter l’eau de la crépine de la cellule et rassembler microcryogels dans un seul cluster par tamis cellulaire et placer un bouquet dans un plat de Pétri de 35 mm à l’aide d’une pince courbe. Ajouter 50-70 µL désionisée à chaque groupe de l’eau et couvrir le couvercle de la boîte de Pétri. Tapoter le plat de Pétri sur la table pour égaliser tous les microcryogels, ce qu’aucun microcryogels ne reposent sur le dessus une autre microcryogel pour former une monocouche de microcryogels sur la surface de la boîte de Pétri.
    8. Geler la microcryogels récolté à-20 ° C pendant 4 à 16 h avant de les déposer pour 2 h (voir étape 1.2.7). Conserver microcryogels sous vide à température ambiante jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  2. Characterization of microcryogels
    1. évaluer les pores de la microcryogels en analysant l’imagerie microscopie électronique (SEM).
      1. Immobiliser la microcryogels récoltés et lyophilisées sur un porte-échantillon de ruban adhésif double-face et manteau d’or avec une coucheuse par pulvérisation cathodique pour 90 s, avant de l’imagerie par SEM 11. Évaluer et analyser la distribution des diamètres de pores dans la microcryogel de sept différentes images de SEM à l’aide de logiciels d’analyse image.
    2. Peser un bouquet de 600 microcryogels lyophilisées dans un plat de Pétri de 35 mm pour le poids de gélatine séchées microcryogels (GMs). Ajouter de la grappe de microcryogels lyophilisé 60 µL d’eau désionisée eau et attendre 30 s pour microcryogels pleinement absorber l’eau et gonflent. Peser les microcryogels gonflées. Ratio de gonflement
      1. déterminer l’équilibre et la porosité des microcryogels, comme le rapport du poids du microcryogels gonflées à celui de la gélatine séchées microcryogels et le ratio du poids de l’eau qui s’est tenue en microcryogels à celle de microcryogels hydraté, respectivement 13.
    3. Injectabilité de mesure de microcryogels à l’aide d’un pousse-seringue programmable intégré avec une force numérique de calibre 14.
      1. Tache 600 morceaux de microcryogels de Trypan blue et suspendre dans 600 µL de solution de gélatine 15 % pour atteindre une répartition homogène. Charger la suspension microcryogel 1 mL dans la seringue de 1 mL. Injecter le mélange à travers une aiguille de calibre 27 attachée à la seringue de 1 mL à l’aide d’un pousse-seringue programmable au débit de 1 mL/min.
      2. Injection en temps réel de moniteur de force par la force numérique/po² essais et tracer la courbe force-temps. Après injection, respecter l’intégrité des microcryogels sous un microscope.
        NOTE : GMs suspendus dans une solution de gélatine de 15 % (wt/vol) peuvent être facilement injectés et est demeurées intactes après l’injection.
    4. Caractérisent la dégradabilité de microcryogels.
      1. Tout d’abord, mesurer le poids d’un groupe de 600 microcryogels lyophilisés dans une boîte de Petri 35 mm comme le poids sec. Ensuite, plonger 600 microcryogels lyophilisés dans 2 mL 0.025 % (vol/vol) la trypsine/EDTA.
        2. Microcryogels
      2. à frais virés de la solution en utilisant un tamis cellulaire à des moments différents (p. ex., 10, 20, 30, 40, 50, 60 et 70 min). Mèche solution away excédent avec un mouchoir. Mesurer le poids des microcryogels à différents moments et de calculer le degré de dégradation, comme le rapport du poids du microcryogel à un certain moment à celle de microcryogel au temps zéro.
  3. Auto-chargement de cellules en microcryogels à la forme 3D microtissues
    1. microcryogels from step 2.1.8 de système de stérilisation oxyde d’éthylène avec exposition de gaz de 12 h, suivie de 12 h de dégazage sous vac de stériliserUUM.
    2. Choisir humaines dérivées adipeux stromales cellules mésenchymateuses (CSM) pour le traitement de souris ischémique membre postérieur. Les cellules souche par suite des procédures comme indiqué précédemment 18.
    3. Culture CSM dans la croissance moyenne contenant 2 % sérum fœtal (SVF), ng/mL 10 bb de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-bb), 1 X sélénium de la transferrine de l’insuline (ITS), 10 facteur de croissance épidermique (EGF) ng/mL, 10 -8 M dexaméthasone, 10 -4 M 2-phosphate de l’acide ascorbique, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine en DMEM/F12. Le passage des cellules selon le ratio de 1:3 lorsque confluentes. Utiliser des cellules de passage de 3 à 5 dans les expériences suivantes.
    4. Récolter CSM avec de la trypsine et de quantifier le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de Fuchs-Rosenthal et de remettre en suspension à une densité de 8 x 10 6 cellules/mL dans le milieu de croissance CSM.
    5. Pipette 60 µL de la suspension CSM sur la monocouche de 600 microcryogels avec diamètre de 400 µm dans un plat de 35 mm de section 2.1. Les cellules sont automatiquement absorbés dans les structures de micro-poreuses de le microcryogels.
    6. Maintenir dans une chambre humidifiée et incuber à 37 ° C pendant 2 h permettre aux cellules d’attacher. Après 2 h d’incubation, ajouter 2 mL de milieu de culture. Changer le milieu tous les 2 jours. Culture microcryogels CSM-chargé pendant 2 jours former microtissues 3D.
    7. Après 2 jours de culture, Pipetter 100 microcryogels CSM-chargé par puits sur une plaque à 96 puits, ajoutez 120 µL de solution de travail de résazurine préparée selon le fabricant ' instruction s dans chaque puits. Incuber pendant 2 h à 37 ° C.
      1. Détecter la fluorescence de résazurine métabolisé par les cellules viables dans un lecteur de microplaques avec une longueur d’onde légère excitation d’onde de lumière 560 nm et d’émission de 590 nm. Tracer une courbe d’étalonnage du nombre de cellules par rapport à fluorescence à l’aide de CSM pour interpoler le nombre de cellules de l’intensité de la fluorescence pour l’expérience future selon le kit protocole 13.
    8. Évaluer le nombre de CSM dans microcryogels du jour 0 au jour 4 à l’aide de résazurine tel que décrit dans l’étape 2.3.7 du jour 0 au jour 4.
    9. Cellules en microcryogels avec la dilution 1/500 de calcéine AM et une dilution de 1/250 de l’iodure de Propidium (appelé live/dead coloration) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et d’observer sous microscope à fluorescence ou microscope confocal fluorescence.
  4. Injection de microtissues 3D in vivo pour le traitement du CLI dans le modèle de souris
    1. établir une ischémie critique membre postérieur de souris nus femelles BALB/c comme signalé 11 , 19 pour déterminer l’effet thérapeutique de la thérapie axée sur la micro-culture 3D.
    2. Transférer la microtissues de l’étape 2.3.6 à l’aide d’une pipette de 5 mL dans une crépine de cellule et filtrer loin du milieu de culture.
    3. Remettre en suspension le microtissues 3D CSM chargés dans une solution de gélatine de 15 %, à une densité de 100 microcryogels par 100 µL de solution de.
    4. Avant la chirurgie, stériliser les instruments chirurgicaux par autoclave et pratiquer une intervention chirurgicale dans une salle d’exploitation animale dans un centre d’installation Animal.
    5. Placer la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie contenant 1-3 % isoflurane dans 100 % d’oxygène à un débit de 1 L/min. érythromycine appliquer sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement. Par une incision de la peau de 1 cm de long, ligaturer l’artère fémorale et ses branches avec 5-10 sutures en soie et d’accise 19.
    6. Inject vert d’indocyanine (ICG) (0,1 mL de 100 µg/mL) par l’intermédiaire de la veine caudale injection à contrôler le flux de sang. Effectuer l’imagerie de fluorescence ICG en utilisant une fluorescence système d’imagerie (ici, système maison) dans la géométrie de réflectance 11.
    7. D’injecter par voie intramusculaire microtissues dans trois sites du muscle gracilis autour de l’incision de l’artère à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 23.
    8. Après l’opération, garder la souris chaude avec un coussin chauffant dans la cage de récupération. Injecter par voie sous-cutanée meloxicam pour soulager la douleur et de surveiller en continu jusqu'à éveillé.
    9. Après 28 jours, suivi de l’efficacité thérapeutique du membre de traités micro-culture 3D par fluorescence imaging 11.
      Remarque : Injecter par voie sous-cutanée meloxicam pour soulager la douleur quand la souris a montré l’amputation d’un membre spontanée.
    10. Souris euthanasier au dioxyde de carbone issue des expériences.
      NOTE : Ici, l’euthanasie avec le dioxyde de carbone a été effectuée selon un protocole strict approuvé par le Comité d’éthique animale sur le centre d’analyse biomédicale, Université de Tsinghua.

3. Montage de puce tableau micro-culture pour High-throughput Screening de drogue

  1. montage du tableau de microcryogel pour la culture cellulaire sur puce
    1. modifier la conception dans la section 1.1 selon dimensions plaque multipuits conventionnel, c'est-à-dire, pour le format multi-384 puits, concevoir un tableau de 16 × 24 puits (ligne par colonne), chacune de 2 mm de diamètre et 4,5 mm--entraxe.
    2. Laser graver sur une plaque PMMA épaisseur 500 µm, tel que décrit à la section 1.1.
      3. Microcryogels
    3. fabriquer comme décrit dans la section 1.2 utilisant de que la puce multi-384 puits tableau obtenue étape 3.1.2. Cette baie contenant du microcryogel est désignée comme la puce de tableau de microcryogel.
    4. Laver la puce de tableau microcryogel avec 50 mL de NaBH 0,1 M 4 pour étancher une aldéhyde résiduelle réticulé, à plusieurs reprises rincer ensuite avec 50 mL d’eau désionisée pendant 2 h 3 fois, chaque fois que.
    5. Jeter l’eau, de geler la puce de tableau de microcryogel à-20 ° C pendant 4 à 16 h avant lyophilisation selon étape 1.2.7.
    6. Modifier le 384-multi-puits conception de tableau à l’étape 3.1.1 pour contenir 16 × 24 puits, chacune de 3 mm de diamètre et 4,5 mm--entraxe.
    7. Supprimer un côté de l’appui d’une feuille d’ultra-mince (10 µm) biocompatible ruban double-face adhésif et collez-le sur le côté d’un morceau de feuille de PMMA de 3 mm d’épaisseur. Laser graver la conception de l’étape 3.1.4 sur cette feuille de PMMA épaisseur de 3 mm conformément au point 1.1. Cette baie est désignée comme le tableau de réservoir.
    8. Aligner le tableau microcryogel puce avec la puce de tableau de réservoir et adhérer ensemble étroitement pour assembler la puce 3D microcryogel de tableau pour la culture cellulaire sur puce. Stérilisation par rayons ultraviolets pendant 1 h.
    9. Tableau de microcryogel 3D magasin puces sous vide à température ambiante pour plus amples expériences.
  2. Drug screening sur baies micro-culture 3D
    1. remplir une boîte humide avec 25 mL d’eau désionisée stérile pour servir une chambre humide pour la culture cellulaire. Préchauffez un humidifié 5 % CO 2 incubateur à 37 ° C.
    2. Prises en cellules de cancer du poumon non à petites cellules (NCI-H460) et de cellules de carcinome hépatocellulaire (HepG2) sur les plaques de culture de tissu selon le protocole standard et remettre en suspension dans des milieux de culture à une densité finale de 1,0 x 10 6 cellules/mL. Mélanger soigneusement.
      NOTE : RPM1640 avec 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et la streptomycine 100 µg/mL est utilisé pour NCI-H460. Utilisez DMEM avec 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et la streptomycine 100 µg/mL pour HepG2.
    3. Retirer la chambre d’humidité de l’incubateur. Utiliser des pinces à soigneusement place la 3D assemblé microcryogel tableau puce étape 3.1.9 dans la chambre de l’humidité. Attention de ne pas mouiller le microcryogels avec de l’eau dans la chambre de prendre.
    4. Mélanger la suspension cellulaire soigneusement, puis aliquote 3 µL de suspension cellulaire directement sur le microcryogel dans chaque puits.
      NOTE : L’embout de la pipette devrait toucher légèrement la surface de la microcryogel avant d’expulser la suspension cellulaire. Les cellules sont chargé automatiquement dans le microcryogel par absorption. Ne pas semer de cellules dans les puits périphériques.
    5. Ajouter 10 μL de médias dans chaque puits après que les cellules sont ensemencées en microcryogel à l’aide de la pipette multicanaux, comme un gestionnaire liquid 96 voies. Moyen est également ajouté au puits périphériques.
      AVIS : Utilisation RPM1640 médias avec 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL streptomycin pour les cellules H460. Utiliser des médias DMEM avec 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et la streptomycine 100 µg/mL pour les cellules de HepaG2.
    6. Le tableau microcryogel de cellules chargées de la culture à puce dans la chambre humide pendant 24 h dans une humidifié 5 % CO 2 incubateur à 37 ° C à la forme 3D micro-culture array.
    7. Dissoudre doxorubicine et IMMLG-8439 9 dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour former une solution stock de 10 mM. Diluer les drogues avec milieu de culture pour former un gradient de concentration 10 fois dilution de 2 nM à 200 µM.
    8. Ajouter 10 µL des solutions de drogue dans chaque puits. Utiliser 0,1 % DMSO (dilué dans un milieu) que le contrôle. Incuber le tableau de micro-culture 3D chargés de drogue dans humidifié 5 % CO 2 incubateur à 37 ° C pendant 24 h.
    9. Ajouter 4 µL de la solution mère de résazurine dans chaque puits. Incuber à 37 ° C pendant 2 h. Place la 3D micro-culture array dans le lecteur de microplaques et détecter la fluorescence de résazurine métabolisé par les cellules viables à une longueur d’onde légère excitation d’onde de lumière 560 nm et d’émission de 590 nm.
    10. Soustraire le signal de référence de résazurine provenant de tous les puits avant traitement ultérieur de données. Calculer la fraction de la viabilité cellulaire de chaque puits en divisant son signal de fluorescence par le signal de fluorescence moyenne des puits control.
    11. Tracer la courbe de dose-réponse dans le logiciel de traçage avec la fraction de viabilité cellulaire comme l’axe des y et le logarithme de base 10 de la concentration du médicament dans l’axe des abscisses. Interpoler la concentration de 50 % d’inhibition (CI50) à la fraction de la viabilité cellulaire de 0,5.

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Résultats

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Fabrication et caractérisation des microcryogels pour la formation de micro-culture 3D.

Selon ce protocole, microcryogels ont été fabriqués à forme la 3D microtissues et des microcryogels individuels ou des tableaux de microcryogel et ont été appliquées à la thérapie régénérative et drogue, dépistage, respectivement (Figure 1). Puces de tableau Microstencil fabriqués en PMMA ont été...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modèles de médecine et in vitro régénératrices pour le dépistage des drogues sont deux applications importantes pour les tissus techniques5,6,7,8,9. Alors que ces deux applications ont des besoins très différents, un terrain d’entente entre les deux réside dans la nécessité d’une plus biomimétique condition de culture afin d’améliorer les fonctions de...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions : 81522022, 51461165302). Les auteurs tiennent à remercier tous les membres Du laboratoire d’aide générale.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GélatinesigmaG7041Tous les autres réactifs ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), sauf indication contraire.
Glutaraldéhyde  ;J& K902042Utilisé comme agent de réticulation dans la préparation du matériau.
Couvercle en verre (24 x 50 mm)CITOGLASS, Chine10212450CPour racler la solution précurseur sur des puces de réseau de micropochoirs.
Sodium  ; borohydrure, NaBH4Beijing Chemical Works116-8Pour éliminer le glutaraldéhyde restant après la gélification.
Pot sous videasperts, ChineVC8130Pour conserver les microgels sous vide.
Feuilles de polyméthacrylate de méthyle (PMMA)  ;Sunjin Electronics Co., Ltd, ChineFeuilles PMMA ordinaires.
Système laser RayjetRayjet, AustralieRayjet 50 C30Pour graver des feuilles de PMMA afin de former des puits.
Nettoyeur plasmaMycro Technologies, USAPDC-32GPour rendre le PMMA hyphophile.
LyophiliseurBoyikang, ChineSC21CLPour lyophiliser les matériaux.
Solution de Trypan Blue (0,4 %)Zhongkekeao, ChineDA0065Pour teindre les microgels.
Chlorhydrate de doxorubicineENERGY CHEMICAL, ChineA01E0801360010Pour tester la résistance aux médicaments des cellules dans des microgels 2D ou 3D.
Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japon)CS01-10Pour distinguer les cellules vivantes et les cellules mortes.
Cell Titer-BluePromega (Wisconsin, États-Unis).G8080Pour tester la viabilité des cellules.
Passoire cellulaireBD Biosciences, USA352360Pour collecter des microgels.
D-LuciferinSYNCHEM (Allemagne)s039Pour piquer les cellules.
Microscope électronique à balayageFEI, USAQuanta 200Pour caractériser la morphologie des microgels.
  ; Machine d’essai mécaniqueBose, USA3230Pour mesurer les caractéristiques mécaniques.
Pousse-seringue programmable  ;World Precision Instruments, USAALADINI 1000Pour tester l’injactabilité.
Dynamomètre numériqueHBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., ChineH-50  ;Pour tester l’injactabilité.
Système de stérilisation à l’oxyde d’éthylèneAnprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NCAN74iPour stériliser les microgels avec de l’oxyde d’éthylène.
Lecteur de microplaquesMolecular Devices, USAM5Pour mesurer l’intensité de la fluorescence dans les micro-réseaux.
Microscope confocalNikon, JaponA1RsiPour observer la distribution cellulaire en 3D.
Xénogène  ; Système d’imagerie Lumina IICaliper Life Sciences, USAIVISPour suivre les cellules chez les animaux.
Stataion de travail liquideConception abricot, USAS-pipettePour charger une suspension moyenne ou cellulaire à haute fréquence.

Références

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