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Article de méthode

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

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DOI :

10.3791/56041

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27 juillet 2017

 ,  , 
1Department of Cell and Tissue Biology, Program in Craniofacial Biology and Institute for Human Genetics, University of California San Francisco, 2Laboratory of Transgenic Models Diseases, Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour l'imagerie en direct de la fusion palatine secondaire de souris à l'aide d'une microscopie confocale. Ce protocole peut être utilisé en combinaison avec une variété de lignes de souris rapporteurs fluorescentes et avec des inhibiteurs de voie pour une vision mécaniste. Ce protocole peut être adapté pour l'imagerie en direct dans d'autres systèmes de développement.

Résumé

La fusion des étagères palatines secondaires pour former le palais secondaire intact est un processus clé dans le développement de mammifères et sa perturbation peut conduire à une fente de palais secondaire, une anomalie congénitale commune chez l'homme. La fusion du palais secondaire a été largement étudiée, ce qui a mené à plusieurs mécanismes cellulaires proposés qui peuvent servir de médiation à ce processus. Cependant, ces études ont été principalement réalisées sur des tissus embryonnaires fixes à des points de temps progressifs pendant le développement ou dans des cultures d'explants fixes analysées à des points de temps statiques. L'analyse statique est limitée pour l'analyse des processus morphogénétiques dynamiques, telle que la fusion palatine et les types de comportements cellulaires dynamiques médiates de la fusion palatine est incomplètement comprise. Nous décrivons ici un protocole pour l'imagerie en direct de la fusion de palais secondaire ex vivo dans des embryons de souris. Pour examiner les comportements cellulaires de la fusion palatine, la Kératin14 -cre spécifique à l' épithélium a été utilisée pour étiqueter les cellules épithéliales du palais dans ROSA26-mTmG flox reporter des embryons. Pour visualiser l'actine filamenteuse, des souris journalistes Lifeact-mRFPruby ont été utilisées. L'imagerie en direct de la fusion palatine secondaire a été réalisée en disséquant des étagères palatins secondaires récemment adhérentes d'embryons de stade embryonnaire (E) 14,5 et de culture dans des milieux contenant de l'agarose sur un plat de verre pour permettre l'imagerie avec un microscope confocal inversé. En utilisant cette méthode, nous avons détecté une variété de nouveaux comportements cellulaires lors de la fusion palatine secondaire. Une appréciation de la façon dont les comportements cellulaires distincts sont coordonnés dans l'espace et le temps contribue grandement à notre compréhension de ce processus morphogénétique dynamique. Ce protocole peut être appliqué à des lignées de souris mutantes ou à des cultures traitées avec des inhibiteurs pharmacologiques afin de mieux comprendre la façon dont la fusion palatine secondaire est contrôlée.

Introduction

La fusion tissulaire est une étape importante dans le développement d'organes multiples. Les principaux défauts de naissance humains tels que la fente de la lèvre et du palais, la spina bifida et les malformations du cœur peuvent résulter de défauts de fusion tissulaire 1 . La fusion secondaire du palais de la souris a été largement étudiée pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la fusion tissulaire dans le développement 2 , 3 , 4 . À la souris, le développement secondaire du palais commence à environ E11.5 avec la décroissance d'une étagère palatine secondaire de chacun des processus maxillaires bilatéraux. La croissance initiale des étagères palatines se produit verticalement le long de la langue, jusqu'à environ E14.0, date à laquelle les étagères palatines sont élevées horizontalement au-dessus de la langue. La croissance axée sur la médiation entraîne un contact physique entre l'épithélium des deux étagères palatines, formant l'épithélium de la ligne médianeAl seam (MES) à E14.5. Les MES intermédiaires doivent être éliminés entre les étagères palatines secondaires pour permettre la confluence mésenchymateuse et le développement d'un palais secondaire intact, complètement fusionné par E15.5 3 .

La façon dont une couche cellulaire MES épithéliale partagée est formée entre deux étagères palatines distinctes, puis retirée pour atteindre la confluence mésenchymateuse, a été une question centrale dans le développement du palais. Sur la base d'études de microscopie histologique et électronique à la souris (EM), d'études de culture d'explants et d'expériences génétiques de génétique de souris, plusieurs comportements cellulaires fondamentaux ont été impliqués dans ce processus. Les projections semblables à celles de Filopodia provenant de l'épithélium de bord médian MEE de chaque étagère palatine facilitent le contact initial 5 , 6 , suivie de l'intercalation de ces cellules épithéliales à un MES 6 , 7 partagé. Suppression du MES partagé résultantA été proposé de procéder par trois mécanismes non exclusifs. Les premières études utilisant l'observation histologique et le traçage de lignage ex vivo avec des colorants vitaux ont indiqué que le MES pourrait être éliminé par la transition épithéliale à la mésenchyme (EMT) des cellules MES 8 , 9 , bien que plus récemment, le traçage génétique des cellules épithéliales avait soulevé une incertitude quant à La contribution à long terme des cellules épithéliales au mésenchyme palatins 10 , 11 , 12 . Un nombre important de cellules apoptotiques et une réduction de leur nombre dans certains mutants qui ne subissent pas une fusion appropriée du palais ont conduit à l'idée que l'apoptose peut être un facteur majeur de dissolution MES 2 , 3 . Enfin, basé initialement sur des études portant sur l'étiquetage épithélial et l'observation statique à des points de temps progressifs, les cellules MESOnt été proposés pour migrer dans les dimensions oronasales et antéro-postérieures 11 , 13 , mais ces comportements cellulaires dynamiques étaient initialement non confirmés en raison d'une incapacité à les observer dans le tissu palatal vivant. Récemment, nous avons pu observer directement ces comportements en développant une nouvelle méthodologie d'imagerie en direct qui combine les méthodes génétiques de souris du marquage fluorescent avec l'imagerie radiale confocale des étagères palatines explantées.

Tout d'abord, pour visualiser les comportements cellulaires dynamiques dans les cellules épithéliales du palais lors de la fusion palatine, nous avons généré une souris journalière épithéliale spécifique en traversant des souris ROSA26-mTmG flox avec des souris Keratin14-cre 14 , 15 . L'imagerie confocale en direct de la culture d'explants de palais des embryons résultants a confirmé certains comportements cellulaires précédemment proposés et identifié des événements nouveaux dans le processus de fusion 6 . Les protubérances de la membrane cellulaire épithéliale ont précédé le contact cellulaire initial et la convergence épithéliale par intercalation cellulaire et déplacement de cellules oronasales. Notamment, nous avons également découvert que l'extrusion cellulaire, un processus signalé pour jouer un rôle important dans l'homéostasie épithéliale, était un mécanisme majeur qui conduisait la fusion du palais secondaire à la souris 6 , 16 . Cette méthode d'imagerie peut être utilisée avec d'autres lignes de journalistes; Nous avons utilisé des souris transgéniques Lifeact-mRFPruby 17 , 18 pour examiner la dynamique du cytosquelette de l'actine pendant le processus de fusion. D'autres reporters peuvent également être utilisés pour observer d'autres aspects spécifiques de la fusion du palais, et cette méthode peut être adaptée soit à la microscopie confocale à balayage laser, soit à la microscopie confocale, selon les besoins d'imagerie et la disponibilité du microscope. L'imagerie en direct devient de plus en plus une approche clé dans la biologie du développement. PartiEn particulier, la morphogenèse craniofaciale est complexe et les anomalies congénitales humaines qui affectent le visage sont fréquentes. Cette méthode d'imagerie en direct confocal aidera à mieux comprendre les mécanismes fondamentaux de développement de base ainsi que les origines des anomalies craniofaciales humaines.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles de l'Université de Californie au Comité de soins et d'utilisation des animaux institutionnels de San Francisco.

1. Préparation des supports d'imagerie en direct

  1. Préparation de milieux de culture liquide
    1. Ajouter 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 U / mL de pénicilline, 100 μg / mL de streptomycine, 200 μg / mL d'acide L-ascorbique, 15 mM HEPES à Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 médias.
      REMARQUE: le média d'imagerie en direct a été fraîchement préparé avant l'imagerie. Ce média contient du phénol-rouge qui peut conduire à une phototoxicité sur de longues périodes d'imagerie en direct. La substitution des médias sans phénol-rouge peut améliorer l'imagerie à long terme.
  2. Préparation d'une solution d'agarose à bas point de fusion
    1. Dissoudre 350 mg d'agarose à bas point de fusion dans 10 ml d'eau distillée autoclavée pour obtenir une solution stock de 3,5%.
    2. Mélanger bien la solution d'agarose et incuber à 70 ° C dans un bain d'eau pour dissoudre complètement l'agarose.
    3. Refroidir la solution d'agarose dans un bain d'eau à 37 ° C avant de l'ajouter aux milieux d'imagerie en direct.
    4. Ajouter 1 ml de la solution mère d'agarose à 5 ml du milieu liquide d'imagerie en direct pour obtenir une concentration finale (0,6%).
    5. Gardez les médias avec de l'agarose dans un bain d'eau à 37 ° C pour éviter une solidification prématurée.

2. Préparation du palais Culture explicative pour l'imagerie en direct

  1. Dissection des étagères palatines secondaires E14.5 récemment collées
    NOTE: Dans notre expérience, la fusion d'imagerie nécessite de commencer par une paire d'étagères palatines légèrement adhérentes; Cette adhérence empêche les mouvements d'explants qui empêchent la fusion de se produire pendant l'imagerie.
    1. Dissectez des embryons de stade E14.5 dans 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS) et choisissez la protéine fluorescente verte (GFP) - exprimant (à partir deK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) ou (Red fluorescent protein) RFP-expressing (from Lifeact-mRFPruby ) embryons positifs utilisant un microscope à dissection équipé de lampes fluorescentes. Transférer du tissu sur des milieux de culture d'imagerie en direct préchauffés sans agarose.
    2. Couper la tête embryonnaire et enlever la partie supérieure du cerveau en utilisant deux pinces fines n ° 5 ( Figure 1 A-C ). Utilisez une pince n ° 5 pour maintenir l'embryon tandis que l'autre pince n ° 5 coupe des tissus supplémentaires à l'extérieur des étagères palatines.
      REMARQUE: Des ciseaux fins peuvent être utilisés pour couper la tête d'embryon (la première étape) au lieu d'une pincée n ° 5. Cependant, deux pinces fines n ° 5 donneront un meilleur contrôle pour effectuer des coupes précises.
    3. Retirez la mandibule avec précaution sans endommager les étagères palatines comme indiqué sur la figure 1 D et 1E . Pour réduire les risques de palais endommagants, garder la langue à travers la dissection de la mandibule, fPar un retrait prudent de la langue.
    4. Après avoir retiré la mandibule et la langue, examinez le côté oral du palais secondaire avec un stéréomicroscope avec fluorescence pour confirmer le signal du journaliste fort dans le MES ( Figure 1 M ).
    5. Dissection des parties postérieures, y compris le cerveau postérieur et le tronc cérébral après élimination de la mandibule et de la langue ( Figure 1 F ).
    6. Enlevez les deux maxillaires avec des étagères palatines adhérentes ( Figure 1 G ).
    7. Couper le tissu de la mâchoire antérieure en gardant le palais primaire et secondaire intact ( Figure 1 H et I ).
    8. Retirer le septum nasal sur le côté nasal de l'explant exposant le MES.
      REMARQUE: Ces étapes ultérieures des dissections nécessitent une attention particulière pour ne pas perturber les contacts entre deux étagères palatines secondaires. L'élimination de la cloison nasale aide àRéduire le signal de fond d'autres zones et réduire également le mouvement vertical des tissus, ce qui permet une image stable ( Figure 1 J-L ).
    9. Après avoir disséqué les étagères palatines, examinez à nouveau le signal du rapporteur de la ligne médiane afin de s'assurer qu'il n'y ait aucun dommage à la couche épithéliale entre les tissus.
  2. Mise en place d'explants de palais dans un plat de culture avec des supports d'imagerie en direct
    1. Mettez les supports d'image en live dans un plat inférieur de verre de 35 mm.
    2. Mettez les tablettes palatines disséquées côté oral vers le bas aussi près du fond de verre que possible pour l'imagerie avec un microscope confocal inversé ( Figure 1 N ).
    3. Placez des pastilles de glace sèche sur une surface conductrice à proximité du plat de culture pour accélérer la solidification de l'agarose en diminuant rapidement la température ou mettre le plat de culture à 4 ° C. Une plaque froide, comme celle utilisée pour l'incorporation de paraffine, pourrait également être utilisée à cet égardTage.
      REMARQUE: Lorsque de la glace carbonique est utilisée, le changement de support d'agarose doit être soigneusement surveillé afin d'éviter tout gel.

3. Confocal Time-lapse Imaging of Palate Explicit

  1. Imagerie et acquisition de données
    1. Une fois que l'agarose a été semi-solidifié, montez le plat de culture dans un microscope confocal inversé équipé d'une chambre d'incubation à 37 ° C. Utilisez un microscope confocal à lumière blanche et un microscope confocal à disque tournant d'observateur de cellule.
      NOTE: Nous avons utilisé un support modifié contenant HEPES 15 mM sans gaz de CO 2 .
    2. Mettez la vaseline entre le plat de culture et couvrez à l'aide d'une seringue pour éviter l'évaporation des milieux ( Figure 1 N ).
      REMARQUE: Une certaine condensation sur le dessus du couvercle du plat de culture après la culture de nuit (O / N) se produit, mais le volume des milieux ne change pas, ce qui suggère que la vaseline absorbe l'évaporation des milieux.
    3. Localisez la région d'intérêt avec des objectifs de faible grossissement (10x) et utilisez des objectifs de grossissement plus élevés (objectif 20x avec zoom numérique 3x ou objectif 40x avec Immersol W) pour l'imagerie en temps réel.
      REMARQUE: Les étagères palatines secondaires dissoutes ne sont pas plates. Le palais secondaire est une structure incurvée, ce qui rend difficile l'image de l'ensemble du MES dans le même plan. L'imagerie de faible grossissement (10x) peut permettre l'imagerie du palais entier, mais les objectifs de 40x fourniront une meilleure résolution d'image pour examiner les mouvements cellulaires détaillés dans les positions Z plus profondes. La courbure est élevée dans la région du palais moyen. Le palais antérieur et postérieur est relativement plat par rapport au palais moyen. Nous nous voyons souvent vers le milieu antérieur du palais secondaire pour éviter les régions de plus grande courbure.
    4. Numériser de multiples piles Z avec 5 μm chaque étape pendant 16-24 h en utilisant une excitation laser appropriée (488 nm pour GFP et 532/561 nm pour RFP) ( Figure 2 ).
      REMARQUE: Pour réduire la phototoxicité potentielle, utilisez une puissance laser minimale et un temps d'exposition. Ceci est important surtout en cas d'imagerie multicolore. Utilisez 22% de puissance laser de 552 nm pour membraneTomato (mT), 30% de puissance laser 495 nm pour membraneGFP (mG) et 25% de puissance laser de 561 nm pour membraneRFP. Le temps d'exposition moyen était de 550 ms.
    5. Utilisez un logiciel d'analyse d'image pour effectuer un suivi cellulaire et une analyse quantitative.

4. Analyse d'image de données

REMARQUE: Ici, Imaris a été utilisé. Des analyses de données similaires peuvent également être effectuées avec les progiciels ImageJ ou Volocity.

  1. Rendre les surfaces tridimensionnelles (3D) à partir des séquences d'image.
    REMARQUE: Cette section permet de générer une surface à partir d'un film généré avec un signal GFP de membrane.
    1. Cliquez sur Modifier | Afficher le réglage de l'affichage et utiliser le curseur d'histogramme pour régler l'intensité du signal afin que le signal de la membrane soit clair à traversSur la durée du film ( Figure 3 A ).
    2. Corriger le signal blanchi en utilisant Image Traitement | Correction d'atténuation . Réglez les valeurs Intensity Front and Intensity Back pour que le signal de la membrane soit clair pendant toute la durée du film. Un certain essai et une erreur peuvent être nécessaires pour définir ces valeurs.
      REMARQUE: la valeur Intensity Back (position Z plus profonde) sera inférieure à la valeur Intensity Front (Surface Z position) en raison de la pénétration laser limitée. Ces valeurs peuvent donc également être modifiées pour normaliser l'intensité du signal dans la série Z. Les deux valeurs peuvent être ajustées pour obtenir une correction de blanchiment. La correction d'atténuation est également appelée correction d'atténuation d'émission 19 .
    3. Pour générer une surface à partir du signal de la membrane, sélectionnez Surpass | Surfaces , choisissez un canal source et un type de seuil (Absolute Intensity) et sous Paramètres Algorithmes seLect Segment uniquement une région d'intérêt Et le processus de l'image entière enfin , puis on clique sur la flèche avant; Continuez à pousser la flèche vers l'avant (utilisez les paramètres par défaut, ou spécifiez les niveaux de détail de surface et la méthode de seuil par essai et erreur), en vérifiant si la surface générée reflète le signal de fluorescence. Pour spécifier une région d'intérêt, sélectionnez région et heure (s) à rendre en recadrage des positions X, Y, Z.
      REMARQUE: Sélectionnez Processus de l'image entière enfin afin que les réglages et les seuils soient appliqués sur l'ensemble du film.
    4. Générer une surface en cliquant de nouveau sur le bouton fléché vers l'avant. Ensuite, ajustez le seuil en modifiant l'histogramme dans les Filtres pour correspondre au signal de la membrane.
    5. Une fois la surface générée, choisissez la surface dans Surfaces / Paramètres pour visualiser le signal de surface et finir le processus de génération de surface en poussant le double forwArd arrow button ( Figure 3 B ).
    6. Aller à la surface | Modifiez et cliquez sur Masquer tout dans les Propriétés Masque pour générer une image de canal masquée.
    7. Après avoir cliqué sur OK, la fenêtre Mask Channel s'ouvrira automatiquement; Sélectionnez le canal GFP, définissez les voxels à l'extérieur de la surface jusqu'à la valeur maximale de l'intensité du signal (trouvée dans l' édition | Réglage de l'affichage ) et les voxels à l'intérieur de la surface à la valeur d'intensité GFP minimale (également trouvée dans Modifier | Réglage de l'affichage ), dans Mask Settings pour générer un masque du signal de membrane.
    8. Comme le masque du signal de membrane sera affiché dans la vue Volume , générez des images inversées en utilisant Image Processing | Changement de contraste | Inverser ( Figure 3 C ).
  2. Détection de spots à partir d'images de surface inversée.
    REMARQUE: cette section permet au centre de chaque cellule d'êtreMarqué d'un point unique et suivi sur l'espace et le temps.
    1. Sélectionnez Surpass Scene | Spots | Créer ; Dans les paramètres d'algorithme, choisissez Segment uniquement une région d'intérêt , Traitement de l'image entière enfin et Points de suivi (au fil du temps) .
    2. Cliquez sur la flèche vers l'avant et spécifiez une région d'intérêt; Sélectionnez la région et l'heure (s) pour suivre les points; Continuez à pousser la flèche vers l'avant, choisissez le canal masqué comme canal source et déterminez le diamètre XY estimé des points.
    3. Lorsque vous cliquez sur le bouton fléché vers l'avant, vous ouvrez automatiquement une fenêtre de filtre; Ajustez le seuil de détection de spot en changeant les valeurs dans l'histogramme pour générer des points individuels au centre de chaque cellule ( Figure 3 D ).
    4. Lorsque vous cliquez à nouveau sur le bouton de la flèche vers l'avant, vous ouvrez la fenêtre Algorithme . Sélectionnez Modèle de suivi de mouvement automatique 20 et spécifiez le suivi maximalLa position et la taille de l'espace maximal pour relier les pistes qui deviennent discontinues pendant une courte période de temps.
    5. Lorsque vous cliquez de nouveau sur le bouton fléché vers l'avant, vous ouvrez la fenêtre Filtres, définissez le seuil de durée de la piste en ajustant l'histogramme afin que chaque cellule soit renseignée. En cliquant sur le bouton de la double flèche vers l'avant, finaliseront la détection des points.
    6. Afin de corriger la dérive des tissus, cliquez sur Spots | Track Editor et sélectionnez Correct Drift . Une fenêtre Algorithme s'ouvrira automatiquement; Sélectionnez la dérive translationnelle sélectionnée , incluez le résultat entier et corrigez les positions des objets .
  3. Générer des diagrammes avantageux pour l'analyse quantitative.
    REMARQUE: Le Scatterplot du programme est un outil pour générer des graphiques multidimensionnels (X, Y, Z, Couleur et Échelle) avec plusieurs objets. Ces parcelles sont utiles pour visualiser les tendances de nombreux mouvements cellulaires au fil du temps.
    1. Créez des parcelles 2D ou 3D de données de suivi des cellules en utilisant leVantage-Ajouter un nouveau menu de parcours Vantage ( Figure 3 E et 3F ).
    2. Sélectionnez le volume ou les points et choisissez Créer / Catégorie et Type de tracé
    3. Ajustez les valeurs de tracé pour générer différents graphiques de Vantage.
    4. Exportez des graphiques à l'aide de la fonction Snapshot .
      REMARQUE: Les données statistiques peuvent également être exportées en tant que feuille de calcul pour une analyse quantitative supplémentaire en cliquant sur Zone de traçage | Enregistrer .

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Résultats

L'imagerie vivante de la culture d'explants de palais a révélé de multiples processus cellulaires médiant la fusion du palais 6 . Les contacts initiaux entre deux cellules épithéliales sont réalisés par protrusion membranaire ( figure 2 B-2E ). Lorsque deux couches épithéliales se rencontrent, elles forment une MES multicouches multicouches suivie d'une intercalation pour réaliser une MES intégrée de couch...

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Discussion

L'imagerie en direct de la morphogenèse des tissus avec la culture d'explants organiques en 3D peut fournir des informations détaillées concernant les processus cellulaires qui ne peuvent pas être démontrés dans l'analyse de coloration conventionnelle des coupes de tissus fixes. En utilisant la culture d'explants in vitro du palais secondaire embryonnaire de souris, nous avons observé plusieurs comportements cellulaires intéressants qui nous conduisent à proposer un nouveau mécanisme de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions M. Douglas Benson pour des conversations initiales concernant l'imagerie palatine secondaire. Nous reconnaissons également David Castaneda-Castellanos (Leica) et Chris Rieken (Zeiss) pour leur aide pour ajuster les conditions d'imagerie en microscopie confocale. Nous apprécions Lynsey Hamilton (Bitplane) pour des suggestions utiles pour l'analyse d'image quantitative utilisant le logiciel Imaris. Ce travail a été financé par NIH / NIDCR R01 DE025887.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
s
DMEM/F12de la vie11330-032
Sérum fœtal bovinTechnologie de la vie16000-044
L-glutamineTechnologie de la vie25030-081
Acide L-ascorbiqueSigmaA4544-100G
Pennicilline/StreptomycineLife technology15140-122
Agarose à bas point de fusionBioExpressE-3111-125
35 mm Plat à fond en verreMatTekP35G-1.5-10-C
Petrolieum Jelly (Vaseline)Sigma16415-1Kg
Mice
Keratin14-creMGI : J :65294Allèle = Tg(KRT14-cre)1Amc
ROSA26mTmGMGI : J :124702Allèle = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo
Lifeact-mRFPrubyMGI : J :164274Allèle = Tg(CAG-mRuby)#Rows
Microscope
White Light SP5 microscope confocalLeica Microsystems
Cell Observer Microscope confocal à disque rotatifMicroscopie
Technologie Zeiss

Références

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