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Méthodes et conseils pour l’Administration intraveineuse de Virus Adeno-associé à des Rats et d’évaluation de la Transduction du système nerveux Central

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DOI :

10.3791/55994

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25 août 2017

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1Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

Dans cet article

Résumé

Méthodes pour une livraison de gène à grande échelle du système nerveux central chez le rat sont couvertes. Dans cet exemple, le but consiste à mimer une maladie qui affecte l’ensemble de la moelle épinière. La transduction généralisée peut être utilisée pour fournir une protéine thérapeutique à la CNS d’une administration unique, périphérique.

Résumé

Vecteurs de virus adeno-associated virus (AAV) sont un réactif clé en neurosciences pour groupés régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR), optogenetics, ciblant les cre-lox, etc.. Le but de ce manuscrit est d’aider le chercheur tente expansive du système nerveux central (CNS) transfert de gènes chez le rat par injection dans la veine queue d’AAV. Grande échelle expression s’applique pour les conditions avec une pathologie très répandue, et un modèle de rat est important en raison de sa grande taille et similarités physiologiques à l’homme par rapport à des souris. Dans cet exemple d’application, une transduction neuronale à grande échelle est utilisée pour simuler une maladie neurodégénérative qui affecte l’ensemble de la moelle épinière, sclérose latérale amyotrophique (SLA). La transduction de CNS grande échelle efficace permet également de livrer des facteurs protéiques thérapeutiques dans des études précliniques. Après un intervalle d’expression après l’injection de plusieurs semaines, les effets de la transduction sont évalués. Pour un vecteur de contrôle de la protéine fluorescente verte (GFP), la quantité de GFP dans le cervelet est estimée rapidement et sûrement par un programme d’imagerie de base. Pour les phénotypes maladie moteur qui sont induits par l’ALS concernant réponse transactive protéine protéine de liaison à l’ADN de 43 kDa (TDP-43), les déficits sont marqués par rotarod et réflexe de fuite. Au-delà de la modélisation de la maladie et la thérapie génique, il y a diverses applications potentielles pour le ciblage de gène de grande échelle décrite ici. L’utilisation accrue de cette méthode aidera à accélérer dans les neurosciences et la neurogénétique des tests d’hypothèses.

Introduction

Vecteurs recombinants adeno-associated virus (AAV) sont des outils indispensables pour la recherche de la CNS, parce qu’ils sont si efficaces pour la transduction des neurones in vivo. Des vecteurs d’AAV sont très versatiles pour étudier différents transgènes et isoformes protéiques, différents tissus, différentes espèces hôtes et les différentes voies d’administration. Par exemple, AAV peut être administré à des souris par un périphérique, peu intrusive, injection intraveineuse pour transmettre les neurones dans le système nerveux central comme le premier décrit dans Foust et coll. et Duque et al. (voir le document JOVE par Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 approche de prestation de ce gène est utilisée chez les rats d’exprimer efficacement une protéine fluorescente verte (GFP) ou l’ALS associés protéine, réponse transactive ADN-protéine de 43 kDa (TDP-43) dans le système nerveux central. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 travailler chez le rat est important car les paramètres physiologiques et métaboliques de la rat sont plus proches de l’homme par rapport aux souris et il y a des tests comportements et toxicologiques conçus spécifiquement pour les rats. En outre, les lignes de rat transgénique plus deviennent disponibles qui peuvent être utilisées dans les études de transfert de gène AAV.

Méthodes sont détaillées expansive CNS transfert de gènes chez le rat et la quantification rapide et fiable des résultats. Transduction de CNS à grande échelle est utilisée pour imiter la symptomatologie de la SLA chez les rats en exprimant TDP-43 tout au long de la moelle épinière. La méthode est des injections de veine de queue du vecteur TDP-43 à jeunes rats adultes que celui utilisé dans Jackson et al. 6 , 8 , 9 après plusieurs semaines, les déficits moteurs induite par TDP-43 sont marqués par deux méthodes : échapper à réflexe et rotarod tel qu’utilisé dans Dayton et al. et Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 pour le vecteur GFP contrôle, dans l’analyse post-mortem, la zone fluorescente du cervelet est calculée comme un indice d’efficacité de transduction utilisé dans Jackson et al. 6 , 8 l’analyse du cervelet s’est avéré pour être un index rapid et fiable du degré de transduction CNS après la livraison de gène périphériques et devrait s’appliquer à une variété d’approches tentative de transfert de gènes de centre-à-périphérique.

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Protocole

toutes les procédures suivies les directives appropriées du NIH. Toutes les procédures suivies des protocoles d’animaux qui ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à LSU Health Sciences Center à Shreveport et animalier. Rats Sprague-Dawley femelles à l’âge de 6 semaines ont été utilisés pour cette procédure.

1. déterminer les doses/volumes du vecteur nécessaire

  1. peser les rats à doser et déterminer la quantité de vecteur viral nécessaire pour chaque animal basées sur le titre (concentration) de la préparation de vecteur. Utiliser des doses de vecteur qui ont réussi pour l’expression efficace chez le rat CNS précédemment (voir Jackson et al. 6).
    Remarque : pour AAV9 TDP-43 ou AAV9 GFP, une dose typique est compris entre 3 x 10 13 - 1 x 10 14 vector génomes/kg. Les jeunes rats adultes à l’âge de 6 semaines pèsent environ 150 g.
  2. Faire des doses équivalentes par kg chez tous les animaux pour les comparaisons systématiques. S’assurer que le volume ne dépasse pas les volumes d’injection conseillées standard (250-500 µL pour un rat de 250 g). Un volume d’injection typique est 200 μl à un jeune rat adult.

2. Préparer le poste de travail

  1. Rassemblez toutes les fournitures : un film de paraffine carré (environ 5 x 5 cm) par animal, un alcool préparation pad par animal, tampons de gaze (2-3 par animal), embouts et une micropipette.
  2. Préparation de la surface de travail de nettoyage de la surface avec l’éthanol à 70 %. Placez un coussin chauffant vers le bas avec la température réglée à faible (~ 37 ° C). Placez un banc sur le coussin chauffant.
  3. Préparer l’anesthésie de gaz (isoflurane). S’assurer que l’oxygène proportionné et anesthésie de gaz pour la procédure. Nettoyer le masque de chambre et l’anesthésie d’induction avec l’éthanol à 70 % et placez le masque d’anesthésie sur le coussin banc.

3. Préparer le vecteur

  1. décongeler le vecteur à la température ambiante et étiqueter un tube de microtubes stériles pour chaque animal.
  2. Pipette le volume d’AAV déterminé en étape 1.1 dans le tube approprié et porter le volume jusqu’au volume d’injection désirée (ici, 200 μl) sonnerie amorcez ' solution s ou salin.
  3. Vortex l’échantillon pour 1-2 s d’impulsion et d’impulsion puis centrifuger pendant 5 s pour amener l’échantillon à la partie inférieure du tube de.
  4. Pipette le volume d’injection totale pour le rat sortir le tube et sur la place du film de paraffine.
  5. Placer une aiguille 30 g sur une seringue de 1 mL.
  6. Placer l’aiguille avec le biseau vers le bas dans le vecteur sur le film de paraffine. Tirez sur le piston de la seringue jusqu'à ce que tous le virus est dans l’aiguille et la seringue. Veillez à éviter de tirer des bulles d’air dans l’aiguille, qui devient plus facile avec la pratique.

4. Préparer le rat

  1. tourner l’oxygène jusqu'à 1 L/min et régler l’anesthésie à l’isoflurane à 5 %. Veiller à ce que l’anesthésie de gaz circule dans la chambre de l’induction en vérifiant tous les tuyaux de raccordement et les orientations de robinet.
  2. Placer le rat dans la chambre de l’induction de l’anesthésie gaz environ 3 min, jusqu'à ce que le rat ne répond pas.
  3. Assurer une profondeur adéquate de l’anesthésie en pinçant l’orteil. Il ne devrait y avoir aucun mouvement dans le pied ou la jambe après le pincement de l’orteil.
  4. Réduire l’anesthésie à l’isoflurane à 2 % pour l’entretien de l’anesthésie et ajuster le robinet pour que l’anesthésie s’écoule au masque anesthésie.
  5. Placer le rat ' s le nez dans le masque d’anesthésie et d’ajuster le rat afin qu’il est couché sur le côté.
  6. Identifier la veine caudale latéral.
    Remarque : Les veines de queue latéral se situent à environ 10 et 2 o ' Horloge avec le haut dorsal de la queue comme 12 o ' horloge. Avec le rat couchée sur le côté, la veine caudale latéral doit faire face vers le haut
  7. Essuyer la zone d’injection avec le pad de préparation de l’alcool. Le site d’injection est sur toute la longueur de la queue des deux-tiers.

5. Injecter le vecteur

  1. Tenez fermement la queue légèrement au-dessus de la zone d’injection avec un doigt directement sur la veine caudale latérale ; cela va dilater la veine.
  2. Avec le biseau vers le haut, alignez l’aiguille avec la veine de queue visible dans la même direction.
  3. Percer la peau qui couvre la veine caudale tout en prenant grand soin d’éviter l’autre main tenant la queue et en appuyant sur la veine caudale.
  4. Relâcher la pression de la veine caudale pour permettre la circulation sanguine normale.
  5. Déplacer l’aiguille dans la veine. Pour s’assurer que l’aiguille a percé la veine caudale, tirez légèrement sur le piston. Si l’aiguille est dans la veine, le sang coulera dans l’aiguille.
    1. Repositionner l’aiguille au besoin. Ensuite, afin de stabiliser l’aiguille, déplacez la main au-dessus du site d’injection à au-dessous du point d’injection et tenir l’extrémité de la seringue contre la queue.
  6. D’injecter lentement le vecteur dans la queue (environ 20 µL/s).
    Remarque : La veine peut perdre la couleur que les flux de vecteur à travers elle. Les signes que la solution a été injectée en dehors de la veine incluent blebbing, blanchiment de la peau, ou la résistance lorsque le vecteur de l’injection. Avec la pratique, l’exposition extra vasculaire peut être minimisée.
  7. Après que le vecteur a été administré, retirer l’aiguille chez le rat et appuyez sur une compresse de gaze contre le site d’injection pour aider à endiguer le saignement pendant 30-60 s.

6. Nettoyage

  1. désactiver l’isoflurane anesthésie et l’oxygène. Surveiller le rat jusqu'à ce qu’il reprend conscience et puis la remettre dans sa cage.
  2. Placer soigneusement toutes les aiguilles dans le conteneur d’objets pointus ou tranchants. Disposer de tous les autres matériaux jetables pouvant être contaminées avec AAV dans un récipient approprié biohazard. Nettoyer les postes de travail avec 70 % éthanol.

7. Évaluer le réflexe de s’échapper du membre postérieur

Remarque : les déficits du membre postérieur surviennent généralement de 2 à 6 semaines après le transfert de gène TDP-43, selon la dose de vecteur.

  1. Sur une surface plane claire des débris, avec deux doigts, saisissez le rat ' s queue d’environ 2 cm du corps. Soulevez doucement le rat jusqu'à ce que les membres antérieurs sont suspendus pendant que vous regardez la face ventrale inférieure du rat.
    1. Effectuez la procédure chaque semaine tout au long de l’évolution temporelle expérimentale après transfert de gènes (p. ex., jusqu'à 12 semaines après le transfert de gène).
      NOTE : Également marquer des déficits des membres antérieurs de cette manière, mais les déficits du membre postérieur sont plus susceptibles de survenir dans ce modèle, en fonction de la dose du vecteur utilisé.
  2. Observer des membres postérieurs pour 10 Note s. Si un ou les deux membres postérieurs serrent vers la ligne médiane pendant 10 s.
  3. Répéter ce test pour un total de trois fois avec 30 s entre les essais. Si un ou les deux membres postérieurs sont fermés pour chacun des trois essais, le rat montre des troubles moteurs. Enregistrer les données (manuellement dans les notes) soit unilatérale ou bilatérale du membre postérieur de déficit actuel, si il est compatible crispation dans les trois essais.

8. Évaluer la fonction motrice sur le rotarod

  1. de mettre en place le rotarod, placez un coussin de banc sous le rotarod et accélération la valeur 4-40 tours par minute (tr/min) pendant 2 min (le taux augmente de ~0.3 tr/min/s). Pour un heure de cours de 12 semaines, les sujets sont projetés à 2, 4, 8 et 12 semaines après gene transfer.
  2. Permettre le rat s’acclimater à la salle d’examen pendant 20 min.
  3. Pour former le rat d’utiliser le rotarod pour la première fois, d’abord démarrer le rotarod à une vitesse de 4 tr/min, puis placez le rat sur le rotarod. Laissez le rat à marcher pendant un tour complet à 4 tr/min, puis démarrez l’accélération et laissez le rat marcher sur le rotarod jusqu'à ce qu’il tombe. Continuer la formation jusqu'à ce que le rat peut toujours marcher pendant au moins 40 s. Un rat adulte en bonne santé, les jeune apprendront facilement de cette manière.
    1. Dans le cas d’un rat avec un handicap moteur remarquable, qui peut empêcher le rat de parvenir à une latence de ligne de base pour tomber de 40 s, fournir le rat 3-5 tentatives de formation avant de commencer à marquer rotarod.
  4. Pour commencer à tester les rotarod, placez le rat sur le rotarod et commencez à accélérer le rotarod. Notez l’heure à laquelle le rat tombe le rotarod ; Il s’agit de la latence à l’automne. Si le rat reste sur le rotarod après 120 s, cap de la session à ce stade, retirez le rat le rotarod et enregistrer une latence de chute de 120 s.
  5. Répéter l’essai deux fois plus pour un total de trois essais. Pour minimiser l’effet de la fatigue, l’espace des essais au moins de 5 min apart. Moyenne des scores des trois essais. Un rat adulte irréprochable a généralement une latence moyenne chute de > 40 s.
  6. Remettre le rat dans la cage et nettoyer le rotarod et ses environs avec l’éthanol à 70 %.

9. Quantification de l’expression de la GFP dans le cervelet

  1. anesthésier les rats et perfuse en solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis de paraformaldéhyde à 4 %. Disséquer le cerveau et la moelle épinière et tremper les tissus dans le fixateur du jour au lendemain et puis déplacez-les vers une solution de saccharose 30 %. Après équilibration, coupes 50 μm coronal sur un glissement microtome à congélation étape 4 , 5 , 6.
  2. Sélectionner les sections de 3 à 6 du cervelet qui sont équidistants dans le vermis, le lobe central du cervelet. Fluorescent étiquette la GFP pour optimiser le signal. Utilisez l’anticorps primaire pour GFP au 1/500 et l’anticorps secondaire conjugué Alexa-488 à une dilution de 1 : 300 4 , 5 , 6.
    Remarque : Voir références 4 , 5 , 6 pour plus de détails sur l’échantillonnage, coupes et de procédures de coloration.
  3. Photomicrographie chacune des sections d’intérêt dans la région définie avec un objectif de faible grossissement, à l’aide d’un microscope. Utiliser un objectif de X 2,5 (N.A. 0,12) et filtre set 10, 450-490/515-565 excitation/émission). Conserver les réglages de l’appareil (temps d’exposition, par exemple, 2 s) les mêmes dans les trois échantillons à analyser. Enregistrer en tant qu’un. Fichier TIF.
  4. Ouvrir la photomicrographie dans le programme d’image de Scion largement disponible ; deux fenêtres seront ouvre. Fermez la fenêtre indiqué comme " couleurs indexées ".
  5. Choisissez " Options ", puis " SliceŔ densité, une gamme de nuances sera indiquée en rouge sur la fenêtre de look-up Table (LUT). Dans la fenêtre, utilisez le curseur pour remplir la GFP un étiquetage spécifique seulement et s’arrête lorsque l’arrière-plan non-spécifiques commence à être ramassé dans l’image.
    Remarque : Cela mettra en évidence la zone fluorescente sur la photomicrographie à quantifier. Les paramètres doivent être optimisés pour capturer plus précisément toutes les cellules visiblement fluorescents. Avec la pratique, cette méthode peut justement mettre en évidence la fluorescence spécifique.
  6. Avant de mesurer les superficies fluorescent, tout d’abord s’assurer que les mesures effectuées sont dans les unités correctes (pixels). Pour ce faire, cliquez sur " analyse ", puis " la valeur ScaleŔ la quatrième ligne devrait dire " unités ". Dans la liste déroulante, choisissez pixels pour mesurer en pixels, puis cliquez sur " OK ". Activer/désactiver les options d’analyse de " comprennent l’intérieur trous " à assurer l’inclusion de tout le corps cellulaire dans l’analyse.
  7. Pour mesurer la surface fluorescente, cliquez " analyse " et puis cliquez sur " mesure ". Cette valeur, cliquez " Analyze " puis cliquez sur " ResultsŔ Show une fenêtre de résultats s’affiche. La mesure de la surface fluorescente est sous la rubrique intitulée " zone ".
  8. Pour garantir les mesures de normalisation, ne modifiez pas les valeurs en surbrillance dans la fenêtre LUT.
  9. Une fois que toutes les mesures ont été enregistrées, la moyenne des valeurs pour chaque animal (de 3 à 6 Articles par animal). Un test statistique approprié permet de comparer les zones transduits entre les groupes. 6

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Résultats

TDP-43 induit une déficience moteur devrait se produire au sein de 2 à 6 semaines selon la dose de l’AAV TDP-43 utilisée (Figure 1). Les injections de veine de queue infructueuse entraînera partielle ou aucune déficience ; l’AAV doit atteindre la circulation sanguine pour produire l’effet. Une injection réussie d’AAV GFP se traduira par l’expression de la GFP dans le cerveau et la moelle épinière dans une façon vector-dose-dépendante. Lorsque vous utilisez le...

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Discussion

Une variété d’itinéraires de livraison ont été testés pour des vecteurs d’AAV : intra-parenchymateux, intra-cérébroventriculaire, intra-thécale, par voie intraveineuse, par voie nasale, intramusculaire, etc. Chaque itinéraire peut avoir des avantages spécifiques, mais aussi des inconvénients. Administration de queue veine de VAA à des rats adultes est une méthode fiable pour la réalisation de transduction cohérente du SNC. La méthode d’injection périphérique permet d’éviter l’introduction d’une canule d’injection dans le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par l’ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx et un don de charité pour la recherche ALS de Thomas Lawson, pour lesquels nous sommes reconnaissants. Nous remercions yassine verger et Donna Burney de conseils et de formation. JAS a été soutenu par la Fondation menti et accorder des National Institutes of Health GM103418.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BalancePelouzeSP5
Nalgenebucket Thermo Scientific120140004000 mL
Tube de microcentrifugationUSA Scientific1615-5500
Lactated Ringer’s SolutionBaxter Healthcare0338-0114-04
Mini vortexerFisher Scientific
CentrifugeuseEppendorf22624415
Film de laboratoireBemisPM996
Seringue de 1 mLBD309626Livré avec une aiguille de 25 g.
Remplacer par une aiguille de 27-30 g pour l’injection
Aiguille de 30 gBD305106
IsofluranePiramal Healthcare66794-013-25Isoflurane USP 250 mL
Masque d’anesthésieKopf Instruments906
GauzeHenry Schein100-25242 » x 2 » (5cm x 5cm)
Pointes de pipetteUSA Scientific1111-0816
MicropipetGilson4642080
Vaporisateur d’anesthésie à gazSurgiVet4214322Classic T3
Capteur d’anesthésie au gazSurgiVet32373B10Enviro-PURE
Coussin chauffantSears17280
Coussin de paillasseVWR56617-006
RotarodPanlab/Harvard Apparatus76-07724 rats/ 4 souris
70 % EthanolDecon Laboratories, Inc.2401140 proof
70 % IsopropanolVWR89108-160
Scion Image ScionCorporation
GFP Tag Anticorps polyclonalInvitrogenA11122Anticorps primaire - dilution 1:500
AlexaFluor 488InvitrogenA11070Anticorps secondaire - dilution 1:300
Axioskop 40 microscopeZeiss
128101

Références

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).

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Mots-clés

Mod le de ratInjection dans la veine caudaleTransfert de g nesExpression de la GFPAnalyse d imagesLogiciel Scion ImageMesure de la zone fluorescente

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