À l’aide de In Vivo et tissulaire et cellulaire Explant approches à l’étude de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale

Résumé

Protocoles pour l’étude de l’aorte murin embryonnaire et périnatale à l’aide en vivo clonale analyse et cartographie sort, explants aortiques et muscle lisse isolé des cellules sont détaillées ici. Ces diverses approches facilitent l’enquête de la morphogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale dans le développement normal et la pathogenèse de la maladie.

Résumé

L’aorte est la plus grosse artère du corps. La paroi aortique est constituée d’une couche interne de cellules endothéliales, une couche intermédiaire d’une alternance de lamelles élastiques et des cellules musculaires lisses (CML) et une couche externe de fibroblastes et de matrice extracellulaire. Contrairement à l’étude généralisée des modèles pathologiques (par exemple, l’athérosclérose) dans l’aorte adulte, sait beaucoup moins sur l’aorte embryonnaire et périnatale. Ici, nous nous concentrons sur les CGS et fournir des protocoles pour l’analyse de la morphogénèse et la pathogenèse de l’embryonnaires et périnatales SMCs aortiques dans un développement normal et la maladie. Plus précisément, les quatre protocoles inclus sont : J’ai) in vivo la cartographie sort embryonnaires et analyse clonale ; II) la culture embryonnaire aorte explant ; III) isolement de SMC de l’aorte périnatale ; et iv) placement pompe mini osmotiques sous-cutanées chez les souris enceintes (ou des femmes enceintes). Par conséquent, ces approches facilitent les recherches des origines, sort et architecture clonale de CML dans l' aorte in vivo. Ils permettent de modulation aorte embryonnaires morphogenèse dans l’utérus par une exposition continue aux agents pharmacologiques. En outre, le tissu aortique isolé des explants ou SMCs aortiques peuvent être utilisés pour mieux comprendre le rôle des gènes spécifiques cibles au cours de processus fondamentaux tels que muscularization, la prolifération et la migration. Ces expériences génératrices d’hypothèse sur CML isolés et l’aorte explanté peuvent ensuite être évalués dans le contexte de in vivo au moyen d’approches pharmacologiques et génétiques.

Introduction

Les systèmes circulatoires de fonction multicellulaires pour fournir des nutriments et l’oxygène aux cellules qui ne sont pas en contact avec le milieu extérieur et pour enlever des déchets produits et dioxyde de carbone de ces cellules. Chez les vertébrés, le principal système circulatoire est composé du cœur, qui pompe le sang à travers une série de vaisseaux sanguins. Les murs de gros vaisseaux sanguins, comme les artères et les veines, se composent de trois couches : je) l’intima ou la couche interne de cellules endothéliales ; II) le support, ou la couche intermédiaire d’une alternance de circonférence allongés des cellules musculaires lisses CML et lamelles élastiques ; et iii) l’adventice ou couche extérieure du tissu conjonctif et des fibroblastes. La grande majorité des études en biologie vasculaire se consacrée sur les cellules endothéliales, enquête sur la formation de nouveaux tubes de bordées de cellules endothéliales par l’intermédiaire de l’angiogenèse. En comparaison, les CGS reçoivent relativement peu d’attention. Cependant, CML est un type de cellule critique dans la construction de la paroi artérielle normale et dans les pathologies vasculaires.

L’aorte est l’artère de plus gros calibre dans l’organisme, qui reçoit le débit cardiaque du ventricule gauche du cœur. Il est touché par diverses maladies humaines, y compris l’athérosclérose, anévrisme et dissection. Dans les organismes adultes, l’aorte et ses branches principales sont intensément étudiés dans des modèles de maladies vasculaires. Par exemple, régime riche en graisses nourri des souris qui ont la valeur null pour le gène codant le récepteur des lipoprotéines de basse densité ou apolipoprotéine E, développer l’athérosclérose et des études de cartographie sort récentes indiquent que SMCs préexistants donnent naissance à plusieurs types de cellules dans le plaque d’athérosclérose¹. Dans les anévrismes de l’aorte, changements pathologiques incluent l’apoptose SMC et remodelage^2,3de la matrice extracellulaire.

Considérablement moins est connu au sujet de la morphogenèse de la SMC et la pathogenèse pendant la période embryonnaire et périnatale. Ici, nous fournissons des protocoles pour l’étude embryonnaires et périnatale aortique SMCs in vivo, des explants de tissus et de cellules isolées. Par exemple, l’article premier du protocole délimite cartographie sort et analyse clonale chez les souris embryonnaires. Recombinase cre exprimée sous le contrôle d’un promoteur spécifique à la cellule facilite le marquage des cellules spécifiques et leur progéniture^4,5,6; Toutefois, un contrôle temporel de l’étiquetage spécifique des cellules peut être difficile durant le développement embryonnaire chez la souris. Dans ce contexte, nous fournissons avec embryons expriment le conditionnel CreER sous un promoteur actif dans les CGS (e.g.,Myh11 ou Acta2) et un reporter de la Cre, méthodes d’injection de tamoxifène ou son métabolite actif 4-OH-tamoxifène chez les mères enceintes et pour analyser les cellules marquées dans les embryons ou descendants postnatal. En outre, contrairement aux études de cartographie du destin, dont principalement utiliser Cre reporters avec un seul journaliste fluorophore^1,7, l’analyse clonale est considérablement amélioré avec des journalistes de Cre multicolores.

La deuxième et la troisième section du protocole décrire des méthodes d’isolement et de mise en culture des explants aortiques embryonnaires et SMCs aortiques de nouveaux-nés, respectivement. Ces approches permettent la manipulation des voies de signalisation, plus précisément dans les explants aortiques ou CML et pour analyser les effets directs des agents pharmacologiques. Ainsi, le rôle de certains gènes dans le tissu d’intérêt peut subir de façon beaucoup plus rapide que par le biais de manipulations génétiques traditionnelles chez les souris. En outre, les études SMC isolés facilitent l’analyse de la migration cellulaire et adhérence, qui sont techniquement limité in vivo.

Enfin, la quatrième section du protocole délimite le placement d’une pompe osmotique mini sous-cutanée, chargé avec des agents pharmacologiques chez des souris enceintes (ou des femmes enceintes). Cette méthode facilite l’analyse de l’effet sur le développement embryonnaire causé par des agents nécessitant une perfusion continue en raison d’un métabolisme rapide. L’alternative des injections fréquentes n’est pas pratique pour de nombreux agents et doit être évitée, car elle peut causer une gêne importante dans le barrage enceinte.

Protocole

tous les protocoles de souris sont approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Yale et d’institutionnels animalier.

1. In Vivo embryonnaires sort cartographie et analyse clonale

Remarque : nous avons largement utilisé ces approches pour évaluer les origines des cellules et leur architecture clonale dans les modèles de développement et de la maladie ^{7 , 8 , 9 , 10}.

1. mis en place l’accouplement entre des souris avec un CreER et des souris avec un journaliste Cre.
   Remarque : Un CreER est utilisé pour SMC marquage ; Myh11-CreERT2 ou Acta2-CreERT2 souris ^{11 , 12} est couramment utilisé à cette fin. Nous avons utilisé des souris de ROSA26R-CreERT2 ¹³ pour le marquage largement les tissus embryonnaires.
   1. Pour analyse clonale, utiliser une multi-couleur Cre journaliste (p. ex., confettis ou souris Rainbow [Rb]) ^{8 , 14 , 15} et pour la cartographie de sort, utiliser un journaliste de Cre de simple-couleur (par exemple, ROSA26R-YFP souris ¹⁶) ou le journaliste de Cre double-couleur ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) ¹⁷.
      Remarque : Ce schéma d’élevage utilise des souris adultes qui sont âgés de 2 à 6 mois (généralement ~ 30 g) et généreront des embryons avec une CreER et un reporter de Cre.
2. Rechercher les fiches vaginales dans la matinée à l’aide d’un métal probe et envisager de midi le jour de la fiche par détection jour embryonnaire (E) 0,5.
3. Séparer le mâle de la femelle lorsqu’une fiche est détectée.
4. Préparer 4-OH-tamoxifen et solutions de travail tamoxifène.
   1. Pour 4-OH-tamoxifen, dissoudre 5 mg dans 50 µL d’éthanol à 100 %, Vortexer pendant 2 min, puis ajouter 450 µL d’huile de maïs. Sur la glace, laisser agir au niveau de la sortie 2 pendant 10 cycles de s de repos entre les cycles jusqu'à ce que l’échantillon ait refroidi. Après que l’échantillon est complètement dissout (généralement ~ 4-5 cycles de sonication), prendre 200 µL de solution aux ultrasons et dissoudre dans 1 800 µL d’huile de maïs pour faire la solution de travail final (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL).
   2. De tamoxifène, diluer à 50 mg/mL dans l’éthanol à 100 % et vortex jusqu'à ce qu’il soit dissous. Dilué dans de l’huile de maïs pour faire la solution de travail final (tamoxifène, 10 mg/mL) et mélanger à 45 ° C pour s’assurer qu’elle est complètement dissoute.
5. Pour l’induction embryonnaire précoce, injecter par voie intrapéritonéale 4-OH-tamoxifen dans un barrage de l’enceinte.
   1. Utiliser les injections 4-OH-tamoxifen (jusqu'à ~ 150 µg / souris enceinte, soit environ 5 mg/kg de poids corporel) à E5.5 et à cette date qu’ils cèdent barrage viable, des embryons et des chiots.
   2. Utilisation de tamoxifène à des doses de 0,5 - 1,5 mg (ou 17-50 mg/kg) pour les mères enceintes avec des embryons à ~ E9 et par la suite. Utiliser une aiguille de 30G pour toutes les injections.
      Remarque : La Filtration à travers un filtre à 0,22 µm est généralement utilisée pour stériliser tous les mélanges avant l’injection.
6. Pour analyse clonale, utiliser des injections intrapéritonéales de fortes doses de 4-OH-tamoxifen (p. ex., 5 mg/kg) ou tamoxifène (p. ex., 50 mg/kg) à l’occasion de plusieurs cellules.
   1. Pour marquer les cellules individuelles, titrer vers le bas de la dose de 4-OH-tamoxifène ou tamoxifène tel que dans les tissus d’intérêt (c.-à-d., l’aorte), presque tous les embryons analysés (comme décrit ci-dessous à la fin de cette section) n’ont aucune cellules marquées ou seulement les cellules d’une seule couleur ; Il s’agit de la dose seuil.
7. Pour marquer les cellules dans la période de gestation de mi-fin et à retrouver leur destin ou la clonalité chez la souris après la naissance, injecter la progestérone dans la cavité intrapéritonéale du barrage enceinte concomitamment avec le tamoxifène dans un 1:2 (progestérone : tamoxifène) rapport des doses.
   NOTE : Tamoxifène doses sont 17-50 mg/kg et les doses de progestérone sont 8,5-25 mg/kg (c'est-à-dire la moitié de la dose de tamoxifène). L’injection de progestérone peut retarder le travail de ~ 1 à 2 jours.
8. Euthanasier le barrage enceinte avec des embryons d’un âge désiré en utilisant une méthode de chute libre, où le barrage est placé dans un récipient contenant du coton ou gaze imbibée d’isoflurane non dilué. Confirmer la mort en ouvrant la cage thoracique pour provoquer un pneumothorax, en supprimant les organes vitaux, et/ou en effectuant la dislocation cervicale.
9. Purifier l’abdomen avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des ciseaux pour couper ouvert l’abdomen et disséquer sur l’utérus. Enlever l’embryon de l’utérus et de séparer soigneusement les embryons le placenta et le sac vitellin avec une pincette.
10. Euthanasier les embryons à E15 ou plus en effectuant la dislocation cervicale ou décapitation avec ciseaux chirurgicaux ou une lame bien aiguisée.
    NOTE : Embryons âgés de moins de E15 meurent rapidement après l’euthanasie de la mère et/ou le retrait des embryons de la mère.
11. Placer les embryons dans du PBS glacée et couper un petit morceau de queue à l’aide de ciseaux au génotype du reporter CreER et Cre.
12. Difficulté les embryons dans 4 % paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 2 h. laver les embryons trois fois dans du PBS et puis incuber les embryons dans 30 % de saccharose en tubes de 15 mL, attendre qu’ils sombrent, qui peut prendre jusqu'à deux jours dans du PBS.
13. Remplissage plastique congélation moules jusqu'à 2/3 du niveau maximum avec la température de coupe optimale (OCT) composée. Placez chaque embryon verticalement dans le moule, entièrement submergé en octobre incuber pendant 10 min à température ambiante (RT) pour réduire au minimum les bulles.
14. Place congélation blocs de tissus verticalement dans une glace, bain d’éthanol 70 % de geler. Stocker les blocs à -80 ° C.
15. Régler la température de cryostat à-22 ° C et couper des blocs pour générer des sections transversales à travers l’aorte entier, 10 à 20 µm d’épaisseur. Sécher les lames à RT pendant 30 min avant leur stockage à -80 ° C.
16. Décongeler les diapositives à ta, abri de la lumière pour éviter le blanchiment des fluorophores. Laver les lames avec PBS-Tween20 0,1 %.
    1. Pour analyse clonale, détachant les diapositives pour les noyaux (DAPI, 5 mg/mL) et autres fluorophores dans l’arc-en-ciel Cre reporter d’images directement (azurée : 433-nm excitation de max, 475 nm émission de max ; mOrange : 548 nm, 562 nm ; mCherry : 587 nm, 610 nm).
       1. Utilisation des filtres ce qui suit pour la détection des fluorophores avec un microscope à fluorescence vertical : DAPI (excitation max/bande passante 350/50 nm, émission max/bande passante 460/50 nm), Cerulean (excitation 436/20 nm, émission 480/40 nm), texas rouge (excitation 560 / 40 nm, émission 630/75 nm) et un filtre personnalisé pour séparer le mCherry de mOrange (excitation 577/10 nm, émission 630/50 nm).
    2. Pour la cartographie sort avec le journaliste de Cre mTmG, détecter GFP (484 nm, 510 nm), soit directement d’imagerie ou à l’aide d’immunomarquage. Pour l’imagerie avec un microscope à fluorescence vertical utiliser un filtre GFP (excitation 470/40 nm, émission 525/50 nm).
    3. Pour immunostaining, incuber les sections avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 ° C, laver avec 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS et puis incuber avec des anticorps secondaires pendant 1 h. utilisation anti-CD31 (concentration finale 0,0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) et Cy3-anticorps primaires directement conjugué anti-SMA (dilution finale 1/500) et utilisation secondaire antibodies directement conjugué à fluorophores (dilution finale 1/500) (voir la Table des matières).
17. Image des diapositives avec un microscope à fluorescence vertical (grossissement : 4 X - 20 X) ou microscope confocal (10 X-63 X). À fort grossissement, utilisez un 63 d’imagerie confocale x objectif à huile avec une ouverture numérique de 1,4 à 0,6 et une taille d’image de 1 024 x 1 024 pixels.

2. Explantation embryonnaires aorte Culture

Remarque : cette approche a été utilisée auparavant pour évaluer le rôle de l’intégrine bêta 3 durant une sténose de l’explantés Eln ^{(- / -)} embryonnaire aorte ^{9 , 18}.

1. euthanasier un barrage chronométré-enceintes à E15.5 par inhalation isoflurane excédentaire, selon l’étape 1.8, au-dessus de.
2. Récolte et euthanasier les embryons, comme par les Etapes 1,9-1.10, au-dessus de.
3. Placer l’embryon passivement et épingler les branches étendues à la Commission de la dissection. Visualiser avec un stéréoscope de dissection et d’utiliser des ciseaux pour couper une incision verticale de l’abdomen par l’intermédiaire du sternum à la partie supérieure du thorax. Disséquer de loin le thymus, trachée, poumons, oesophage, foie et l’intestin.
4. Tirer le cœur sur le ventre avec une pincette délicatement et utiliser des ciseaux à disséquer l’aorte loin de l’aspect dorsal des cavités thoraciques et abdominales. Pour libérer de l’aorte, le couper à la racine proximale et les positions abdominales distales.
5. Placer l’aorte dans glacee PBS stérile sous une hotte de culture cellulaire. Transférer l’aorte à une plaque 24 puits et de la culture en DMEM contenant 0,5 % FBS pendant 24 h à 37 ° C.
   Remarque : Le milieu de culture peut être complété par un anticorps bloquant (p. ex., anti-intégrine αvβ3 anticorps à 0,02 mg/mL ⁹ ; Voir la Table des matières) ou d’un agent pharmacologique.
6. Laver l’aorte deux fois avec du PBS et puis le fixer avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 20 min.
7. Laver trois fois avec PBS et transférez l’aorte dans un tube de 1,5 mL avec 30 % de saccharose dans du PBS. Après l’aorte descend, faire des blocs de tissus congelés, des sections coupées et réagissent, comme ci-dessus en étapes 1.13-1,15,.

3. SMC isolément de l’aorte périnatale

Remarque : cette approche est actuellement utilisée pour comparer la biologie du CML aortique isolés de souris périnatales Eln ^{(- / -)} et de type sauvage.

1. Euthanasier un murin pup à jour après la naissance (P) 0,5, dislocation cervicale ou par décapitation avec ciseaux chirurgicaux ou une lame tranchante, tel que décrit à l’étape 1.10, au-dessus de.
2. Exécuter l’étape 2.3 et ensuite, après avoir ouvert le thorax et l’abdomen, perforer le ventricule gauche avec aiguilles 23G. Tube en plastique utilisation pour se connecter à l’aiguille de seringue contenant du PBS stérile maintenu verticalement à une position élevée que PBS s’écoule dans le ventricule gauche par gravité. Permettent l’injection de PBS stérile dans le ventricule gauche jusqu'à ce que le foie blanches.
   1. Utiliser des pinces pour enlever le tissu adventitiels à l’extérieur de l’aorte et disséquer l’aorte, comme indiqué au point 2.4.
3. Digérer l’aorte dans une solution unique de DMEM (500 µL) additionné de 225 collagénase U/mL, 2,25 élastase U/mL et 1 x antibiotique-antimycosiques pendant 45 min à 37 ° C. manuellement secouer le tube chaque 5-10 min.
4. Dans la hotte de culture de cellules stériles, titurate les tissus digérés par pipetage de haut en bas avec une pipette de 200 µL pour générer une suspension de cellules individuelles. Transférer la suspension de cellules individuelles dans un tube de 15 mL, ajouter 2 mL de DMEM et centrifuger à 920 x g pendant 5 min à 25 ° C.
5. Jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans 3 mL de milieu de culture SMC (DMEM contenant 10 % FBS additionné de 1 µg/mL rhFGF, rhEGF de 10 µg/mL, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 2,5 µg/mL d’amphotéricine B). Transférer sur une plaque de 35 mm culture.
   NOTE : Sur l’isolement initial, ~ 400 000 cellules sont obtenus à partir d’une aorte de type sauvage unique P0.5 ; ~ 300 000 de ces cellules sont les CGS.
6. Culture les cellules à 37 ° C et changer de milieu de culture des SMC frais tous les 3 jours. Selon les techniques habituelles avec la trypsine, le passage des cellules lorsque confluentes. Pour les expériences, utiliser des cellules de passages 3-7.

4. Sous-cutanée Placement de mini pompe osmotique dans l’enceinte (ou Non enceinte) souris

Remarque : cette approche a été utilisée précédemment pour fournir en permanence un agent pharmacologique (p. ex., l’intégrine β3 et β5 inhibiteur Cilengitide) aux embryons dans l’utérus ⁹. La pompe a été insérée dans le barrage enceinte à E13.5 et maintenue jusqu'à la parturition.

1. Anesthésier les souris à l’isoflurane 2-5 % d’oxygène (débit de 1 L/min) pour l’induction et 1 à 3 % pour l’entretien. Le réflexe d’orteil-pincement permet de surveiller le niveau de l’anesthésie et ajustez l’agent anesthésique selon vos besoins. Administration sous-cutanée buprénorphine (0,05 - 0,1 mg/kg) pour l’analgésie.
2. Se raser le bas du dos avec une tondeuse. Utiliser des rideaux stérile, gants et instruments et maintenir les souris sur un plateau chirurgical de chauffage pendant la chirurgie.
3. Placer chaque souris en position couchée et frottez le dos avec betadine suivie d’alcool isopropylique. Environ 3-5 cm rostrale à la base de la queue dans le bas du dos, utiliser un scalpel à pratiquer une incision horizontale peau 0,5 - 1,0 cm de longueur sans blesser le muscle sous-jacent.
4. Insérer une pince hémostatique dans l’incision et créer une poche sous-cutanée rostralement à l’implantation de la pompe en ouvrant et fermant les mâchoires de la pince hémostatique.
5. Remplir une mini-pompe osmotique avec l’agent de choix, selon le fabricant ' directives de s (voir la Table des matières). Insérez la pompe remplie dans la poche et refermer l’incision avec des pinces ou des sutures non résorbables 6-0. Veiller à ce que le temps chirurgical total est inférieure à 10 min.
6. Suivre après l’intervention, les souris toutes les 15 min jusqu'à ce qu’ils ont récupérés de décubitus sternal. Administration sous-cutanée buprénorphine (0,05 - 0,1 mg/kg) toutes les 6 à 12 h pendant 48 h. Quand les souris ont complètement remis de l’anesthésie générale, analysez-les quotidiennement. Retirer les clips ou les sutures post-chirurgie de 7 à 10 jours.

Résultats

Dans une analyse représentative clonale de CML en mutant des embryons pour Eln (le gène codant l’élastine protéine de matrice extracellulaire), Eln^(+/-), Acta2-CreER^T2 de souris ont été accouplés à des souris Eln^(+/-) transportant également les multi-color ROSA26R^(Rb/Rb) journaliste. Tel que décrit à l’étape 1, bouchons ont été vérifiés, enceintes barrages ont été induites par une injection unique de tamoxifène (1,5 ...

Discussion

Contrairement à l’enquête approfondie de l’aorte murin et ses branches principales pathologies adultes, tels que les modèles de l’athérosclérose, moins est connu au sujet de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale. Ici, nous nous concentrons sur l’aorte embryonnaire/périnatale, spécifiquement la CML et fournir des protocoles afin d’étudier l’aorte à travers en vivo, explant de tissu, et isolement SMC s’approche. Ces approches complémentaires fournissent l’enquêteur avec diverses a...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tamoxifène	Sigma	T5648
Huile de maïs	Sigma	C-8267	Véhicule pour tamoxifène
4-OH-tamoxifène	Sigma	H7904	Métabolite actif du tamoxifène
Progestérone	Sigma	P8783-5G	Utiliser à la moitié de la concentration du composé tamoxifène
OCT	Tissu Sakura tek	4583	Pour la fabrication de cryoblocs
Cryomolds	Polysciences inc	18986
DAPI	Sigma	D9542	Coloration IHC du noyau, concentration finale 5 mg/mL
Cy3 Anticorps anti-SMA directement conjugué	Sigma	A2547	Coloration IHC de SMA, dilution finale 1:500
Anticorps anti-CD31	BD Pharmingen	550274	coloration IHC de la GFP, concentration finale 0,006 mg/mL
Anticorps anti-GFP	Thermo Fisher Scientific	A-11121	Coloration IHC de CD31, concentration finale 0,0016 mg/mL
Anticorps secondaire chèvre anti-lapin, Alexa 647	Life Technologies	a21244	Coloration IHC, concentration finale 0,004 mg/mL
Anticorps secondaire chèvre anti-lapin, Alexa 488	Life Technologies	a11008	Coloration IHC, concentration finale 0,004 mg/mL
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10567-014	Pour la culture cellulaire
FBS	Thermo Fisher Scientific	10437028
Anticorps anti-bloquant l’intégrine bêta3	BD Biosciences	553343	Clone 2C9. G2, concentration finale 0,02 mg/mL
Collagénase	Worthington Biochemical Corp	44H14977A	Pour la digestion de l’aorte
Elastase	Worthington Biochemical Corp	34K15139	Pour la digestion de l’aorte
Antibiotique-antimycosique (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Recombinant humain FGF		Promega G5071
Recombinant humain EGF	Promega	G5021
Pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Amphotéricine B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Plaques de culture tissulaire	Corning	CLS430165
Alzet Mini-pompe osmotique	Durect Corporation	2001
ECLIPSE 80i Vertical Microscope fluorescent	Nikon²nbsp ;
; TCS  ; SP5	Leica
Branson Sonifier 450	VWR
Myh11-CreERT2 souris	The Jackson Laboratory  ;	19079
		Acta2-CreERT2	Obtenu du laboratoire du Dr Pierre Chambon et de Daniel Metzger
souris ROSA26R-CreERT2	The Jackson Laboratory.	8463
souris ROSA26R(mTmG/mTmG)	Le laboratoire Jackson	;
souris ROSA26R(EYFP/EYFP)	Le laboratoire Jackson	; 006148  ;
ROSA26R(Confettis/Confettis)	souris Le Laboratoire Jackson	13731
Souris ROSA26R(Rb/Rb)	Laboratoire du Dr Irv Weissman		Obtenu du laboratoire du Dr Irv Weissman