Article de méthode

Localisation quantitative d’une protéine de Golgi Imaging sa masse Centre de Fluorescence

DOI :

10.3791/55996

10 août 2017

Dans cet article

Résumé

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La localisation précise des résidents de l’appareil de Golgi est essentielle pour comprendre les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi. Toutefois, la microscopie optique conventionnelle est incapable de résoudre la structure sub-Golgi. Nous décrivons ici le protocole pour une méthode de Super-résolution microscopie conventionnelle basée déterminer quantitativement la localisation sup-Golgi d’une protéine.

Résumé

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L’appareil de Golgi est constitué de saccules membranaires empilées en série qui peuvent être également classés en régions sub-Golgi, y compris le cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi et trans-réseau de l’appareil de Golgi. Les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi sont déterminées par la répartition de ses protéines résidentes. La résolution spatiale de microscopie optique conventionnelle est trop faible pour résoudre la structure sub-Golgi ou saccules. Ainsi, la microscopie immuno-or est une méthode de choix pour localiser une protéine au niveau sub-Golgi. Cependant, la technique et l’instrument sont au-delà de la capacité de la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Nous décrivons ici notre méthode développée récemment Super-résolution appelée localisation des protéines Golgi par imagerie centres de masse (GLIM) systématiquement et quantitativement localiser une protéine de Golgi. GLIM est basé sur les protocoles d’étiquetage de fluorescence standard et grand champ conventionnel ou microscopes confocaux. Il s’agit de l’étalonnage de l’aberration chromatique-Maj du système microscopique, l’acquisition de l’image et l’analyse postérieure à l’acquisition. La localisation de sub-Golgi d’une protéine test est exprimée quantitativement comme le quotient de localisation. Il existe quatre principaux avantages de GLIM ; C’est rapide, basé sur les outils et les méthodes conventionnelles, le résultat de la localisation est quantitatif, et qu’elle leur offre ~ résolution pratique de 30 nm suivant l’axe de l’appareil de Golgi. Nous décrivons ici le protocole détaillé de GLIM pour localiser un test de la protéine de l’appareil de Golgi.

Introduction

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Le complexe de Golgi joue un rôle essentiel dans sécrétoire/endocytose traite des protéines et des lipides (ci-après les cargaisons) dans les cellules de mammifères,1,2,3. À l’appareil de Golgi, cargaisons sont non seulement triées dans divers compartiments subcellulaires mais aussi modifiés par divers types de glycosylation. Le complexe de Golgi mammifères se compose de nombreuses cheminées de Golgi latéralement connectées, qui se compose généralement de 4-11 sacs de membrane étroitement adjacentes et plat appelés saccules. Les saccules de Golgi empilées en série sont classé....

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Protocole

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Remarque : Voici un protocole étape par étape de GLIM pour déterminer la sulfotransférase LQ de EGFP-le tag tyrosylprotéine 1 (TPST1), une enzyme résidente de Golgi, dans les cellules HeLa.

1. préparation des Mini-piles de Golgi marqués par Fluorescence

  1. Préparer des lamelles de verre
    1. Aliquote 0,3 mL stérile Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) à un puits d’une plaque 24 puits dans une hotte de culture de tissus.
    2. Effacer un morceau de Φ 12 mm No.1.5 verre couvre-objet à l’aide de papier de soie doux tamponné avec l’éthanol à 70 % pour enlever les débris à la surface de la lamelle de verre. Ut....

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Résultats

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Microscope photonique grade recherche moderne équipé d’une lentille apochromatique de plan, comme celui utilisé dans notre laboratoire, montre l’aberration chromatique minimale (Figure 2A). Toutefois, un examen attentif de l’image multicolore perle fluorescente peut révéler le déplacement des images de couleur différente du même talon (Figure 2B). Nous définissons que le canal rouge est libre de .......

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Discussion

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Auparavant, la localisation d’une protéine de Golgi sous le microscope photonique a été principalement quantifiée par le degré de corrélation ou la superposition de l’image de la protéine et l’image d’un marqueur de Golgi de localisation connue15,16, 17. La corrélation obtenue ou coefficient de chevauchement reflète comment fermer la protéine test est le marqueur de Golgi dans l’espace. Il y a au moins trois avertissements rela.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

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Nous tenons à remercier D. Stephens (Université de Bristol, Bristol, Royaume-Uni) pour le plasmide TPST1-EGFP ADN, ainsi que Lakshmi ngassa Govindarajan pour aider à l’optimisation du logiciel. Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le Conseil National de recherches médicales (NMRC/CBRG/007/2012), le ministère de l’éducation (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 et RG132/15 et AcRF niveau 2 MOE2015-T2-2-073) à L.L.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
des billes de fluorescence. Nom commercial : perles TetraSpeckInvitrogenT7279Comme des billes multicolores pour calibrer le décalage chromatique du microscope
Border Glass & Phi ; 12 mm (n° 1,5)MenzelCB00120RAC
Border Glass & Phi ; 25 mm (n° 1,5)Menzel
DMEMCapriconDMEM-HPA-P50
Trypsine-EDTA
FBSGE HycloneSV30160.03
NocodazoleMerck487928
Réactif de transfection. Nom commercial : Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Médium de transfection. Nom commercial : OptiMEMInvitrogen31985070
TPST1-EGFPAddgene66617Un don de D. Stephens (Université de Bristol, Bristol, Royaume-Uni)
GalT-mCherryFabriqué dans notre labo
paraformoldéhydeMerck1.04005.1000
SaponineSigma-Aldrich47036
poly (alcool vinylique) (MW ~31 000). Nom commercial : Mowiol-488CALBIOCHEM475904
BSASigma-AldrichA9647
Souris anti-GM130BD Biosciences610823Anticorps primaire pour le GM130 humain
IgG conjugué de bouc conjuguée à fluorescence lointaine, IgG anti-souris. Nom commercial : Alexa Fluor 647 anti-souris conjugué anti-sourisInvitrogenA-21235Anticorps secondaire conjugué à fluorescence lointaine

Références

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  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215(2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W.

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Mots-clés

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