Capture interactine d&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux

Zhicheng Zhang; Kurt Boonen; Meixia Li; Koen Geuten

doi:10.3791/56011

Article de méthode

Capture interactine d'ARNm à partir de protoplastes végétaux

9.1K vues

⸱

DOI :

10.3791/56011

⸱

28 juillet 2017

Zhicheng Zhang¹ , Kurt Boonen¹ , Meixia Li¹ , Koen Geuten¹

¹Department of Biology, KU Leuven

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de capture interactif appliqué aux protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana . Cette méthode repose de manière critique sur la réticulation UV in vivo et permet l'isolement et l'identification des protéines de liaison de l'ARNm de la plante à partir d'un environnement physiologique.

Résumé

Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) déterminent le sort des ARN. Ils participent à toutes les voies de la biogenèse de l'ARN et contribuent en particulier à la régulation post-transcriptionnelle des gènes (PTGR) des ARN messagers (mRNA). Au cours des dernières années, un certain nombre de protéomes liés à l'ARNm provenant de lignées de levure et de cellules de mammifères ont été isolés avec succès en utilisant une nouvelle méthode appelée "capture d'interconnexion d'ARNm", qui permet l'identification de protéines de liaison d'ARNm (mRBP) Directement à partir d'un environnement physiologique. Le procédé se compose de in vivo perles ultraviolet (UV) réticulation, pull-down et une purification des complexes de ribonucléoprotéine messager (les mRNP) par oligo (dT), et l'identification ultérieure des protéines réticulées par spectrométrie de masse (MS). Très récemment, en appliquant la même méthode, plusieurs protéomes liés à l'ARNm de plantes ont été signalés simultanément à partir de différentes sources de tissus d' Arabidopsis : semis étiolés, tissu de feuilles,Les protoplastes de mésophylle des feuilles et les cellules racines cultivées. Ici, nous présentons la méthode optimisée de capture de l'interaction de l'ARNm pour les protoplastes de la mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana , un type de cellule qui sert d'outil polyvalent aux expériences qui incluent divers essais cellulaires. Les conditions pour un rendement optimal en protéines comprennent la quantité de tissu de départ et la durée de l'irradiation UV. Dans le protéome lié à l'ARNm obtenu à partir d'une expérience à moyenne échelle (10 ⁷ cellules), les RBP ont constaté que la capacité de liaison à l'ARN était surreprésentée et de nombreuses RBP nouvelles ont été identifiées. L'expérience peut être mise à l'échelle (10 ⁹ cellules), et la méthode optimisée peut être appliquée à d'autres types et espèces de cellules végétales pour isoler, cataloguer et comparer les protéomes liés aux ARNm dans les plantes.

Introduction

Les eucaryotes utilisent plusieurs voies de régulation de la biogenèse de l'ARN pour maintenir les processus biologiques cellulaires. Parmi les types connus d'ARN, l'ARNm est très diversifié et porte la capacité de codage des protéines et leurs isoformes ^1. La voie PTGR dirige le sort des pré-ARNm ² ^, ³ . Les RBP de différentes familles de gènes contrôlent la régulation de l'ARN, et dans PTGR, les mRBP spécifiques guident les ARNm par des interactions physiques directes, formant des mRNP fonctionnels. Par conséquent, l'identification et la caractérisation des mRBP e....