Quantification des cellules dérivées de donateurs est nécessaire pour contrôler la prise de greffe après greffe de cellules souches chez les patients atteints d’hémoglobinopathies. Une combinaison de tri de cellule axée sur la cytométrie en flux, analyse de la formation de colonie et analyse subséquente du tandem courte répétitions peuvent être employées pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches dans le compartiment érythroïde.
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Article de méthode
Détection de cellules progénitrices de donateurs résiduelle érythroïdes après Transplantation de cellules souches hématopoïétiques pour les Patients ayant des hémoglobinopathies
Dans cet article
Résumé
Résumé
La présence de chimérisme incomplète est notée dans une grande proportion de patients après greffe de moelle osseuse pour la thalassémie ou la drépanocytose. Cette observation a des implications énormes, comme stratégies d’immunomodulation thérapeutique ultérieure peuvent améliorer les résultats cliniques. Conventionnellement, analyse axée sur la réaction en chaîne de la polymérase de séquences répétées en tandem courtes sert à identifier chimérisme dans les cellules de sang provenant de donneurs. Toutefois, cette méthode est limitée aux cellules nucléées et ne peut pas distinguer entre deux lignées unicellulaires dissociées. Nous avons appliqué l’analyse de séquences répétées en tandem courtes à l’écoulement des cellules progénitrices hématopoïétiques triée par cytométrie en flux et comparé cela avec l’analyse de séquences répétées en tandem courte provenant d’unité formant des rafale sélectionnée - colonies érythroïdes, tous deux prélevés dans l’OS moelle osseuse. Avec cette méthode, nous sommes en mesure de démontrer les différente prolifération et la différenciation des cellules du donneur dans le compartiment érythroïde. Cette technique a le droit de compléter la surveillance actuelle de chimérisme dans la greffe de cellules souches définissant et ainsi peut être appliquée à l’avenir les études, de recherche sur les cellules souches et de conception des essais de thérapie génique.
Introduction
La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est l’approche curative disponible uniquement pour une variété de désordres génétiques innées du système hématopoïétique, atteindre des taux de survie sans maladie de plus de 90 % d’ailleurs fortement compromise et durée de vie limitée patients1. L’efficacité de cet outil thérapeutique important a été optimisée en limitant la toxicité de pré- et post transplantation schémas2, mais aussi par des interventions vise à soutenir la fonction du greffon stable, qui est quantifié par un suivi étroit des cellules dérivées donneur3
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Protocole
1. isolement des cellules de moelle osseuse hématopoïétique en triant les cellule activée par Fluorescence multiparamétrique
- échantillon coloration
- avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être collectées et préparé :
- médias de Gradient pour la préparation de mononucléaires cellules tubes (GM), 50 mL conique
- 12 x 75 mm tubes de flux pour la coloration des cellules
- coloration tampon : tampon phosphate salin (PBS) + 3 % de sérum de veau foetal (FCS)
- Pipettes < / l J’ai >
- FC bloc et coloration des anticorps (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Avec cette combinai....
- avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être collectées et préparé :
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Résultats
Séparation des progéniteurs lymphohématopoïétiques en triant les cellules FACS
Nous démontrons ici résultats du tri des populations de cellules nécessaires pour l’analyse en aval de STR. Les cellules de la moelle osseuse ont été colorées avec V450 conjugué anti-CD45, conjugué FITC anti-CD36 et APC conjugué anti-CD34. La population visée est les mégacaryocyte progéniteurs (MEP), nucléées les cellules érythroïdes .......
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Discussion
L’objectif de la présente étude est de fournir au public une combinaison des deux approches pour analyser chimérisme donneur/receveur en progéniteurs érythroïdes suite tcsh chez les patients traités pour hémoglobinopathies : 1.) activés par fluorescence cellulaire tri des cellules souches hématopoïétiques dans des échantillons de moelle osseuse suivies d’analyse de séquences répétées en tandem courtes et 2.) unité formant colonie de plus en plus de cellules de moelle osseuse, classification des colonies dans divers types.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 ; | Supprimer les globules rouges |
| Tubes coniques de 50 mL | Falcon | 14-432-22 | Préparation d’échantillons |
| 12 tubes d’écoulement de 75 mm | Falcon | 352002 | Tri FACS |
| Solution saline tamponnée | au phosphate Gibco | 10010023 | PBS |
| Sérum de veau fœtal | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (inactivé par la chaleur) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Comptage automatique des cellules |
| Hank' s Solution saline équilibrée | Gibco | 14025092 | Tampon de suspension dans l’analyse FACS |
| HEPES | Gibco 15630080 | Composant du tampon de suspension | |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Bloc FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | Trieur FACS |
| Recombinant ; érythropoïétine humaine | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove s Dulbecco modifié' s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Composant du milieu de culture |
| CD34+ billes magnétiques | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ |
| purification Recombinant ; humain G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant ; humain SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant ; humain GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant ; humain IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant ; humain IL-6 | BD Bioscience Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 | Medium Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Kit d’extraction de sang | Qiagen | 51306 | Isolation de l’ADN |
| Nanodrop ND-1000 spectrale | photomètre Thermo Scientific | ND 1000 | Quantification de l’ADN |
| DNAase libre H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | Préparation de l’ADN |
| AmplTaq Gold DNA polymérase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR ; |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Taille standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Analyseur génétique | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
Références
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J.
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Réimpressions et autorisations
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