Imagerie de cellules vivantes des cellules fongiques d’enquêter sur les Modes d’entrée et de la localisation sous-cellulaire des défensines plante antifongique

Résumé

Plante défensines jouent un rôle important dans la défense de la plante contre les agents pathogènes. Pour une utilisation efficace de ces peptides antifungal agents antifongiques, comprendre leurs modes d’action (PA) est critique. Ici, une méthode d’imagerie de cellules vivantes est décrite afin d’étudier les aspects essentiels du ministère de l’agriculture de ces peptides.

Résumé

Petits riches en cystéine défensines sont l’un des plus grands groupes de peptides de défense hôte présents chez toutes les plantes. Nombreuses plantes défensines pièce puissant in vitro une activité antifongique contre un large spectre d’agents pathogènes fongiques et donc sont susceptibles d’être utilisés comme agents antifongiques dans les cultures transgéniques. Afin d’exploiter le plein potentiel des défensines végétales pour le contrôle des maladies, il est crucial d’élucider leurs mécanismes d’action (PA). Avec l’avènement des techniques de microscopie avancées, imagerie de cellules vivantes est devenu un outil puissant pour comprendre la dynamique de la MOA antifongique de défensines végétales. Ici, une méthode d’imagerie de cellules vivantes de microscopie confocale basée est décrite à l’aide de deux plantes fluorescent étiquetés défensines (MtDef4 et MtDef5) en combinaison avec les colorants fluorescents vitales. Cette technique permet la visualisation en temps réel et l’analyse des événements dynamiques de l’internalisation de MtDef4 et MtDef5 en cellules fongiques. Ce qui est important, ce test génère une foule de renseignements dont la cinétique de l’internalisation, mode d’entrée et de la localisation intracellulaire de ces peptides. Ainsi que d’autres outils biologiques cellulaires, ces méthodes ont fourni un aperçu essentiel de la dynamique et la complexité du ministère de l’agriculture de ces peptides. Ces outils peuvent également servir à comparer le ministère de l’agriculture de ces peptides contre les différents champignons.

Introduction

Plantes ont développé un système sophistiqué d’immunitaire inné pour la défense contre l’usine microbiens pathogènes¹. Ils expriment de nombreux peptides de défense hôte gène codé avec activité antimicrobienne putatif². En effet, bon nombre de ces peptides affichent une activité antimicrobienne in vitro³. Défensines constituent un des plus grands groupes de peptides de défense du hôte dans le Royaume de plante⁴. Ces peptides riches en cystéine, cationiques pièce activité inhibitrice de croissance puissant contre les champignons et oomycètes pathogènes à des concent....

Protocole

1. étiquetage des défensines avec des Fluorophores

1. Sélectionnez un fluorophore qui a un effet minimal sur les propriétés antimicrobiennes ainsi que la captation et la localisation de defensin à l’intérieur de la cellule vivante.
   Remarque : En sélectionnant un fluorophore optimal dépend d’objectifs expérimentales spécifiques. Les propriétés spectrales et chimiques, la photostabilité, la taille et la charge du fluorophore envisager également.
2. Étiquette defensin avec le fluorophore sélectionné à l’aide d’un peptide approprié labeling kit disponible chez les revendeurs commerciaux. Alternativement, chimiquement synthétiser les défensines marqués a....

Résultats

Vivre l’imagerie cellulaire a été réalisée pour suivre et comparer l’internalisation et la localisation subcellulaire des deux défensines, MtDef4 et MtDef5, de Medicago truncatula; les cellules fongiques. TMR-MtDef4 a été synthétisé chimiquement tandis que MtDef5 a été étiqueté avec Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Les conidies sont incubées avec soit defensin en combinaison avec le colorant de membrane sélective FM4-64. La figure 1 montre que TMR-MtD.......

Discussion

Dans cette étude, une méthodologie d’imagerie fiable de cellules vivantes avec l’utilisation de fluorescent étiquetés défensines antifongique a été décrite pour étudier la cinétique de l’internalisation de ces peptides dans des cellules fongiques et de déterminer leurs cibles subcellulaires. Cette méthode est un outil puissant pour visualiser la dynamique de l’interaction entre les cellules fongiques et les défensines temporellement et spatialement.

Diverses méthodes ont été utilisées pour étu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FM4-64 Dye	Life Technologies	T13320
DyLight 550 Kit d’étiquetage d’anticorps	Thermo Scientific	84530
Fond en verre Microwell Dishes	Mat TeK	P35G-1.5-10-C
Mira cloth	EMD Millipore Corp	475855-1R
SP8-X Microscope confocal	Leica
ImageJ software	FiJi		pour l’analyse d’images
Logiciel Imaris	Bitplane		pour l’analyse d’images