Les kératinocytes épidermiques forment une barrière fonctionnelle de la peau et sont positionnés à la ligne de front de la défense de l'hôte contre les insultes environnementales externes. Nous décrivons ici des méthodes d'isolement et de culture primaire de kératinocytes épidermiques provenant de peau de souris néonatale et adulte, et l'induction de la différenciation terminale et la réponse inflammatoire déclenchée par les UVB des kératinocytes.
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Article de méthode
Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le kératinocyte (KC) est le type de cellule prédominante dans l'épiderme, la couche la plus externe de la peau. Les KC épidermiques jouent un rôle essentiel dans la défense de la peau en formant une barrière cutanée intacte contre les insultes environnementales, telles que l'irradiation UVB ou les agents pathogènes, et aussi en déclenchant une réponse inflammatoire à ces insultes. Nous décrivons ici des méthodes pour isoler les KC de la peau néonatal de la souris et de la peau de queue de souris adulte. Nous décrivons également des conditions de culture utilisant des suppléments de croissance définis (dGS) par rapport au sérum bovin fœtal chelexé (cFBS). Fonctionnellement, nous montrons que les KC néonatals et adultes répondent très bien à une différenciation terminale élevée due au calcium, à une formation de jonction étroite et à une stratification. En outre, les KC adulte cultivés sont sensibles à la mort cellulaire déclenchée par les UVB et peuvent libérer de grandes quantités de TNF lors de l'irradiation UVB. Ensemble, les méthodes décrites ici seront utiles aux chercheurs pour la mise en place d'un modèle in vitroS pour étudier la biologie épidermique chez la souris néonatal et / ou la souris adulte.
Introduction
La peau est le plus grand organe du corps avec l'épiderme comme couche extérieure. L'épiderme joue un rôle essentiel dans la formation d'une barrière épidermique intacte pour séparer le corps de l'environnement et empêche ainsi la perte d'eau et protège contre les insultes environnementales telles que les allergènes, les agents pathogènes et l'exposition aux UVB. L'épiderme se développe à partir d'une seule couche de kératinocytes basaux indifférenciés (KC) en un épithélium stratifié multicouches constitué d'une couche basale, suivie d'une couche épineuse, d'une couche granulaire et d'un stratum corneum. Les KC basales, constituées à la fois par des cellules souches épidermiques et par des cellules amplificatrices de transit, sont prolifératives et indifférenciées. À mesure que les KC basal sortent du cycle cellulaire, les cellules s'engagent à se différencier et migrent progressivement vers la surface de l'épiderme, accompagnées de la maturation des jonctions cellule-cellule et de la formation d'une barrière de perméabilité épidermique (EPB). Les KC à la couche épineuse expriment des différences précocesMarqueurs d'ions tels que la kératine 10 (K10); Lorsque les KC migrent vers la couche granulaire, les cellules expriment des marqueurs de différenciation tardive tels que Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) et Involucrin (INV). À la stratum corneum, les KC deviennent des cornéocytes terminés en différé, qui sont finalement rejetés par desquamation à mesure que de nouvelles cellules les remplacent.
Le calcium est considéré comme l'agent le plus physiologique dans l'épiderme et déclenche une différenciation in vitro et in vivo d'une manière similaire. Dans l'épiderme cutané normal, les ions calcium forment un «gradient de concentration» caractéristique, augmentant en concentration vers la surface de la peau 1 , 2 , 3 . La concentration de calcium provient de niveaux faibles dans les sous-couches les plus basses (couches basales et épineuses) jusqu'à un pic dans la couche granulaire supérieure, puis tombe à des niveaux négligeables dans la couche la plus superficielle (stratum corneum). Le gradient de calcium se développe également de manière coïncidente avec l'émergence d'une barrière de perméabilité des composants, qui soutient que la signalisation de calcium joue un rôle essentiel dans la différenciation KC. In vitro , le faible calcium (0,02-0,1 mM) maintient la prolifération des KC basiques comme monocouche, alors que le calcium élevé (> 0,1 mM) induit un engagement rapide et irréversible des cellules à la différenciation terminale, comme en témoigne la formation et l'induction de la jonction étroite De LOR et INV sur un traitement de calcium élevé aux KC basiques 4 , 5 .
En plus de la formation de barrière, les KC épidermiques sont également un élément important du système immunitaire inné de la peau. En réponse à des agents pathogènes ou à des modèles moléculaires associés endommagés (DAMP) libérés lors d'une irradiation ou d'une lésion UVB, les KC peuvent produire de grandes quantités de cytokines inflammatoires, telles que TNFα, IL6 et IFNβ, conduisant à une activation du système immunitaire> 6 , 7 , 8 , 9 . Bien qu'une signalisation inflammatoire appropriée des KC soit requise pour le dépistage des agents pathogènes, une réponse inflammatoire incontrôlée peut déclencher le développement de maladies de la peau auto-inflammatoires, telles que le psoriasis et la rosacée 6 , 8 .
Dans l'ensemble, les KC jouent un rôle essentiel dans le maintien de la barrière cutanée intacte et l'initiation d'une réponse immunitaire contre l'invasion des agents pathogènes ou les insultes environnementales. Par conséquent, la culture primaire des KC épidermiques est une technique utile pour étudier la biologie épithéliale, la différenciation KC, ainsi que les réponses immunitaires innées stimulées par KC. L'isolement et la culture des KC épidermiques primaires de souris peuvent être un processus difficile en raison de la sensibilité et de la sensibilité de KC à divers stimulants externes. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler et culture-KC de la peau néonatal de la souris ouPeau de queue de souris adulte. Pour l'isolement KC pour adultes, nous n'utilisons pas la peau dorsale de la souris car l'isolement de quantités suffisantes de KC viables à partir de ce tissu peut être difficile pour les raisons suivantes: Premièrement, la peau dorsale adulte à la phase de repos du cycle des cheveux (telogène) se compose d'un Épiderme mince avec seulement 1-2 couches de cellules, conduisant à un faible rendement cellulaire et une séparation inefficace de l'épiderme du derme, étape cruciale pour l'isolement KC réussi. Deuxièmement, la densité du follicule capillaire élevée sur la peau dorsale adulte contribue davantage à la difficulté à séparer l'épiderme du derme. Au lieu de cela, nous utilisons systématiquement la peau de la queue comme source de KC de souris adultes car cet épithélium est plus épais avec 3 à 5 couches de KC épidermiques. Il a également une densité de follicule capillaire plus faible, ce qui n'interfère pas avec la séparation épidermique, ce qui permet l'isolement KC de toute peau de queue de souris adulte, quel que soit l'âge et le stade de cyclisme des cheveux de la souris. La neona isoléeLes KC sont ensemencés dans des plats de culture revêtus de gélatine, tandis que les plats revêtus de collagène sont utilisés pour semer des KC adultes isolés en raison de la capacité altérée des cellules adultes à adhérer par rapport à leurs homologues néonatals. Pour la culture de KC de souris, le milieu basal de calcium faible est complété par dGS, qui contient le facteur de croissance épidermique (EGF), la transferrine bovine, le facteur de croissance analogue à l'insulinec1 (IGF1), la prostaglandine E2 (PGE2), l'albumine de sérum bovin (BSA) et l'hydrocortisone. Entre 2 à 4 jours après le plaquage initial, la plupart des KC différenciés peuvent être éliminés pendant les changements quotidiens du milieu, et les cellules adhérentes restantes présentent une morphologie typique en cobond 4 , prolifèrent et n'expriment pas le marqueur de différenciation précoce K10.
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux sont approuvées par le comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux de l'UCSD.
1. Isolation et culture primaire de la souris KC contre la peau néonatale
- Sacrifiez les néonats post-nés 0-2 de la souche de souris de type sauvage C57B / 6 par décapitation à l'aide de ciseaux. Coupez les membres juste au-dessus des articulations du poignet et de la cheville, puis coupez complètement la queue, laissant un petit trou.
- Pour éplucher toute la peau, insérez d'abord des ciseaux tendus à travers le trou à la queue et coupez la peau le long de la ligne médiane dorsale du corps jusqu'à l'ouverture sur le cou. Ensuite, utilisez une pince pour saisir le corps exposé et l'autre pince pour saisir la peau et éplucher doucement la peau entière du corps et sur les souches de la jambe avec un mouvement continu.
- Épluchez la peau comme une pièce intacte et faites attention de ne pas casser la peau en morceaux, car cela entraînera une perte de cellule pendant l'étape de la dispase.
- Rincer la peau pelée avec 15 ml de PBS stérile dans une boîte de Pétri de 10 cm, puis placer la peau de chaque chiot dans un tube de 2 ml rempli de tampon de digestion à base de glace, contenant 4 mg / ml de dispase dans du milieu de croissance KC (Le milieu basal KC a 0,06 mM CaCl 2 , dGS et antibiotiques / antimycotiques).
REMARQUE: Plusieurs isolats de peau peuvent être combinés et incubés dans un tube de 15 mL (jusqu'à 5 peaux par tube) contenant 12 ml de solution dispersée. Incuber le tube de peau pendant une nuit dans un réfrigérateur à 4 ° C sur un rotateur.- Assurez-vous que la peau n'est pas pliée dans le tube, car cela entraînera une exposition insuffisante de la région pliée à la solution dispersée.
- Le lendemain (après 12-18 h dans le dispase), transférez la peau avec la solution de dispase dans une boîte de Petri. Transférer chaque morceau de tissu dans une nouvelle boîte de Petri avec 15 ml de PBS stérile pour éliminer les excès de dispase.
- En utilisant deux paires de pinces, saisissez la peau de PBS,Soulève la peau et transfère à une nouvelle boîte de Petri avec le côté épidermique vers le bas et le derme vers le haut. Étendez soigneusement les plis de la peau afin de l'étendre complètement sur la boîte de Petri.
- Placez 500 μL d'une solution de digestion à base de trypsine pour chaque peau dans une nouvelle boîte de Petri. À l'aide d'une pince, soulevez lentement le derme et éloignez-vous de l'épiderme, tout en maintenant l'épiderme vers le bas. Éliminer le derme sous forme de matériau dangereux pour la santé. Transférer l'épiderme séparé et flotter sur chaque goutte de solution de trypsine avec la couche basale vers le bas.
- Si l'épiderme est plié sur la solution de trypsine, éliminer les plis à l'aide d'une pince pour assurer une digestion efficace des KC basiques de l'épithélium.
- Incuber la peau sur une boîte de Petri dans une solution de trypsine à température ambiante (avec le couvercle recouvert) sur un agitateur horizontal avec agitation douce pendant 20 min.
- Ajouter 2 ml de milieu de croissance KC additionné par épiderme (environ 1 pouce carré de taille parÉpiderme) à la boîte de Petri. Saisissez l'épiderme à l'aide d'une pince et frottez vigoureusement l'épiderme d'avant en arrière pour libérer des cellules individuelles de la feuille épidermique.
- Regardez le milieu devenir de plus en plus trouble car les cellules sont détachées de l'épiderme. Inclinez la boîte de Petri pour collecter et transférer la suspension de cellules dans un nouveau tube en laissant la feuille épidermique restante sur le plat.
- Répétez encore deux fois le frottement de la feuille épidermique après avoir ajouté 2 mL de milieu de croissance KC et combinez les suspensions de cellules dans le même tube.
- Pipeter doucement la solution cellulaire à plusieurs reprises pour casser les bourrelets cellulaires à l'aide de la pipette sérologique appropriée, puis passer à travers un filtre de 100 μm dans un nouveau tube de centrifugation de 50 ml.
- Centrifuger les cellules filtrées pendant 5 min à 180 x g.
- Aspirer le surnageant et restreindre doucement le culot cellulaire dans 1 ml de milieu de croissance / épiderme de KC froid.
- Comptez les cellules par un hémocytomètre.
NOTE: Les KC peuvent se différencier spontanément en suspension, de sorte que les cellules doivent être plaquées dès que possible après l'isolement pour assurer une performance optimale des cellules. Nous recommandons de placer les cellules sur de la glace en comptant car cela réduira le taux de différenciation spontanée de KC. - Graisser les cellules à une densité de 5 x 10 4 / cm 2 dans un milieu de croissance KC dans des boîtes de culture pré-revêtues d'un produit de matrice extracellulaire (ECM) qui favorise la fixation des cellules.
REMARQUE: Nous utilisons un produit commercial disponible (p. Ex. Facteur de fixation, qui est un matériau de revêtement à base de gélatine (voir la Table des matériaux pour plus de détails). Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C et du milieu frais Réapprovisionné tous les deux jours.- Pour revêtir, revêtir les boîtes de culture avec le matériau de revêtement de fixation de la cellule réchauffé à température ambiante pendant 10 min à 2 h avant l'ensemencement cellulaire. Supprimer le facteur de fixation juste avantEn ajoutant la suspension cellulaire.
- Changez le milieu 24 h après le placage initial pour éliminer les cellules non attachées, et changez le milieu tous les jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence souhaitée avant l'expérience.
2. Isolation primaire de la souris KC de la peau de queue adulte
- Sacrifiez une souris C57BL / 6 adulte (de préférence entre 6-15 semaines d'âge, soit mâle, soit femelle) selon la réglementation des installations animales. Coupez la queue hors du corps à partir de la base de la queue et coupez ~ 2 mm de la pointe de la queue de sorte qu'il y ait un trou visible à la pointe.
- Pour éplucher la peau de la queue, utilisez d'abord une lame tranchante pour couper la peau de la queue de la base à la pointe de la queue. Ensuite, utilisez une pince pour saisir l'os de la queue exposée et l'autre pince pour saisir la peau et éplucher doucement la peau de la queue de l'os avec un mouvement continu. Couper la peau pelée du milieu de la ligne afin que chaque pièce soit moins longue de 2-3 cm.
- Rincer l'esprit de peau peléeH 15 ml de PBS stérile dans une boîte de Pétri de 10 cm, puis placer la peau de chaque queue dans un tube de 2 ml rempli de tampon de digestion à base de glace (dispase de 4 mg / ml dans un milieu de croissance KC).
REMARQUE: Plusieurs morceaux de peau peuvent également être combinés et incubés dans un tube de 15 ml (jusqu'à 5 queues par tube) contenant 12 ml de solution dispersée.- Incuber le tube de peau pendant une nuit dans un réfrigérateur à 4 ° C sur un rotateur.
- Effectuez les étapes 1.4 à 1.13 pour isoler la suspension de cellule unique de l'épiderme de la queue.
- Graisser les cellules adultes à une densité de 10 x 10 4 / cm 2 (compté par un hématocytomètre) en milieu de croissance KC dans des boîtes de culture pré-revêtues de collagène.
REMARQUE: Nous utilisons un kit de revêtement à base de collagène disponible dans le commerce (voir la Table des matériaux pour plus de détails). Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C, et le milieu frais a été reconstitué tous les deux jours. En général, le cLes plats d'ulture devraient être revêtus de collagène pendant 30 minutes à 1 heure avant l'ensemencement cellulaire. Nous observons qu'il existe une amélioration significative de la fixation KC adulte dans le plat lorsqu'il est revêtu de collagène par rapport au facteur de fixation, qui est un matériau de revêtement à base de gélatine. - Changez le milieu 24 h après le placage initial pour éliminer les cellules non attachées, et changez le milieu tous les jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence souhaitée avant l'expérience.
3. La différenciation in vitro des KC par le calcium élevé
- Pour induire une différenciation terminale, ajouter du CaCl 2 à 0,2 mM dans le milieu de culture.
- Alternativement, affamer les KC cultivés pendant la nuit sans addition de suppléments de croissance dans un milieu basal KC à faible teneur en calcium avant l'addition de calcium élevé.
NOTE: La famine du facteur de croissance améliorera l'engagement des cellules dans la différenciation précoce et l'induction de marqueurs de différenciation précoce, tels que K10 5 .
4. Mortalité cellulaire médiatisée par irradiation UVB et sortie TNFα des KC
- Culturez les KC de la souris dans le milieu de croissance KC (dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C) avec un changement de milieu quotidien jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence. Immédiatement avant l'irradiation UVB, retirer le milieu de croissance et remplacer par 500 μL de PBS. Ensuite, soumettez les cellules à 25 mJ / cm 2 UVB ou à la commande simulée (sans UVB).
NOTE: L'irradiation UVB est réalisée à l'aide de lampes UVB portables avec deux ampoules de 8 W (312 nm) comme décrit précédemment 10 . Après irradiation UVB, le PBS est aspiré et le milieu frais est ajouté. - Mesurer et quantifier la viabilité cellulaire par le dosage de la cellule CCK-8 à 6, 8 et 24 heures après traitement UVB suivant les instructions du fabricant 11 .
- Recueillir le milieu conditionné des KC traités avec UVB aux points de temps souhaités et mesurer le TNFα libéréDans le milieu conditionné par le kit ELISA Mouse TNF (Mono / Mono) suivant les instructions 7 , 12 du fabricant.
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Résultats
La différenciation terminale induite par le calcium élevé des KC néonatals et adultes. L'épiderme de souris primaire KCs plaquée et maintenue à 0,06 mM de CaCl 2 a augmenté en monocouche, et les cellules individuelles ont une forme polygonale avec un espace intercellulaire distinct, montrant un aspect pavimenteux lorsque confluentes (figure 1A et la figure 2A). L'élévation du CaCl 2...
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Discussion
L'épiderme de la peau fonctionne comme une barrière critique pour séparer et protéger le corps de l'environnement extérieur et des dommages causés par la perte d'eau, les agents pathogènes, la chaleur et l'irradiation UV. Les KC sont la lignée cellulaire prédominante de l'épiderme, et la culture primaire de KC épidermiques est un outil utile pour étudier et comprendre les processus biologiques de formation de barrière et la réponse des KC aux insultes environnementales in vitro .
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l'octroi de l'INSTITUT NATIONAL DE L'ARTHRITE ET DES MALADIES MUSCULOSKÉLÉTIQUES ET DE LA PEAU (R01AR069653 à Zhang LJ) et des National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 à CA).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 nouveau-nés ou souris adultes de type sauvage | Jackson Laboratory | 000664 | Les souris de type sauvage (achetées à l’origine au Jackson Laboratory) sont élevées et maintenues dans un vivarium pour animaux à l’UCSD. |
| Milieu basal KC (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | milieu basal pour la culture de kératinocytes avec 0,06 mM de CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | Suppléments de croissance définis pour milieu de culture |
| Dispase en poudre | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme pour dissocier l’épiderme du derme |
| Facteur d’attachement | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | matériau de revêtement à base de gélatine |
| Matrice de revêtement | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Matériau de revêtement à base de collagène |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | Une enzyme douce semblable à la trypsine pour dissocier les kératinocytes de la feuille épidermique |
| 100 &mu ; m Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 Kit de viabilité | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Souris TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Lampes UV portatives filaires | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| Tubes UV de 8 watts | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Microscope inversé à la lumière pour la culture cellulaire | ZEISS, Iéna, Allemagne | Microscope fluorescent Axio Observer | |
| Olympus | BX41 |
Références
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Réimpressions et autorisations
