Les kératinocytes épidermiques forment une barrière fonctionnelle de la peau et sont positionnés à la ligne de front de la défense de l'hôte contre les insultes environnementales externes. Nous décrivons ici des méthodes d'isolement et de culture primaire de kératinocytes épidermiques provenant de peau de souris néonatale et adulte, et l'induction de la différenciation terminale et la réponse inflammatoire déclenchée par les UVB des kératinocytes.
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Article de méthode
Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le kératinocyte (KC) est le type de cellule prédominante dans l'épiderme, la couche la plus externe de la peau. Les KC épidermiques jouent un rôle essentiel dans la défense de la peau en formant une barrière cutanée intacte contre les insultes environnementales, telles que l'irradiation UVB ou les agents pathogènes, et aussi en déclenchant une réponse inflammatoire à ces insultes. Nous décrivons ici des méthodes pour isoler les KC de la peau néonatal de la souris et de la peau de queue de souris adulte. Nous décrivons également des conditions de culture utilisant des suppléments de croissance définis (dGS) par rapport au sérum bovin fœtal chelexé (cFBS). Fonctionnellement, nous montrons que les KC néonatals et adultes répondent très bien à une différenciation terminale élevée due au calcium, à une formation de jonction étroite et à une stratification. En outre, les KC adulte cultivés sont sensibles à la mort cellulaire déclenchée par les UVB et peuvent libérer de grandes quantités de TNF lors de l'irradiation UVB. Ensemble, les méthodes décrites ici seront utiles aux chercheurs pour la mise en place d'un modèle in vitroS pour étudier la biologie épidermique chez la souris néonatal et / ou la souris adulte.
Introduction
La peau est le plus grand organe du corps avec l'épiderme comme couche extérieure. L'épiderme joue un rôle essentiel dans la formation d'une barrière épidermique intacte pour séparer le corps de l'environnement et empêche ainsi la perte d'eau et protège contre les insultes environnementales telles que les allergènes, les agents pathogènes et l'exposition aux UVB. L'épiderme se développe à partir d'une seule couche de kératinocytes basaux indifférenciés (KC) en un épithélium stratifié multicouches constitué d'une couche basale, suivie d'une couche épineuse, d'une couche granulaire et d'un stratum corneum. Les KC basales,....
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux sont approuvées par le comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux de l'UCSD.
1. Isolation et culture primaire de la souris KC contre la peau néonatale
- Sacrifiez les néonats post-nés 0-2 de la souche de souris de type sauvage C57B / 6 par décapitation à l'aide de ciseaux. Coupez les membres juste au-dessus des articulations du poignet et de la cheville, puis coupez complètement la queue, laissant un petit trou.
- Pour éplucher toute la peau, insérez d'abord des ciseaux tendus à travers le trou à la queue et coupez la peau le long de la li....
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Résultats
La différenciation terminale induite par le calcium élevé des KC néonatals et adultes. L'épiderme de souris primaire KCs plaquée et maintenue à 0,06 mM de CaCl 2 a augmenté en monocouche, et les cellules individuelles ont une forme polygonale avec un espace intercellulaire distinct, montrant un aspect pavimenteux lorsque confluentes (figure 1A et la figure 2A). L'élévation du CaCl 2.......
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Discussion
L'épiderme de la peau fonctionne comme une barrière critique pour séparer et protéger le corps de l'environnement extérieur et des dommages causés par la perte d'eau, les agents pathogènes, la chaleur et l'irradiation UV. Les KC sont la lignée cellulaire prédominante de l'épiderme, et la culture primaire de KC épidermiques est un outil utile pour étudier et comprendre les processus biologiques de formation de barrière et la réponse des KC aux insultes environnementales in vitro .
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l'octroi de l'INSTITUT NATIONAL DE L'ARTHRITE ET DES MALADIES MUSCULOSKÉLÉTIQUES ET DE LA PEAU (R01AR069653 à Zhang LJ) et des National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 à CA).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 nouveau-nés ou souris adultes de type sauvage | Jackson Laboratory | 000664 | Les souris de type sauvage (achetées à l’origine au Jackson Laboratory) sont élevées et maintenues dans un vivarium pour animaux à l’UCSD. |
| Milieu basal KC (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | milieu basal pour la culture de kératinocytes avec 0,06 mM de CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | Suppléments de croissance définis pour milieu de culture |
| Dispase en poudre | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme pour dissocier l’épiderme du derme |
| Facteur d’attachement | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | matériau de revêtement à base de gélatine |
| Matrice de revêtement | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Matériau de revêtement à base de collagène |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | Une enzyme douce semblable à la trypsine pour dissocier les kératinocytes de la feuille épidermique |
| 100 &mu ; m Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 Kit de viabilité | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Souris TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Lampes UV portatives filaires | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| Tubes UV de 8 watts | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Microscope inversé à la lumière pour la culture cellulaire | ZEISS, Iéna, Allemagne | Microscope fluorescent Axio Observer | |
| Olympus | BX41 |
Références
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M.
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Réimpressions et autorisations
