Lymphome du manteau (MCL) est difficile à traiter la maladie de lymphocytes B et il est tout aussi difficile d’établir un modèle de souris de xénogreffe de MCL primaire pour étudier et développer des produits thérapeutiques. Nous décrivons ici la mise en place réussie des xénogreffes MCL chez les souris pour aider à comprendre sa biologie sous-jacente.
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Article de méthode
Greffe de la tumeur dans un modèle murin de xénogreffe de lymphome du manteau homme
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les lymphocytes B sont des acteurs essentiels dans la circulation de cellules immunitaires et ils abritent principalement et résident dans les organes lymphoïdes. Tandis que les cellules normales de B se multiplient uniquement quand ils sont stimulés par les lymphocytes T, oncogènes B cellules survivent et développez autonome dans des créneaux orgue indéfini. Lymphome du manteau (MCL) est un tel désordre de lymphocytes B, où le taux de survie médiane des patients est 4-5 ans. Cela nécessite le besoin de mécanismes efficaces par lesquels le homing et la prise de greffe de ces cellules sont bloqués afin d’augmenter la survie et la longévité des patients. Par conséquent, les efforts pour développer un modèle de xénogreffe de souris pour étudier l’efficacité de la thérapeutique de la MCL en bloquant l’autoguidage mécanisme in vivo sont primordial. Développement des bénéficiaires animales pour la xénotransplantation de cellules humaines pour tester des médicaments de stade précoce ont longtemps été poursuivies, comme modèles murins précliniques pertinentes sont cruciales pour nouveaux agents thérapeutiques écran. Ce modèle animal est développé afin d’éviter le rejet du greffon humain et d’établir un modèle pour les maladies humaines, et il peut être un outil extrêmement utile pour étudier la progression de la maladie de types différents de lymphomes et d’effectuer des essais précliniques de médicaments candidats pour malignités hématologiques, comme MCL. Nous avons établi un modèle de xénogreffe de souris qui service une excellente ressource pour étudier et développer de nouvelles approches thérapeutiques pour MCL.
Introduction
Lymphocytes par nature jouent un rôle majeur dans la surveillance du système immunitaire, et traite des lymphocytes est une étape essentielle dans le montage de l’immunité spécifique de l’antigène1,2. Ce processus comprend la migration des lymphocytes naïfs T du thymus dans le flux de sang et de là vers les organes lymphoïdes secondaires, y compris les ganglions lymphatiques, rate ou plaques de Peyer où ils rencontrent les antigènes apparentés. Les lymphocytes B se différencient dans la moelle osseuse et migrent comme cellules naïves dans les follicules des organes lymphoïdes secondaires3. Certaines de ces cellules B lient à l’antigène avec leurs récepteurs et sont activées par les cellules T spécifiques. Prolifération et la différenciation de ces cellules B pousse les cellules naïves B non-activé, dans la zone du manteau du follicule. Les lymphocytes activés peuvent alors se différencier en mémoire B cellules qui patrouillent le corps, ou deviennent des immunoglobulines sécrétant des plasmocytes qui migrent de la moelle osseuse4.
MCL se produit lorsque les lymphocytes naïfs B dans la zone du manteau se transforment en une tumeur. Ces cellules de lymphome résident dans le micro-environnement des organes lymphoïdes et prolifèrent indépendamment de contrôle spécifique des lymphocytes T. Cependant, à un certain stade de densité ils échappent à ce créneau et circuler dans le sang à la recherche de niches dans d’autres organes. Compte tenu de la complexité des molécules d’adhésion et la promiscuité des chimiokines et leurs récepteurs, le mécanisme de ce cellulaire traite in vivo est mal compris et par conséquent freine la thérapie. Méthodes novatrices sont nécessaires pour bloquer efficacement ce processus de migration pour empêcher les cellules de lymphome B d’atteindre des micro-environnements nouvelles.
MCL est l’un des plus difficiles à traiter les tumeurs malignes de cellules B. Le développement d’un phénotype néoplasique du MCL est le résultat d’une cascade de plusieurs étapes, que se caractérise par l’acquisition de propriétés biologiques uniques. Au moment du diagnostic, la plupart des patients (70 %) est déjà présent avec une maladie disséminée, avec une majorité de cas présentant extraganglionnaires implication dans la rate, la moelle osseuse, et/ou le tractus gastro-intestinal5,6. Chez les patients traités, rechute de tumeurs résistantes dans les prochaines années est commun, même si la chimiothérapie conventionnelle induit des taux de rémission élevé à court terme7,8. Nous présentons un nouveau modèle de la maladie qui peut aider à comprendre la diffusion de la MCL et sa biologie sous-jacente : nous avons établi un modèle de souris de xénogreffe MCL humain provenant des cellules de la tumeur primitive des patients. Nous espérons que ce modèle permettra de développer des stratégies thérapeutiques contre la diffusion de la MCL et éventuellement offrir de nouvelles perspectives cliniques pour diagnostic optimal et le traitement des patients récidivants.
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Protocole
Les échantillons de sang humain ont été utilisés conformément aux procédures approuvées par l’éthique locale et les comités de l’expérimentation humaine de l’hôpital universitaire de Genève.
Procédures d’animaux ont été effectuées conformément à l’institutionnel éthique Comité of Animal Care à Genève (Suisse) et l’Office vétérinaire Cantonal (numéro d’autorisation : GE/26/15).
1. préparation des cellules mononucléaires de sang périphérique primaire (PBMC) par séparation Gradient de densité
Remarque : 3 à 5 mL de sang périphérique provenaient de patients qui présentent des MCL dans une phase leucémique. Le diagnostic a été établi selon les critères de diagnostique pour la cytométrie en flux (CD5 +, CD23−, CD200 +, population monoclonale de lymphocytes B) et par la suite confirmé par la présence de la translocation chromosomique t(11;14) et la surexpression de la cycline D1. Dans tous les cas, les cellules B monoclonales constituaient à > 90 % de la population totale des cellules B. Les cellules restantes étaient principalement des monocytes et des lymphocytes T.
- Diluer 5 mL (1:1) de l’échantillon de sang MCL avec 5 mL de milieu de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (Figure 1 a).
- Inverser les médias de gradient de densité (Table des matières) plusieurs fois avant de l’utiliser afin d’assurer un mélange complet.
- Ajouter 5 mL de média gradient de densité dans un tube à centrifuger 15 mL à l’aide d’un aspirateur de pipette.
- La couche doucement l’échantillon de sang dilué sur les médias de gradient de densité dans le tube à centrifuger 15 mL à l’aide d’un aspirateur (le sang à rapport de médias de gradient de densité devrait être de 2:1, par exemple, 10 mL de sang à 5 mL de média gradient de densité). Il faut pour pas mélanger les deux calques (Figure 1 b, C).
- Centrifuger l’échantillon à 400 g pendant 40 minutes à température ambiante avec les freins de la centrifugeuse est éteint.
- À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, aspirez doucement la couche intermédiaire (anneau blanchâtre et mince marqué d’une flèche (Figure 1, E As EventArgs)) contenant les cellules mononucléaires et transférez-les dans un tube propre.
- Lavage des cellules mononucléaires
- Estimer le volume de la suspension cellulaire transféré et y ajouter 3 volumes de stérile 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).
- La composition de la suspension de pipetage et descendre plusieurs fois.
- Centrifuger la suspension à 400-500 g pendant 10-15 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant pour obtenir le culot cellulaire et répéter l’étape de lavage.
- Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le volume souhaité, par exemple, 1 ou 2 mL de PBS.
- Compter le nombre de cellules par un compteur de cellules automatisées ou manuellement à l’aide d’un hémocytomètre (chambre de Neubauer).
2. l’enrichissement des cellules B par sélection négative de lymphocytes B
- Diluer les cellules à une concentration finale de 50 x 106 cellules/mL dans du PBS.
- Transférer les cellules dans un tube polystyrène fond rond de 5 mL. Ajouter 100 µL d’anticorps cocktail de la trousse d’enrichissement de lymphocytes B à 2 mL de suspension cellulaire et mélanger doucement en pipettant également, haut et bas (Figure 2-1).
- Incuber les cellules à température ambiante pendant 10 min.
- Brièvement vortex les particules magnétiques fourni dans le kit de l’enrichissement de lymphocytes B pour 30 s (Figure 2-2). Ajouter 150 µL des particules magnétiques à 2 mL de l’échantillon.
- Incuber l’échantillon pendant 5 min à température ambiante.
- Porter le volume de l’échantillon à 2,5 mL avec 1 x PBS contenant 2 % de sérum de veau foetal (FCS) et de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM. Placer le tube dans l’aimant et incuber le tube pendant 3-5 min (Figure 2-3).
- Ramasser l’aimant avec le tube en place et, d’autre part, dans un mouvement continu, décanter le tube pour que la suspension cellulaire enrichi est recueillie dans un nouveau tube (Figure 2-4). Compter les cellules par un compteur de cellules automatisées ou manuellement à l’aide d’un hémocytomètre pour obtenir le rendement total des cellules B.
Remarque : En général, le rendement est environ 105 B cellules/mL pour la normale des cellules de B et 5-50 x 106 cellules/mL pour MCL. - Confirmant la pureté de l’enrichissement des cellules B
- Prendre ~ 50 000 cellules et incuber les cellules avec des anticorps anti-CD19/CD20 (01:20 dilution) et les anticorps anti-CD45 couplés à des fluorochromes différents (01:10 dilution) à température ambiante pendant 15 à 30 min.
- Laver avec 1 mL de 1 x PBS + 1 % de BSA, centrifuger les cellules à 400-500 g pendant 5 min et remettre en suspension les cellules de ~ 200 µL de PBS.
- Acquérir les échantillons de cellules par cytométrie en flux et analyser pour la pureté des cellules B. La pureté est la plupart du temps > 90 % par cette méthode (Figure 3).
3. développement de la modèle de xénogreffe de souris
- Suspendre environ 40 à 60 x 106 cellules pour 150-200 µL de PBS 1 x (volume nécessaire d’injecter par souris).
- Injecter 150 µL de la suspension cellulaire par voie intraveineuse (i.v.) dans chaque veine de queue de 6-7 semaine vieux NOD scid gamma (NSG) des souris immunodéficientes quel que soit le sexe (Figure 4 a).
- Laissez les souris développer le lymphome humain pendant environ 10 semaines.
Remarque : Les cellules de lymphome humain primitif prennent beaucoup plus de temps pour développer des tumeurs par rapport aux lignées de cellules de lymphome humain (environ 3 semaines). - Quand les animaux commencent à montrer des symptômes d’une maladie mortelle comme la perte de poids, cheveux ébouriffé, diminution de l’activité, paralysie des membres postérieurs, etc., sacrifier les souris en CO2 asphyxie suivie par ponction cardiaque coeur d’obtenir le sang.
- Recueillir différents organes comme la moelle osseuse, rate et le foie en disséquant les souris et recueillir le sang périphérique de prélever le sang du coeur au moment du sacrifice pour l’analyse de prise de greffe tumorale (Figure 4 b -F).
4. chimérisme analyse des cellules de tumeur implanté dans différents organes
- Après avoir recueilli les différents organes, les traiter par rupture mécanique pour générer des suspensions de cellules unique après la lyse des globules rouges (RBC) avec 200 µL de 1 x tampon de potassium chlorure d’ammonium pour le sang et la moelle osseuse, 500 µL de rate et 2 mL pour du foie .
- Compter et tacher les cellules à l’aide d’anticorps spécifiques de cellules B humaines, c'est-à-dire, anti-CD19, anti-CD20 et anti-CD45.
NOTE : Souris NSG manquent de cellules B et donc pour l’analyse, les cellules sont colorées avec des marqueurs de cellules de B humaines spécifiques. - Analyser les cellules dérivées de chaque organe par cytométrie de blocage sur les cellules B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
- Quantifier les cellules tumorales implantée dans différents organes provenant de souris MCL injecté basés sur les cellules fermées comme indiqué dans l’étape 4.3 (Figure 4).
Remarque : Consultez la Table des matières pour plus de détails.
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Résultats
Le manuscrit décrit un protocole optimisé pour la mise au point d’un modèle de souris de xénogreffe pour greffe de cellules MCL. Préparation d’une population de cellules pur (dans ce cas cellules MCL), est très essentiel d’élaborer des xénogreffes MCL réussies. La figure 1 représente les étapes préparatoires pour l’isolement de cellules mononucléées du sang du patient MCL de séparation gradient de densité. Les cellules mononucléaires sont traitées ultérieurem...
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Discussion
Les essais cliniques sont possibles pour les médicaments qui sont à un stade avancé de développement, mais ne peut pas être utilisés pour la découverte de médicaments. Efforts visant à développer les animaux receveurs pour la xénotransplantation de cellules humaines afin de tester des médicaments de stade précoce ont longtemps été poursuivi. Nous présentons ici un modèle animal qui évite le rejet du greffon humain et peut établir un modèle pour les maladies humaines, comme le MCL. À l’heure actuelle, c’est un modèle de x...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Ligue Genevoise contre le Cancer, Fondation Dr Dubois Ferrière Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 et 2914-02-2012 et Swiss National Science Foundation Grant 31003A_156760 et 310030-153456.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu Ficoll-paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | pour la séparation de cellules mononucléées |
| RPMI Medium 1640 | Gibco-Life technologies | 61870-010 | pour la dilution d’un échantillon de sang |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | lavage de cellules |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | pour la préparation du PBS avec 1 % de BSA utilisé dans le lavage des cellules pendant l’isolement |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | marqueur de cellules pan-B humaines |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | marqueur de cellules pan-B humaines |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | marqueur de cellules pan-B humaines |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | marqueur |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | Protéine de surface cellulaire généralement absente dans MCL |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | Marqueur pan-leucocytaire |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | Protéine de surface cellulaire généralement absente chez les souris MCL |
| NOD scid gamma (NSG) | Charles River Laboratories | 5557 | utilisée pour développer des xénogreffes MCL dans cette étude |
| Kit d’enrichissement de cellules B humaines faciles à utiliser | de cellules souches | 19054 | utilisées pour enrichir les cellules B afin d’obtenir des cellules pures à injecter dans |
| des souris FACS Beckman | Coulter | Navios | utilisé pour caractériser l’échantillon de MCL et pour étudier les organes pour la greffe de MCL |
| 1X chlorure d’ammonium tampon | tampon de lyse du sang rouge (NH4Cl 8 024 mg/l ; KHCO3 1 001 mg/l ; EDTA. Na2 et point moyen ; 2H2O 3,722 mg/l ) |
Références
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- Baggiolini, M. Chemokines and leukocyte traffic. Nature. 392, 565-568 (1998).
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Réimpressions et autorisations
