L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental pour analyser les interactions ARN-protéines. Traditionnellement, la plupart des expériences ont utilisé des gels verticaux. Cependant, les gels horizontaux offrent plusieurs avantages, tels que la possibilité de surveiller les complexes lors de l'électrophorèse. Nous fournissons un protocole détaillé pour la génération et l'utilisation d'électrophorèse sur gel horizontal horizontal.
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Article de méthode
Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental de la biologie moléculaire qui a été largement utilisé pour l'analyse biochimique des interactions ARN-protéines. Ces interactions ont été traditionnellement analysées avec des gels de polyacrylamide générés entre deux plaques de verre et des échantillons électrophorés verticalement. Cependant, les gels de polyacrylamide coulés dans des plateaux et électrophorés à l'horizontale offrent plusieurs avantages. Par exemple, des gels horizontaux utilisés pour analyser des complexes entre des substrats d'ARN fluorescents et des protéines spécifiques peuvent être imagés plusieurs fois à mesure que l'électrophorèse progresse. Cela fournit l'occasion unique de surveiller les complexes ARN-protéine à plusieurs points pendant l'expérience. De plus, l'électrophorèse sur gel horizontale permet d'analyser plusieurs échantillons en parallèle. Cela peut grandement faciliter les expériences de cours et analyser simultanément plusieurs réactions pour comparer différents composants et conditions. Ici nous prOvulent un protocole détaillé pour générer et utiliser une électrophorèse sur gel horizontale horizontale pour analyser les interactions ARN-protéines.
Introduction
Les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) se sont révélés être un outil biochimique inestimable pour analyser les interactions spécifiques entre les protéines et les acides nucléiques 1 , 2 , 3 . Ces analyses peuvent fournir des informations importantes concernant l'affinité de liaison des protéines à l'ARN ou à l'ADN 3 , la stoechiométrie des composants des complexes nucléiques-protéines 1 et fournissent de nouvelles informations importantes sur la spécificité de liaison des protéines de liaison de l'ARN par des expériences de compétition de substrat 1 .
La configuration expérimentale traditionnelle pour ces essais consiste à mélanger une protéine purifiée avec un substrat d'ARN radiomarqué. Les complexes résultants sont ensuite analysés avec des gels de polyacrylamide non dénaturants (natifs) versés entre deux plaques de verre suivies d'une électrophorèse d'échantillon dans un appareil vertical 3. Bien que cette approche ait été utilisée de manière exhaustive pour fournir des informations importantes sur les mécanismes biochimiques qui sous-tendent la liaison des protéines aux acides nucléiques, elle a également plusieurs limites. Par exemple, cette stratégie de base a un débit relativement faible et n'est pas facilement adaptable pour les applications nécessitant l'analyse de plusieurs réactions de liaison en parallèle. En outre, avec l'appareil vertical traditionnel, il est difficile de surveiller potentiellement les complexes à plusieurs reprises lors de l'électrophorèse 3 , 4 .
Nous présentons ici une adaptation du dosage EMSA qui utilise des gels de polyacrylamide natifs coulés dans un appareil à plat, une électrophorèse horizontale et des substrats d'ARN marqués par fluorescence 4 , 5 , 6 , 7 . L'incorporation de ces modifications relativement simples à la base straTegy offre de nombreux avantages. En particulier, le format à plat horizontal se prête facilement à analyser des dizaines d'échantillons simultanément 4 . En outre, pour certains complexes ARN-protéines, tels que ceux formés entre la protéine Bicaudal-C et son électrophorèse au substrat d'ARN dans un gel horizontal, offre une capacité accrue à résoudre des complexes distincts de protéines d'ARN et à les discriminer à partir de substrat d'ARN non lié.
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Protocole
1. Préparation du gel de polyacrylamide natif horizontal 4 .
- Préparation des matériaux nécessaires.
- Pour l'appareil de gel horizontal, utilisez une boîte en gel (37 cm x 24 cm) avec un plateau de 27 cm x 21 cm et une capacité pour deux peignes de 24 po. Cette configuration fournit un total de 48 échantillons qui peuvent être analysés simultanément.
- Préparez les réactifs suivants: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED et 10% APS (persulfate d'ammonium).
- Génération d'un gel d'acrylamide natif à 10%.
- Dans un ballon de 500 mL, ajouter 80 mL de 5x TBE, 100 mL d'acrylamide à 40% et de l'eau à un volume final de 400 ml.
- Ajouter 4 mL d'APS à 10% et 400 μL de TEMED. Bien mélanger.
- Verser le mélange dans le bac de coulée horizontale et laisser le gel polymériser pendant 30 min. Le gel aura environ 2 cm d'épaisseur.
REMARQUE: Les gels peuvent couler dans une hotte pour accélérerJusqu'à la polymérisation. Après la polymérisation, une fine couche de liquide restera sur le dessus du gel. - Verser le liquide et rincer avec le tampon courant. Retirez le (s) peigne (s) avec précaution et rincez les puits avec un tampon courant à l'aide d'une seringue.
- Préparation du tampon courant.
- Préparez 2 L de 1x tampon de fonctionnement TBE pour la boîte à gel. Diluer 400 ml de 5XTBE avec 1600 ml et mélanger. Placez le tampon TBE dans la chambre froide pour refroidir.
- Pré-exécuter le gel
- Ajouter 2 L de tampon de fonctionnement à froid dans la boîte à gel et insérer le gel.
- Pré-exécuter le gel à 120 V pendant 1 h à 4 ° C dans une chambre froide. Pendant ce temps, préparez la réaction de liaison.
2. Réaction de liaison 8
- 2.1.Préparez les composants de réaction suivants.
DTT 20 mM
BSA 10 mM
10 mM d'ARNt de levure
5X tampon de liaison (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM de KCl, 0,2% de Tween-20)
L'ARN marqué à la fluorescéine 100 nM a été acheté commercialement
Concentré de protéine Bicaudal-C
50% de glycérol dans H 2 O traité par DEPC
H 2 O traité par DEPC - Assembler les composants de réaction de liaison dans un tube de microcentrifugeuse sans RNase.
- Au tube, ajouter 5 μL de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL d'ARNt de levure 10 mM, 10 μL de 5x Binding Buffer.
- Ajouter une protéine à une concentration finale de 250 nM dans 50 μL. Ajouter de l'eau à un volume final de 45 μL.
- Ajouter 5 μL de substrat d'ARN marqué par fluorescence. Utiliser un substrat de 32 nucleotides marqué par fluorescéine 3 'commercialement acheté.
- Mélanger et incuber dans l'obscurité pendant 30 minutes à température ambiante.
3. Analyse des échantillons sur le gel de polyacrylamide horizontal natif
- Pour chaque réaction, ajouter 15 μL de 50% de glycerol et mélanger doucement.
- CarefuAjouter 30 μL de chaque réaction au gel. La quantité d'échantillon qui peut être chargée dans un puits unique varie en fonction de l'épaisseur du gel et de la taille des puits. Nous avons chargé des volumes aussi peu que 15 μL et jusqu'à 45 μL dans un seul puits de gels créé avec un peigne de 24 po et versé à une épaisseur de 2 cm.
- Après avoir connecté l'alimentation à l'appareil gel, allumez l'alimentation et réglez la tension. Faire passer le gel à 4 ° C à 120 V.
REMARQUE: pour l'appareil de gel horizontal, cela finit par être d'environ 5 V / cm. Pour l'appareil de gel vertical, il s'agit de 16 V / cm.- Pour éviter d'endommager ou blanchir l'ARN marqué par fluorescence, effectuer une électrophorèse dans l'obscurité.
- Varier les temps d'électrophorèse en fonction des spécificités du complexe ARN-protéine analysé.
REMARQUE: Un avantage majeur de l'analyse EMSA horizontale est que l'électrophorèse peut être arrêtée, le gel imagé et ensuite le géJe peux être replacé dans l'appareil et l'électrophorèse peut être poursuivie pendant plus longtemps.
4. Imagerie du Gel
- Effectuer une analyse avec n'importe quel instrument conçu pour la détection et l'imagerie de substrats fluorescents.
- Placez le gel sur l'imageur.
- Régler les paramètres de l'image. Pour les ligands d'ARN marqués à la fluorescéine, utilisez les paramètres suivants: FAM (longueur d'onde 473 nm), 750 Tension de photomultiplicateur (PMT), taille de pixel de 100 μm.
- Scannez le gel pour capturer l'image.
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Résultats
Pour démontrer la puissance et la polyvalence de l'électrophorèse en gel native horizontale, nous avons analysé la liaison de la protéine Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) à un ARN marqué par fluorescence contenant un site de liaison Bicc1. Bicc1 protéines fonctionnent comme des répresseurs pour contrôler traductionnelles spécifiques à l'ARNm de décisions du destin cellulaire au cours des étapes maternelles de développement des animaux 9,
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Discussion
Les gels de polyacrylamide indigènes sont un outil précieux pour étudier les interactions protéine-ARN et, traditionnellement, ces gels sont électrophorisés verticalement 2 , 3 . Nous avons utilisé une modification du protocole qui substitue les gels de polyacrylamide indigènes créés et soumis à une électrophorèse horizontale 1 , 4 , 6 , 7
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Nous remercions Laura Vanderploeg pour la préparation des chiffres. Le travail dans le laboratoire Sheets est soutenu par la subvention NSF 1050395 et la subvention NIH (R21HD076828). Le travail dans le laboratoire Ryder est soutenu par les subventions du NIH R01GM117237 et R01GM117008. Megan Dowdle est soutenu par une bourse d'opportunités avancées SciMed GRS par l'intermédiaire de l'École universitaire de Wisconsin-Madison et du Programme de formation en biotechnologie par le biais de l'Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de santé (T32GM008349).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Boîte de gel horizontale | OWL N | /A | Produit qui n’est plus fabriqué. Des boîtes de gel similaires peuvent être trouvées chez Thermo Scientific, boîtes de gel de la série A. Numéro de catalogue : A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophorèse peignes | OWL | N/A | Produit qui n’est plus fabriqué. Des boîtes de gel similaires peuvent être trouvées chez Thermo Scientific, peignes de boîtes de gel de la série A. Numéro de catalogue : A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Cellule d’électrophorèse | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40 % 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| ARNt de levure | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescéine étiquetée ARN | IDT | N/A | La commande peut être faite sur mesure à la longueur et à la séquence souhaitée |
| EDTA sel tétrasodique hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES Sigma-Aldrich | H4034-500G | ||
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Acide borique | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Chlorure de potassium | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
Références
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
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- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
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Réimpressions et autorisations
