Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

L'utilisation de hiPSCs représente une nouvelle stratégie pour le dépistage de drogue et les études mécanistes de diverses maladies. Du point de vue de la régénération, les hiPSC sont également une source potentielle de remplacement des tissus endommagés qui ont une capacité de guérison limitée, comme le cartilage articulaire ^{1 , 2} .

La régénération du cartilage articulaire natif a été un défi depuis plusieurs décennies. Le cartilage articulaire est un tissu doux et blanc qui recouvre la fin des os, les protégeant des frottements. Cependant, il a une capacité de régénération limitée lorsqu'il est endommagé, ce qui rend l'auto-réparation presque impossible. Par conséquent, la recherche axée sur la régénération du cartilage est en cours depuis plusieurs décennies.

Auparavant, la différenciation in vitro dans la lignée chondrogénique était habituellement réalisée avec des BMSC ou des chondrocytes indigènes isolés de l'articulation du genou ³ . Due tO leur potentiel de chondrogenic, BMSC et chondrocytes indigènes ont de nombreux mérites soutenant leur utilisation dans la chondrogénèse. Cependant, en raison de leur expansion limitée et de leur phénotype instable, ces cellules sont confrontées à plusieurs limitations dans la reconstruction des défauts du cartilage articulaire. Dans des conditions de culture in vitro , ces cellules ont tendance à perdre leurs propres caractéristiques après 3 à 4 passages, ce qui finit par affecter leurs capacités de différenciation ⁴ . En outre, dans le cas des chondrocytes indigènes, des dommages supplémentaires à l'articulation du genou sont inévitables lors de l'obtention de ces cellules.

Contrairement aux BMSC ou aux chondrocytes indigènes, les hiPSC peuvent se développer indéfiniment in vitro . Avec les conditions de culture appropriées, les hiPSC ont un grand potentiel en tant que source de remplacement pour la différenciation chondrogénique. Cependant, il est difficile de modifier les caractéristiques intrinsèques des hiPSC ⁵ . En outre, il faut plusieurs essais in vitro compliqués.Ps pour diriger le sort des hiPSC vers un type de cellule spécifique. Malgré ces complications, l'utilisation de hiPSC est toujours recommandée en raison de leur capacité d'auto-renouvellement élevé et de leur capacité à se différencier en cellules ciblées, y compris les chondrocytes ⁶ .

La différenciation chondrogénique est généralement effectuée avec des systèmes de culture tridimensionnels, tels que la culture de pastilles ou la culture de micromasses, en utilisant des cellules progénitrices de type MSC. Si vous utilisez le système HiPSC, le protocole pour générer des cellules progénitrices MSC diffère des protocoles existants. Certains groupes utilisent une culture monocouche de hiPSC pour convertir directement le phénotype en cellules MSC ⁷ . Cependant, la plupart des études utilisent les EB pour générer des cellules secondaires qui ressemblent aux MSC ^{8 , 9 , 10 , 11} .

Différents types de facteurs de croissance sont utilisés pour induire ChondrogeNesis. Habituellement, les protéines de famille BMP et TGFβ sont utilisées, seules ou en combinaison. La différenciation a également été induite avec d'autres facteurs, tels que GDF5, FGF2 et IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} . On a montré que le TGFß1 stimule la chondrogénèse de manière dose-dépendante dans les MSC ¹⁶ . Par rapport à l'autre isotype, le TGFβ3, le TGFß1 induit une chondrogénèse en augmentant la condensation de la cellule mésenchymateuse pré-cartilagineuse. Le TGFβ3 induit la chondrogénèse en augmentant significativement la prolifération des cellules mésenchymateuses ¹⁷ . Cependant, le TGFβ3 est utilisé plus fréquemment par les chercheurs que TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} . BMP2 améliore l'expression de gènes liés aux composants de la matrice chondrogénique chez l'hommeChondrocytes articulaires dans des conditions in vitro ²⁰ . BMP2 augmente l'expression de gènes critiques pour la formation de cartilage dans les MSC en combinaison avec des protéines TGFβ ²¹ . Il a également été démontré que BMP2 améliore de manière synergique l'effet du TGFβ3 par les voies Smad et MAPK ²² .

Dans cette étude, les CBMC-hiPSC ont été agrégés en EB en utilisant du milieu EB dans une boîte de Petri à faible fixation. Les cellules de dépassement ont été induites en fixant les EB à un plat revêtu de gélatine. La différenciation chondrogénique à l'aide de cellules secondaires a été réalisée par culture de pastilles. Le traitement à la fois avec le BMP2 et le TGFß3 a condensé avec succès les cellules et a induit une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) pour la formation de granules chondrogéniques. Cette étude suggère un protocole de différenciation chondrogénique simple mais efficace utilisant CBMC-hiPSCs.

Ce protocole a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861). Les CBMC utilisés pour la reprogrammation ont été obtenus directement de la banque de sang de cordon de l'hôpital St. Mary's de Seoul.

1. Différenciation chondrogénique des iPSC

1. Production CBMC-iPSC
   1. Générer des CBMC-hiPSC en utilisant le protocole montré dans nos travaux antérieurs ²³ .
   2. Recueillir les globules sanguins dans un tube conique de 15 ml et les compter en utilisant un hémocytomètre.
   3. Préparer 3 x 10 ⁵ cellules et centrifuger pendant 5 min à 515 xg et RT. Jeter le surnageant par aspiration et ré-endiguer les cellules dans 0,5 ml de milieu sanguin.
   4. Transférer les cellules dans un puits d'une plaque non-revêtue à 24 puits et ajouter le mélange de virus Sendai, en suivant les recommandations du fabricant.
   5. Centrifuger la plaque pendant 30 min à 1.150 xg et 30 ° C.
   6. En arrièreEr centrifugation, incuber les cellules pendant une nuit (O / N) à 37 ° C dans 5% de CO ₂ .
   7. Le lendemain, transférez les cellules transduites vers un puits revêtu de matrice. Centrifuger la plaque à 1 150 xg pendant 30 min à 30 ° C.
   8. Après centrifugation, éliminer le surnageant, ajouter 1 mL de milieu iPSC et maintenir les cellules O / N à 37 ° C dans 5% de CO ₂ .
   9. Maintenir les cellules attachées à 37 ° C et 5% de CO ₂ . Changez le support tous les jours, en le remplaçant par un support iPSC frais.
      NOTE: Les colonies apparaîtront au jour 14-21 après la transduction.
2. Génération EB
   1. Maintenir les hiPSC à 37 ° C et 5% de CO ₂ . Changez le milieu tous les jours, en le remplaçant par du Essential Essential 8 (E8) moyen.
   2. Préparez 2 x 10 ⁶ hiPSC dans un plat 100 mm en revêtement de vitronectine en milieu E8.
   3. Retirer le milieu E8 du plat de culture et laver avec une solution salée tamponnée au phosphate stérile (PBS).
   4. Ajouter 1Ml d'acide éthylènediaminetétracétique 1 mM (EDTA) et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 min.
   5. Récoltez les cellules avec 3 ml de milieu E8 et transférez-les à un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 250 xg à température ambiante (RT) pendant 2 min.
   6. Aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire et ré-endiguer les cellules dans 5 ml de milieu E8.
   7. Comptez les cellules en utilisant un hémocytomètre et préparez 2 x 10 ⁶ cellules pour chaque boîte de Petri de 100 mm. Remettre en suspension les cellules préparées dans un mélange de 10 ml de milieu E8 et EB (1: 1) avec un inhibiteur de la kinase associée au rho 10 μM (ROCK).
   8. Incuber les cellules O / N pour l'agrégation à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   9. Le lendemain, récoltez les EB agrégées par pipettage. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 1 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les EB dans 10 ml de milieu E8 frais.
   10. Agrandir les EB générés pendant 5 jours, effectuer des changements quotidiens avec fresH E8 moyen. Pour une maturation supplémentaire, changer le milieu de culture en milieu E7. Maintenir les EB à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 5 jours supplémentaires, en effectuant des modifications quotidiennes moyennes avec du moyen E7 frais.
       REMARQUE: Le support E7 est E8 moyen sans FGF2.
3. Induction des cellules de décrochage des EB
   1. Ajouter 6 ml de gélatine à 1% dans un plat 100 mm et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 30 min.
   2. Retirez la gélatine et séchez complètement le plat pendant 2-3 h avant utilisation.
   3. Transférer les EB à un tube conique de 50 ml. Permettre aux EB de s'installer au bas du tube conique. Retirer le surnageant sans déranger les EB.
   4. Remettre en suspension les EB dans 10 mL de milieu de Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS). Transférer les EB sur le plat en gelée et 100 mm. Ajouter 10 μM ROCK inhibiteur.
   5. Incuber et maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 7 jours. Change le thèmeTous les deux jours sans addition d'inhibiteur de ROCK.
4. Formation de culot chromatographique
   1. Aspirer le milieu de culture du plat et laver les cellules trois fois avec du PBS.
   2. Appliquer 1 mL d'EDTA 1 mM et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 min.
   3. Récoltez les cellules en utilisant 5 mL de DMEM avec 20% de FBS et transférez-les dans un nouveau tube conique de 15 mL.
   4. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 250 xg et RT. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot dans 10 mL de DMEM avec 20% de FBS.
   5. Filtrer et jeter les grappes cellulaires en utilisant une crépine cellulaire de 40 μm et récolter les cellules individuelles. Comptez les cellules individuelles à l'aide d'un hémocytomètre.
   6. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 250 xg et RT. Retirer le surnageant et semer 3 x 10 ⁵ cellules par pellet dans un tube conique de 15 ml avec 300 μL de milieu de différenciation chondrogénique (MDP).
   7. Pour la formation de pastilles, centrifuger les cellules pendant 5 min à680 xg et RT.
      REMARQUE: Les granulés sont maintenus dans des tubes coniques de 15 mL lors de la différenciation des pastilles chondrogéniques.
   8. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   9. Changez le MDP tous les 2-3 jours. Dans les 3 jours, les granulés présenteront des morphologies sphéroïdales aplaties. Maintenir les pastilles pendant 21 jours à 37 ° C et 5% de CO ₂ .

2. Caractérisation des granulés chondrogéniques par coloration

1. Incorporation chondrogénique
   1. Avant d'incorporer, préparer et faire fondre la paraffine à 58 ° C.
   2. Fixer les pastilles dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4% pendant 2 h à la température ambiante dans un tube de 1,5 ml.
      Attention: le paraformaldéhyde est très toxique. Éviter tout contact avec les yeux, la peau ou les muqueuses. Minimiser l'exposition et éviter l'inhalation tout en la préparant.
   3. Placez une couche de gaze sur la cassette et transférez les pastilles fixes à l'aide d'une pipette. Couvrir la pastille en pliantÉgentez et fermez le couvercle de la cassette.
   4. Initier la déshydratation dans 100 ml d'éthanol à 70% (EtOH) deux fois, 10 min chacun. Déhydrate les pastilles à travers des lavages séquentiels de 10 minutes dans 80% et 95% d'EtOH.
   5. Transférer les pastilles à 100% d'EtOH pendant 10 min. Répétez trois fois avec de l'EtOH frais.
   6. Pour "nettoyer", échanger la solution pour un mélange 100 mL, 1: 1 d'EtOH et de xylene, suivi d'un mélange 1: 2 d'EtOH et de xylène pendant 10 minutes chacun. Effacer l'EtOH restant en incubant les pastilles deux fois dans 100% de xylene, 10 min chacun.
   7. Pour l'infiltration de paraffine, incuber les pastilles dans des mélanges de xylène et de paraffine séquentiels. Effectuer l'ensemble du processus d'infiltration de paraffine à 58 ° C. Incuber les pastilles dans 100 ml d'un mélange 2: 1 de xylène et de paraffine pendant 30 minutes.
   8. Échangez la solution pour 100 ml d'un mélange 1: 1 de xylène et de paraffine et incuberez pendant 30 min.
   9. Échangez la solution pour 100 ml d'un mélange 1: 2 de xylène et de paraffine et incuberez pendant 30 min.
   10. Pour l'infiltration finale, transférer les pastilles au premier bain de 100% de paraffine et incuber pendant 2 h.
   11. Transférer les pastilles au deuxième bain de 100% de paraffine et incuber O / N à 58 ° C.
   12. Le lendemain, transférez doucement les pastilles à un moule à l'aide d'une pince. Ajouter de la paraffine au moule du distributeur de paraffine. Solidifier la paraffine pendant 30 min à 4 ° C.
   13. Coupez les sections à 7 μm et transférez les sections sur la glissière. Laissez les diapositives sécher pendant la nuit et rangez les diapositives à la température ambiante jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi.
2. Préparation de la diapositive
   1. Déparaffiner les diapositives en les déplaçant à travers 100 mL de 100%, 90%, 80% et 70% d'EtOH séquentiellement pendant 5 min chacun.
   2. Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l'eau du robinet pendant 5 min.
3. Coloration bleue Alcian
   1. Incuber les glissières dans 50 ml d'une solution de bleu alice à 1% pendant 30 minutes.
      NE PASE: Le bleu Alcian est dilué dans une solution à 3% d'acide acétique. Ajuster le pH à 2,5 en utilisant de l'acide acétique.
   2. Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l'eau du robinet pendant 2 min.
   3. Rincer les lames dans de l'eau déminéralisée (DW) et contraster avec une solution nucléaire rapide et rouge pendant 2 min.
   4. Placez les glissières dans un pot en verre et rincer à l'eau du robinet pendant 1 min.
   5. 2.3.5) Procédez pour déshydrater et montez les diapositives à l'étape 2.6.
4. Teinture de bleu de toluidine
   1. Incuber des lames dans 50 ml de solution de bleu de toluidine pendant 4 min.
   2. Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l'eau du robinet pendant 5 min.
   3. Procédez pour déshydrater et montez les diapositives à l'étape 2.6.
5. Coloration immunohistochimique
   1. Incuber les diapositives dans 3% de H ₂ O ₂ pendant 15 minutes pour le blocage de peroxydase endogène.
   2. Appliquer 200 μl d'anticorps primaire (anti-COL1A1 et -COL2A1) dilué 1: 100 en tris-bu(TBS) contenant 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 5% de sérum de chèvre normal (NGS) aux lames et incuber à O / N à 4 ° C.
   3. Le lendemain, placez les diapositives dans un pot en verre et lavez-les avec 50 ml de TBS contenant 0,1% de polysorbate 20 (TBST) trois fois pendant 5 min chacun.
   4. Appliquer 200 μl d'anticorps secondaire (anticorps IgG anti-lapin de chèvre, dilué 1: 200 dans du TBS contenant 1% de BSA et 5% de NGS) aux diapositives et incuber à TA pendant 40 min.
   5. Placez les glissières dans un pot en verre et lavez-les trois fois avec 50 mL, 5 minutes chacune.
   6. Pour l'amplification du signal, appliquer une solution de streptavidine conjugue HRP aux lames et incuber pendant 10 min.
   7. Placez les glissières dans un pot en verre et lavez-les trois fois avec 50 mL, 5 minutes chacune.
   8. Mélanger la solution de substrat DAB-peroxydase, appliquer 200 μL de solution à chaque diapositive et incuber pendant 1 min.
   9. Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l'eau du robinet pendant 5 min.
   10. CounterstainAvec l'hématoxyline de Mayer pendant 1 min.
   11. Lavez les diapositives avec DW.
   12. Procédez pour déshydrater et montez les diapositives à l'étape 2.6.
6. Déshydratation et montage
   1. Déshydratez les diapositives en les déplaçant séquentiellement dans 100 mL de 70%, 80%, 90% et 100% d'EtOH, 30 s chacun.
   2. Trempez les diapositives en deux changements de xylène pendant 1 min chacun.
   3. Ajoutez 50 μL de solution de montage aux lamelles et placez les diapositives sur le dessus.

Dans cette étude, nous avons généré des granulés chondrogéniques provenant de CBMC-hiPSC en induisant des cellules secondaires des EB. La différenciation chondrogénique a été induite par CBMC-hiPSC avec une forte pluripotence confirmée 11 . Un schéma simple de notre protocole est illustré à la figure 1A . Avant la différenciation, les colonies iPSC ont été développées ( figure 1B ). Les iPSC développés ont été assemblés en EB pour initier la différenciation ( figure 1C ). Les EB générés ont été attachés à des plaques revêtues de gélatine pour induire des cellules de décroissance ( Figure 1D ). Ensuite, les cellules descendantes ont été récoltées et utilisées pour générer des granulés chondrogénés. Après 21 jours de différenciation, des granulés chondrogéniques petits et semblables à des perles ont été obtenus et utilisés pour une autre caractérisation ( Figure 1E ). La qualité du chon généré in vitroLes pastilles drogènes ont été confirmés par divers essais.

Nous avons évalué histologiquement la qualité des pastilles chondrogéniques au jour 21. Les pastilles chondrogéniques BMSC ont été utilisées comme témoin positif. L'accumulation de protéines ECM sécrétées par les chondrocytes différenciés a été confirmée par une coloration bleu alcian et bleu toluidine à la figure 2A . Les principales caractéristiques du cartilage sain, comme la production de lacunes et de protéoglycanes, ont augmenté à mesure que le processus de différenciation s'est poursuivi pendant 21 jours. Les granulés chondrogéniques générés par CBMC-hiPSC ont exprimé COL2A1, qui est le principal composant ECM dans le cartilage sain ( figure 2B ). L'expression de COL2A1 des pastilles dérivées de CBMC-hiPSC était supérieure à celle des pastilles dérivées de BMSC. L'expression du collagène type I, un marqueur pour le cartilage fibrotique, était plus faible dans les pastilles CBMC-hiPSC par rapport à l'expression de COL2A1.

L'expression génique des protéines ECM du cartilage dans les pastilles chondrogéniques du jour 21 a été confirmée par PCR en temps réel. L'expression d'aggrecan (ACAN) des pastilles dérivées de CBMC-hiPSC était similaire à celle des pastilles dérivées de BMSC ( Figure 3A ). L'expression de COL2A1 était significativement plus élevée dans les pastilles CBMC-hiPSC dérivées ( Figure 3B ). L'expression de la zone Y-box 9 (Sox9) déterminée par le sexe, un marqueur progenitor chondrogénique, a également été évaluée. Les granulés générés à partir de CBMC-hiPSC ont exprimé des niveaux élevés de Sox9 ( Figure 3C ). Nous avons confirmé que ces gènes étaient significativement régulés à la hausse dans les pastilles chondrogènes CBMC-hiPSC par rapport aux granulés de contrôle BMSC au jour 21. L'expression d'un marqueur hypertrophique, COL1A1, a été évaluée ( Figure 3D ). L'expression de COL1A1 dans les pastilles dérivées de CBMC-hiPSC a été réduite par rapport à celle du BMSC-deriPellets fermés. L'efficacité de la différenciation a été analysée par le rapport COL2A1 à COL1A1 ( Figure 3E ). L'augmentation du rapport dans les pastilles CBMC-hiPSC a démontré l'expression relativement élevée de COL2A1 par rapport à COL1A1. En conclusion, nous avons confirmé la capacité de différenciation chondrogénique des CBMC-hiPSCs. La qualité des granulés chondrogéniques dérivés de CBMC-hiPSC générés avait une qualité compatible avec celle des BMSC.

Figure 1: différenciation chondrogénique des hiPSCs. ( A ) Schéma de génération de pastilles chondrogéniques des hiPSCs. ( B ) Morphologie du CBMC-hiPSC généré. ( C ) Morphologie des EB générés. ( D ) Les cellules extractives dérivées des EB sont attachées à un plat de culture enduit de gélatine. ( E ) Image de t Il a obtenu une granulation chondrogénique après 21 jours de différenciation. Les unités des intervalles sont indiquées en millimètres. Barres d'échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Analyse histologique de la pastille chondrogénique. ( A ) Évaluation histologique des pastilles chondrogéniques au jour 21 en bleu alcian et en bleu toluidine. ( B ) Image d'immunohistochimie des pastilles chondrogéniques colorées avec des anticorps COL1A1 et COL2A1. Barres d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1 ">
Figure 3: Expression génique de la pastille chondrogénique. ( A ) Expression relative du gène de l'ACAN. ( B ) Expression génique relative de COL2A1. ( C ) Expression génique relative de SOX9. ( D ) Expression génique relative de COL1A1. ( E ) Expression génique de COL1A1. ( F ) Expression génique de COL10A1. ( G ) Le rapport de l'expression du gène COL2A1: COL1A1. Les granulés ont été récoltés et analysés après 21 jours de différenciation. Les données ont été obtenues en utilisant la PCR en temps réel et affichées comme l'erreur standard moyenne des expériences en triple par échantillon (n = 3). L'expression génétique a été normalisée à GAPDH en tant que contrôle interne. (* P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).K "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

	Numéro de téléphone	Rendement des cellules de décroissance	Rendement des pastilles
HiPSCs	2 x 10 6	2-5 x 10 7	70-150
MSC	2 x 10 6	-	6

Tableau 1: comparaison de rendement de MSC et hiPSCs.

Nom de la cible	Direction	Séquence d'amorçage	Taille
	Vers l'avant	TTCCGCGACGTGGACAT	77 pb
Sens inverse	TCAAACTCGTTGACATCGAAGGT
UNE CANETTE	Vers l'avant	AGCCTGCGCTCCAATGACT	107 pb
Sens inverse	TAATGGAACACGATGCCTTTCA
COL2A1	Vers l'avant	GGCAATAGCAGGTTCACGTACA	79 pb
Sens inverse	CGATAACAGTCTTGCCCCACTTA
COL1A1	Vers l'avant	CCCCTGGAAAGAATGGAGATG	148 pb
Sens inverse	TCCAAACCACTGAAACCTCTG

Tableau 2: Séquences des amorces contre les marqueurs chondrogéniques en PCR en temps réel.

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.