Localisation quantitative d’une protéine de Golgi Imaging sa masse Centre de Fluorescence

Résumé

La localisation précise des résidents de l’appareil de Golgi est essentielle pour comprendre les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi. Toutefois, la microscopie optique conventionnelle est incapable de résoudre la structure sub-Golgi. Nous décrivons ici le protocole pour une méthode de Super-résolution microscopie conventionnelle basée déterminer quantitativement la localisation sup-Golgi d’une protéine.

Résumé

L’appareil de Golgi est constitué de saccules membranaires empilées en série qui peuvent être également classés en régions sub-Golgi, y compris le cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi et trans-réseau de l’appareil de Golgi. Les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi sont déterminées par la répartition de ses protéines résidentes. La résolution spatiale de microscopie optique conventionnelle est trop faible pour résoudre la structure sub-Golgi ou saccules. Ainsi, la microscopie immuno-or est une méthode de choix pour localiser une protéine au niveau sub-Golgi. Cependant, la technique et l’instrument sont au-delà de la capacité de la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Nous décrivons ici notre méthode développée récemment Super-résolution appelée localisation des protéines Golgi par imagerie centres de masse (GLIM) systématiquement et quantitativement localiser une protéine de Golgi. GLIM est basé sur les protocoles d’étiquetage de fluorescence standard et grand champ conventionnel ou microscopes confocaux. Il s’agit de l’étalonnage de l’aberration chromatique-Maj du système microscopique, l’acquisition de l’image et l’analyse postérieure à l’acquisition. La localisation de sub-Golgi d’une protéine test est exprimée quantitativement comme le quotient de localisation. Il existe quatre principaux avantages de GLIM ; C’est rapide, basé sur les outils et les méthodes conventionnelles, le résultat de la localisation est quantitatif, et qu’elle leur offre ~ résolution pratique de 30 nm suivant l’axe de l’appareil de Golgi. Nous décrivons ici le protocole détaillé de GLIM pour localiser un test de la protéine de l’appareil de Golgi.

Introduction

Le complexe de Golgi joue un rôle essentiel dans sécrétoire/endocytose traite des protéines et des lipides (ci-après les cargaisons) dans les cellules de mammifères,^1,2,3. À l’appareil de Golgi, cargaisons sont non seulement triées dans divers compartiments subcellulaires mais aussi modifiés par divers types de glycosylation. Le complexe de Golgi mammifères se compose de nombreuses cheminées de Golgi latéralement connectées, qui se compose généralement de 4-11 sacs de membrane étroitement adjacentes et plat appelés saccules. Les saccules de Golgi empilées en série sont classé....

Protocole

Remarque : Voici un protocole étape par étape de GLIM pour déterminer la sulfotransférase LQ de EGFP-le tag tyrosylprotéine 1 (TPST1), une enzyme résidente de Golgi, dans les cellules HeLa.

1. préparation des Mini-piles de Golgi marqués par Fluorescence

1. Préparer des lamelles de verre
   1. Aliquote 0,3 mL stérile Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) à un puits d’une plaque 24 puits dans une hotte de culture de tissus.
   2. Effacer un morceau de Φ 12 mm No.1.5 verre couvre-objet à l’aide de papier de soie doux tamponné avec l’éthanol à 70 % pour enlever les débris à la surface de la lamelle de verre. Ut....

Résultats

Microscope photonique grade recherche moderne équipé d’une lentille apochromatique de plan, comme celui utilisé dans notre laboratoire, montre l’aberration chromatique minimale (Figure 2A). Toutefois, un examen attentif de l’image multicolore perle fluorescente peut révéler le déplacement des images de couleur différente du même talon (Figure 2B). Nous définissons que le canal rouge est libre de .......

Discussion

Auparavant, la localisation d’une protéine de Golgi sous le microscope photonique a été principalement quantifiée par le degré de corrélation ou la superposition de l’image de la protéine et l’image d’un marqueur de Golgi de localisation connue^{15,16, 17}. La corrélation obtenue ou coefficient de chevauchement reflète comment fermer la protéine test est le marqueur de Golgi dans l’espace. Il y a au moins trois avertissements rela.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
des billes de fluorescence. Nom commercial : perles TetraSpeck	Invitrogen	T7279	Comme des billes multicolores pour calibrer le décalage chromatique du microscope
Border Glass & Phi ; 12 mm (n° 1,5)	Menzel	CB00120RAC
Border Glass & Phi ; 25 mm (n° 1,5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsine-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
Réactif de transfection. Nom commercial : Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Médium de transfection. Nom commercial : OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	Un don de D. Stephens (Université de Bristol, Bristol, Royaume-Uni)
GalT-mCherry			Fabriqué dans notre labo
paraformoldéhyde	Merck	1.04005.1000
Saponine	Sigma-Aldrich	47036
poly (alcool vinylique) (MW ~31 000). Nom commercial : Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Souris anti-GM130	BD Biosciences	610823	Anticorps primaire pour le GM130 humain
IgG conjugué de bouc conjuguée à fluorescence lointaine, IgG anti-souris. Nom commercial : Alexa Fluor 647 anti-souris conjugué anti-souris	Invitrogen	A-21235	Anticorps secondaire conjugué à fluorescence lointaine