Research Article
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Protéines bactériennes affichage bibliothèques est une technique éprouvée pour la découverte des réactifs de peptide d’affinité, une alternative robuste aux anticorps. La méthode de tri semi-automatisée ci-après a rationalisé les protéines pour diminuer l’apparition de faux positifs. Nous illustrons ici le processus de pensée et des techniques appliquées à l’évaluation des candidats et en minimisant l’analyse en aval.
Protéines bactériennes affichage bibliothèques est une technique éprouvée pour la découverte de réactif peptide affinité pour la reconnaissance de cibles biotiques et abiotiques. Peptide affinité réactifs peuvent être utilisés pour des applications similaires aux anticorps, y compris la détection et la thérapeutique, mais sont plus robuste et capable de fonctionner dans des environnements plus extrêmes. L’enrichissement spécifique des agents de capture de peptide à une cible de la protéine d’intérêt est améliorée en utilisant des méthodes de tri semi-automatisée qui améliorer la liaison et étapes de lavage et donc de diminuer l’apparition de fausses positifs liants. Une méthode de tri semi-automatisée est décrite aux présentes pour une utilisation avec un commercial automatisé magnétique-lancée de cellules tri périphérique avec un affichage bactérien sans contrainte tri bibliothèque exprimant des peptides au hasard 15-mer. Avec de légères modifications, ces méthodes sont extensibles à autre automatisé les dispositifs, autres bibliothèques de tri et d’autres organismes. Un objectif principal de ce travail est de fournir une méthodologie globale et expliquer le processus de pensée appliqué en analyse et en réduisant au minimum l’ensemble résultant des candidats. Ces techniques comprennent l’analyse des cellules le liaison à l’aide de cellule activée par fluorescence triant (FACS), afin d’évaluer l’affinité et spécificité au cours de triage et en comparant les candidats individuels, et l’analyse des peptides séquences pour identifier les tendances et séquences consensus permettant de comprendre et de potentiellement améliorer l’affinité et spécificité pour la cible d’intérêt.
Biopanning est une technique éprouvée pour la découverte de réactif d’affinité, une bactérienne afficher bibliothèques une source commode de peptide affinité réactifs 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. De la même façon au phage afficher 25,26 et levure affichage 27,28, les peptides affleurent à la surface des cellules et sont disponibles pour lier à la fois biotiques et abiotiques cibles, avec ces interactions entraînée par l’épine dorsale de peptide et les propriétés uniques de l’acide aminé chaînes latérales 29. Contrairement à l’affichage de phage, les bactéries elles-mêmes sont auto-répliquant et contiennent tout le matériel génétique nécessaire pour l’affichage sans l’élution du phage lié et une réinfection des cellules. Contrairement à l’affichage de la levure, affichage bactérienne est plus rapide en raison de la rapide (environ 20 min 30) temps d’Escherichia coli. Les réactifs d’affinité peptide qui en résulte peuvent être produits hors-cellule, devant servir à une variété de plates-formes 16,17,26 de détection et ont le potentiel d’utilisation comme matériaux vivants lorsque affiché sur cellules 2 , 31 , 32. par rapport aux anticorps monoclonaux pour la reconnaissance de cibles précises, les peptides sont beaucoup plus petites et plus souples, et bibliothèques d’affichage de peptide peuvent être facilement manipulés au niveau de l’ADN afin d’éviter des acides aminés spécifiques, comme la cystéine 33 . Peptides sont plus en plus exploitées pour thérapeutique 34,35,36 et d’autres applications où les anticorps seraient généralement utilisés grâce à leur facilité de découverte, reproductible synthétique (off-cellule ) production et entretien supérieur de performance dans des environnements extrêmes, fournissant un réactif fonctionnel même après une exposition à des températures élevées ou de stockage à long terme sans réfrigération 37,38. La capacité de surmonter la chaîne du froid pour le stockage des réactifs est d’un intérêt particulier pour le ministère de la défense, par exemple, qui doit fonctionner dans des environnements extrêmes. Stabilité thermique est donc une caractéristique souhaitable pour les réactifs d’affinité reconnaissant les objectifs choisis donnés comme exemples dans ce manuscrit.
Récemment, les protéines bactériennes affichage bibliothèques est devenue encore plus simple et fiable avec l’utilisation de semi automatique cellule magnétique activé tri (MACS ou MCS) méthodes 9,14,39. Ces méthodes ont été démontrés pour cibles biologiques à l’aide de plusieurs semblables plates-formes avec différents avantages, y compris un disponible dans le commerce de tri automatisé magnétique-lancée de cellules tri instrument (autoMACS ou autoMCS) (voir le tableau des matériaux) 1,14,15 et des appareils plus spécialisés qui enferment l’échantillon dans une cartouche jetable 7,9 ou puce 39, un cahier des charges utiles pour utilisent avec les organismes ou les toxines qui sont de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ou plus7. Ces méthodes semi-automatisé pourraient être étendus pour trier des peptides capables de se lier aux matières abiotiques si magnétique ou qui ont la capacité d’être couché sur un billes magnétiques et pour utilisation avec différents organismes (tels que les bactéries anaérobies) si le tri et des conditions de croissance sont modifiées. En plus de bibliothèques d’affichage bactérienne de tri, l’instrument d’autoMCS commercial utilisé ici a également été utilisé en partie pour les premières étapes de la découverte de fragments d’anticorps humain de chaîne unique affiché sur l’aire de la levure, suivie d’une isolation supplémentaire à l’aide de Fluorescent tri pour les cellules d’activé (FACS) 40. Les principaux avantages de semi automatisation sont diminuées de tri de temps et d’efforts et plus robuste et reproductible élimination des cellules non liés de billes magnétiques au cours des étapes de lavage, conduisant à la réduction des faux positifs, moins tours de tri requis et moins une analyse complexe en aval 9,14. Dans le cas de l’instrument d’autoMCS commercial, il y a plusieurs programmes préchargés, qui peuvent être optimales pour différentes applications, telles que négatif prétri (épuisement), priorisant la pureté, en réduisant au minimum le volume de l’échantillon final et en augmentant ou diminution de sensibilité pour l’isolement de cellules rares 41.
L’objectif de ce travail est de démontrer la méthode de criblage une bibliothèque d’affichage bactérienne à l’aide de l’instrument d’autoMCS disponible dans le commerce et d’expliquer le processus de pensée appliqué en analyse et en réduisant au minimum l’ensemble résultant des candidats dans afin de faciliter l’extension à d’autres applications. La bibliothèque d’affichage utilisée ici (voir la table des matières) 12,13 contient environ 109- 1011 15-mer unique peptides affichées via une version modifiée de la protéine de membrane externe bactérienne OmpX dans un la nature sans contrainte à la surface de la cellule, qui est censée être représentatif du peptide libre en solution si fabriquée synthétiquement. En outre, cet échafaudage de protéine contient un peptide de contrôle positif P2X à l’extrémité C-terminale de surveillance expression via la liaison de YPet Mona. Toutefois, une bibliothèque achetée ou roman avec diversité appropriée et d’autres caractéristiques nécessaires pour l’application spécifique désirée devrait fonctionner de la même façon avec cette procédure de criblage, si des modifications mineures peuvent être requises. Une représentation schématique du présent protocole de criblage est illustrée à la Figure 1. En outre, le protocole pourrait être adapté aux autres automatisé des plates-formes de tri magnétiques et autres stratégies de tri. Un tri manuel magnétique d’un aimant de benchtop a été démontrée avec succès, bien que plus compliquée et fastidieuse analyse en aval nécessaire dû à accru faux positifs 14et fournit néanmoins une option alternative à la autoMCS pas si aucune cellule magnétique automatique dispositif de tri est disponible.
1. protéines bactériennes affichage bibliothèques en utilisant autoMCS
Remarque : Ce protocole de tri basé sur des autoMCS a été décrit précédemment 14, et un plus approfondi « élargi protocole pour les nouveaux utilisateurs » est disponible dans les documents complémentaires pour ce manuscrit pour plus de détails, y compris une explication du potentiel modifications. Si un dispositif d’autoMCS n’est pas disponible pour le tri, voir le protocole supplémentaire de Sarkes et coll. 2015 puisqu’un manuel de protocole de tri est également décrit dans ce travail 14. Le protocole d’autoMCS condition ici a été adapté pour inclure des étapes supplémentaires de tri négatifs pour spécificité améliorée 1,15. Une représentation schématique du présent protocole de criblage est illustrée à la Figure 1.
2. FACS Analysis of tours de tri
3. le séquençage des potentiels candidats et évaluation d’affinité
Avec l’utilisation d’automatisé cellule magnétique activé tri (autoMCS) au lieu de tri cellulaire magnétique manuelle, fausses négatifs candidats sont considérablement réduits au cours des protéines bactériennes affichage bibliothèques 9,14. Étapes de tri négatifs peuvent être également être ajoutés selon les besoins pour réduire les liants non spécifique à la cible d’intérêt, et il est suggéré à tout le moins pour ajouter une sorte de négative contre le magnétique perles eux-mêmes à l’avant. Cette sélection négative contre les billes magnétiques eux-mêmes a été achevée avant quatre séries de protéines bactériennes choisis affichent la bibliothèque des classeurs de l’antigène protecteur (AP), comme illustré à la Figure 2et avant une sélection négative supplémentaire contre rivax et de quatre tours de sélection positive pour moslim, comme illustré à la Figure 3. Les perles utilisées ici sont conjugués de streptavidine pour la capture des protéines biotinylées, donc isolement involontaire de peptides liant à streptavidin lui-même est un souci et est contrôlée au moyen des FACS avec streptavidine-conjugué à la phycoérythrine (Figure 3 , SAPE). Au minimum, liaison streptavidine doit être testée pour des candidats individuels prometteurs lors de l’évaluation de liaison à la protéine cible. Le pourcentage obligatoire et IFNM pour SAPE devraient être faibles dans tous les tours de tri. Le degré de liaison de streptavidine peut augmenter légèrement avec chaque cycle de tri, comme dans la Figure 3, parce que la population est exposée à plusieurs reprises aux streptavidine des billes magnétiques après chaque tour de tri. Si le degré de liaison streptavidine fond devient problématique à l’analyse en aval, plus le tri négatif contre les billes magnétiques peut être effectuée après le tour de tri positif dans lequel la population de liaison streptavidine a augmenté en afin de réduire en aval préalable de faux positifs. Lorsque existent des protéines ou des matériaux qui pourraient gêner spécifiquement utilisation en aval du peptide pour une application spécifique, ou qui sont censés provoquer une réaction croisée avec des réactifs d’affinité pour la cible en raison de la construction et/ou la similarité de séquence, plus négatif tri contre cette protéine ou matériel est recommandé. C’est un exemple de tri négatif contre rivax avant isolation des peptides de liaison moslim, en raison de la similarité structurelle et l’homologie de séquence de ces deux protéines 1,15. Encore une fois, une réaction croisée liant aux protéines utilisées pour négatif étapes de tri peut être surveillé lors de l’analyse de tri des tours à l’aide de FACS (Figure 3Rivax-488). Dans le meilleur des cas, les IFNM et liaison pour cent sont faibles, comme dans cet exemple.
Lorsqu’elle est disponible, un peptide de contrôle positif fixe, tels que le peptide P2X à l’extrémité C-terminale de l’échafaudage d’affichage produite par la bibliothèque d’affichage bactériennes utilisée dans les résultats représentatifs ici, peut aider à déterminer si le manque d’affinité avec le test de FACS est en raison de l’absence d’expression de l’affichage d’échafaudage elle-même, plutôt que de manque d’affinité de la sous-unitaires pour la cible. Dans la Figure 2 et la Figure 3, YPet Mona liant à cette P2X peptide est surveillé et montre que les premiers tours de tri expriment l’échafaud mal. C’est principalement en raison de la fréquence élevée des codons stop en peptides N-terminal Server dans la bibliothèque au hasard, ce qui signifie que l’échafaudage lui-même n’était pas produit. Autres effets peuvent en outre contribuer, comme la présence de peptides ayant des effets toxiques inattendus pour les e. coli, ou une diminution de croissance ou peptide affichage tarifs pour d’autres raisons (comme les mutations dans le génome bactérien). L’addition d’EDTA durant l’induction peut améliorer l’expression au cours de ces premiers tours de tri 42, mais n’a pas encore été testée. Liaison au YPet Mona dans chaque protéines population est considérablement améliorée par tour 3. Si l'on compare la Figure 2 , Figure3, il est clair aussi que le niveau d’expression peut être amélioré en augmentant le temps d’induction à 90 min (comme dans la Figure 2YPet Mona) au lieu de 45 min (comme dans la Figure 3YPet Mona), Bien que 45 min est généralement suffisante. Notez que l’IFNM pour YPet Mona est normalisé au niveau de la liaison YPet Mona des cellules contrôle négatif, donc valeurs près 1.0 sont typiques si le niveau d’expression est acceptable. Normalisant YPet Mona MFI à PBS seul IMF de l’échantillon même est également un moyen valable de comparer les niveaux de l’expression relative, mais donne des valeurs beaucoup plus élevées (comparer la Figure 2 et Figure 3 avec résulte de Sarkes et al. 2015, 15).
Enrichissement de la bibliothèque pour les peptides de liaison à la cible spécifique d’intérêt est généralement obtenu dans les trois tours de tri positifs, mais continuant à un quatrième tour de tri peut être bénéfique, tel qu’illustré à la Figure 2 et Figure 3 . Ici, pour cent lié cellules et IFNM continuent d’augmenter de 3 tour à tour 4 pour les cibles de l’exemple, PA et moslim, qui est convertie (boxed) en rouge dans la Figure 2 et la Figure 3, respectivement. Les séquences de peptide affinité plus élevées peuvent être déjà présents en 3e mais sont susceptibles de l’enrichir davantage au 4ème tour, qui aide à la sélection de candidats potentiels 14. L’analyse des séquences de 4 ronds tend à révéler des séquences répétées et ce répéter des séquences sont un excellent point de départ pour affinité et spécificité analyse et détermination de la séquence. La macro eCPX_Sequencing fournie en complément de ce manuscrit contribue à rationaliser cette première analyse, comme illustré à la Figure 4. Commençant par un dossier de .seq ou des fichiers texte, la séquence d’ADN qui se trouve entre choisi 5' et 3' des séquences est traduit, organisée par la séquence d’acides aminés et analysé pour nombre de résidus d’acides aminés individuels dans chaque peptide. La liste triée des séquences de peptide isolé, tel qu’indiqué sur la capture d’écran feuille de tableau récapitulatif sur la Figure 4, permet de déterminer facilement les séquences répétées et à quelle fréquence. Les cellules de cette feuille de calcul contenant des séquences répétées sont décrites dans des couleurs différentes pour l’analyse plus facile. Il est recommandé de vérifier ces séquences répétées de séquences consensus et d’autres tendances. Ce climat est favorisé par le logiciel d’alignement de séquence comme Kalign et Clustal Omega, et l’analyse peut être effectuée sur la sortie de la séquence entière (y compris les séquences répétées et non répétitif à la fréquence de que leur apparition) et sur la liste des sélectionnés en bas de répéter des séquences (avec ou sans leur fréquence relative). Résultats représentatifs pour PA et moslim répétant des séquences, sans prendre de fréquence en compte, sont indiquées dans la Figure 5 a et 5 b, respectivement. Notez que dans la Figure 5 a pour l’objectif du PA, plusieurs des séquences répétées individuels eux-mêmes contiennent la séquence consensus WFCFTC (ou une séquence similaire), soulignée en rouge, qui a été déterminée en appliquant Jalview des logiciels d’analyse d’un Kalign alignement de séquences des séquences répétées. Ce consensus, comme WXCFTC, était précédemment déterminé à être un consensus de liaison PA, qui donne confiance dans la méthode de tri 9. Dans la Figure 5 b, où les séquences répétées pour la cible de moslim ont été analysées de la même manière, le résultat était très différent. Tout d’abord, il y avait seulement cinq séquences qui répète au 4ème tour de criblage pour des liants de moslim, plutôt que les quinze séquences répétitifs isolés de 4 ronds de criblage pour les liants PA (bien que 44 % plus colonies ont également séquencés pour PA). Deuxièmement, aucun des cinq séquences répétées contenait la séquence plus prometteuse de « consensus » (FWAWF, souligné en violet), bien que candidat AX-A15 contenait la séquence qui le mieux assorti (FWDTWF). Une analyse plus approfondie, y compris la liaison affinité et spécificité détermination, aidée à fournir le consensus des FWDTWF déterminée par les cinq meilleurs candidats pour la liaison de moslim dans la Figure 5, tel qu’expliqué ci-dessous.
Une colonie représentatif de chaque séquence à répétition peut être analysée plus sur cellules affinité et spécificité à l’aide de FACS, comme dans la Figure 6 a pour les séquences répétées de protéines, de peptides de liaison moslim. Ici, il est clair que tous les cinq séquences répétées ont une affinité plus élevée pour moslim, le but visé, que rivax, la protéine structurellement similaire utilisée pour le tri négatif ou streptavidine placés en aval, qui est présent pendant le tri à cause des billes magnétiques utilisés pour criblage. Cela concorde avec les résultats déjà prometteurs pour affinité et spécificité des tours tris illustré à la Figure 3, où il est clair que l’enrichissement pour la liaison à la cible visée, moslim, augmente à chaque tour de protéines tout en affinité pour la protéine similaire, rivax, n’est pas. Toutefois, une séquence consensus satisfaisante n’était pas déterminée pour du tri moslim qui utilise la répétition de séquences chez le seul tour 4 (Figure 5 b et surtout la discussion). Retour aux 100 colonies séquencées du 4ème tour, cependant, il a été noté par oeil lorsque vous cherchez des séquences semblables à la meilleure correspondance pour le consensus prédit qu’un candidat supplémentaire, AX-A12, contenue la séquence FWDTWF qui a été notée dans isoler AX-A15 , et qu’un autre candidat, AX-A14, contenait une semblable de la séquence, DWNTWF. Ces et autres séquences qui contenaient des similitudes avec les séquences répétées, a montré des similitudes avec d’autres séquences non répétitif ou ont été choisis au hasard, ont été analysés par FACS pour affinité et une spécificité de liaison. Ceux testés sont classés en Sarkes al 2016 1 et les 5 liants Albums de cette analyse sont affichés dans la Figure 6 b, avec la séquence consensus établie que FWDTWF, illustré à la Figure 5.
Une analyse similaire de l’affinité pour répéter des séquences peptidiques dans le 4ème tour de criblage pour les peptides qui reconnaissent la cible PA a révélé que les meilleurs liants, classées par le rapport entre les PA-488 nMFI:SAPE IFNM, contenaient le consensus WXCFTC ou similaire séquence (tableau 1). Avec ce rapport, les séquences organise entre ceux qui contenait le consensus et ceux qui n’ont pas. Les meilleurs candidats, contenant toutes les séquences reliées au consensus, ont été analysés de la même façon aux méthodes décrites ci-dessus pour moslim dans la Figure 6, telle que présentée dans Sarkes al 2015 14. Ces résultats démontrent que pour certaines cibles, analyse des peptides avec répétition de séquences peut-être suffire pour obtenir des liants avec affinité significative et spécificité pour une cible choisie et à déterminer une séquence consensus qui peut être, en soi, suffisante pour la liaison. Notez, cependant, que le nombre de répétitions ne reflète pas nécessairement l’affinité relative pour la cible d’intérêt (tableau 1). Lorsque l’analyse de répéter les séquences seuls ne suffit pas à déterminer un motif, il est utile d’alterner entre le séquençage et l’analyse de liaison pour affiner l’ensemble des candidats et de réexaminer les tendances parmi les candidats avec une affinité plus élevée . Même si on observe une tendance d’analyser les séquences répétées seuls, séquences supplémentaires non répétitif peuvent démontrer les mêmes tendances, ou autres tendances, à la poursuite de l’enquête.
Figure 1 : schéma du protocole de protéines bactériennes affichage bibliothèques. Tel qu’illustré ici, bibliothèques d’affichage bactérienne de protéines est un processus cyclique. Chaque cellule dans la bibliothèque d’affichage bactérienne (voir table des matières) contient l’ADN plasmidique qui est maintenu tant que les cellules sont cultivées en présence de l’antibiotique pour lesquels le plasmide contient un gène de résistance (choloramphenicol dans ce cas). Chaque plasmide encode également la protéine d’échafaudage affichage qui expose un peptide aléatoire à l’extérieur de la cellule. Étant donné que chaque cellule doit contenir uniquement une séquence d’ADN de plasmide, chaque cellule doit afficher uniquement un seul peptide, dans de multiples endroits tout au long de la membrane cellulaire. Selon le niveau de la diversité de la bibliothèque au début de criblage et après chaque tour de tri, la séquence d’ADN peut ou peut ne pas être unique de cellule en cellule. Protéines commence avec la croissance et l’induction de la bibliothèque de la cellule pour afficher les différents peptides sur leur membrane externe. Ces peptides peuvent ensuite interagir avec une protéine cible (qui est biotinylated ou autrement marquées pour la capture). Pour cellule magnétique activé tri (MCS), protéine non lié est éliminé et les cellules sont incubées avec des billes magnétiques qui sont recouverts d’une protéine de capture (streptavidine dans cet exemple, qui a une forte interaction avec la biotine). La culture entière est alors exposée à un aimant pour séparer les cellules liées de cellules non liés. À l’aide d’un dispositif automatisé de tri magnétique est préféré pour la séparation des cellules réduire les faux positifs. Illustré ici est une sorte de positive, dans lequel les cellules qui sont liés à et éluer conjointement avec les billes magnétiques sont conservés. Pour une sorte de négative, qui nous effectuons habituellement à l’avant, le processus est le même, sauf que les cellules qui sont lavés hors de billes magnétiques sont conservés à la place. La fraction de la bibliothèque d’intérêt, lié (tri positif) ou indépendant (tri négatif), est cultivé du jour au lendemain et utilisé dans le prochain cycle de tri. Chaque ronde subséquente des protéines positif exige une diminution de volume cible de concentration et de perle pour améliorer la rigueur. Après chaque tour de criblage, affinité et spécificité des peptides pour la cible de protéine sont évaluées à l’aide de cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour aider à déterminer quand arrêter de criblage et de commencer à enquêter sur des candidats individuels. Au besoin, séquençage de l’ADN et l’analyse de la séquence peptidique sont effectuées. Ces étapes de l’analyse peuvent être en soi un processus cyclique, particulièrement pour révéler les tendances chez les isolats individuels après la finale de criblage. À ce stade, tendances de séquence peptidique et/ou un consensus sont corrélé avec liaison affinité et spécificité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : exemple données pour l’analyse de FACS de tri séries : cible PA. Affinité déterminée par FACS est indiquée après 4 tours de criblage (tri positif) les bactéries choisi afficher la bibliothèque de peptides de liaison à la cible, l’antigène protecteur (AP). Cela a été effectuée après accomplir d’abord une sorte de négative contre les streptavidine des billes magnétiques. Pour l’évaluation de la liaison, les cellules ont été induites avec 0,4 % L-arabinose pendant 90 min avant l’incubation avec des solutions cibles et le contrôle et l’analyse de FACS. Analyse d’affinité pour la cible de liaison est convertie (boxed) en rouge. Montré ici sont les diagrammes de dispersion du FITC-A vs FSC-A et des valeurs pour les cellules pourcentage liés (par comparaison avec le témoin négatif gated incubé avec du PBS seul) et normalisée d’intensité de fluorescence médian (IFNM, par rapport au témoin exempt de peptide négatif incubé avec la même protéine marquée fluorophore) des cellules induites qui ont été incubées pendant 45 min avec : PBS de tampon seul, 150 nM YPet Mona (contrôle positif pour l’expression de peptide) ou 250 nM PA-488 (étiqueté cible). Notez l’enrichissement croissant en affinité pour la cible d’intérêt après chaque tour de criblage. Contrairement à la Figure 3, toutes les séparations de cellules autoMCS ont été réalisées à l’aide du programme Posselds. Partie de ces données peut également être visualisée dans les diagrammes de dispersion du FITC-H vs FSC-H dans Sarkes al 2015 14 pour la comparaison à la FITC-A vs parcelles FSC-A montré ici. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : données d’exemple pour l’analyse des FACS de tri séries : cible de moslim. Similaire à la Figure 2, montrée ici est comparative affinité pour une expérience complète de protéines, tel que déterminé par les FACS. La bibliothèque d’affichage bactérienne a été soumise à un tri négatif contre les streptavidine billes magnétiques, comme illustré à la Figure 2, mais a été ensuite soumise à un cycle supplémentaire de tri négatif contre une protéine homologue ayant une structure similaire et fonction, rivax, avant d’effectuer 4 tours de criblage positive pour les peptides de liaison à la cible visée, moslim. Pour l’évaluation de la liaison, les cellules ont été induites avec 0,4 % L-arabinose pendant 45 min avant la liaison à la cible, contrôle positif et témoins négatifs et de la lecture sur les FACS. Affinité pour le but visé est convertie (boxed) en rouge. Montré ici sont les diagrammes de dispersion du FITC-A vs FSC-A (ou PE-A vs FSC-A dans le cas de SAPE) et les valeurs de pourcentage cellules liées (par comparaison avec le témoin négatif gated incubé avec du PBS seul) et IFNM d’induite par les cellules qui ont été incubées pendant 45 min avec : PBS tampon seul, 150 nM YPet Mona (contrôle positif pour l’expression de peptide), 250 nM moslim-488 (cible de protéines marquées), 250 nM Rivax-488 (étiqueté cible potentielle des protéines une réaction croisée) ou 250 nM SAPE (témoin négatif pour une liaison directe à streptavidine billes magnétiques). Notez l’enrichissement croissant en affinité pour la cible d’intérêt, moslim, après chaque tour de protéines et un minimum affinité pour la protéine de structure similaire, rivax. Contrairement à la Figure 2, positive protéines 1er tour a été réalisée à l’aide des autoMCS Posselds programme tandis que tri rondes subséquentes ont été achevés en utilisant le programme Posseld, comme l’a proposé pour les protéines dans ce manuscrit. Ces données peuvent également être visualisées dans les diagrammes de dispersion du FITC-H vs FSC-H dans Sarkes al 2016 15 pour la comparaison à la FITC-A vs parcelles FSC-A montré ici. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : analyse de la séquence exemple de sortie à l’aide de la macro « eCPX_Sequencing ». Montré est une capture d’écran de 48 colonies séquencées de 4 ronds de criblage la bibliothèque choisi affichage bactérienne pour les liants de PA à l’aide de la méthode Posselds. La feuille « Tableau récapitulatif » est montrée ici. Notez que les colonies ont été numérotés dans l’ordre alphabétique de leur nom de fichier donné durant le processus de séquencement et que les zones entourant les séquences qui se répètent au moins une fois sont présentées dans des couleurs différentes pour l’analyse de données plus facile. La macro eCPX_Sequencing est fournie dans un fichier de code supplémentaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : détermination de l’alignement et le consensus pour deux protéines distinctes cibles de séquence. Toutes les images présentées ici ont été produites à Jalview logiciel avec la coloration après avoir aligné les séquences à l’aide de logiciels en ligne analyse Kalign 51Clustal_X. A) l’alignement de répéter les séquences de protéines PA rond 4 (correspond au tableau 1). B) alignement de répéter les séquences de protéines moslim ronde 4 (correspond à la Figure 6 a). C) alignement des 5 candidats de criblage de moslim ronde 4, tel que déterminé par l’analyse de FACS des candidats individuels (correspond à la Figure 6 b). La ligne rouge souligne la séquence consensus en A et C, alors que la ligne violette b souligne le précurseur de la séquence consensus déterminé pour moslim obligatoire lors de l’examen des séquences répétées seulement, soulignant le potentiel de besoin de tester l’affinité de liaison à l’aide de FACS avant un consensus peut être déterminé dans certains cas. Alignements semblables générés avec les logiciels d’analyse différent peuvent être vu dans Sarkes al 2015 14 et Sarkes al 2016 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : exemple liaison affinité et spécificité pour les candidats individuels analysés à l’aide de FACS. L’intensité de fluorescence médian normalisé (IFNM) déterminée au moyen des FACS pour séquences A) extensible et B) les 5 premiers candidats, tel que déterminé par affinité comparative pour la cible, moslim, du 4ème tour de criblage est présentée ici. Les données représentent la moyenne (barres) et la déviation standard (barres d’erreur) de trois expériences indépendantes de répliquer. Notez que tous les candidats indiqués sont assez précises pour moslim (barres de moslim-488, vertes) sur une protéine de structure similaire, rivax (barres de Rivax-488, rouges) et le contrôle négatif de streptavidine (SAPE, barres noires). Bien que deux des séquences répétées dans un (07-AX et AX-15) étaient aussi parmi les candidats de top 5 en B, la comparaison des résultats en A et B montrent que l’analyse de répéter les séquences seul ne suffisent pas pour isoler les peptides d’affinité plus élevées. Données présentées ici sont une adaptation de Sarkes al 2016 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : taux de fixation spécifique aux liaisons non spécifiques pour les candidats individuels de répéter. Dans cet exemple, le nombre de séquences répétées et le ratio de PA (cible) IFNM à IFNM SAPE (témoin négatif) sont indiqués pour les séquences de candidat extensible de criblage PA tour 4. Ces données a été triées par rapport relatif de l’IFNM du nMFI:SAPE PA et analysées pour la présence de consensus WXCFTC connu, ou une séquence similaire, ce qui est indiquée en caractères gras et soulignée. Notez que les séquences s’auto-organiser tel que les candidats avec le consensus ont le plus haut ratio d’IFNM nMFI:SAPE de PA et donc interagissent plus précisément avec la cible. Les résultats affichés proviennent d’une seule expérience de FACS. Peptides ayant une affinité plus faible pour la cible ont été exclus les répétitions supplémentaires et d’analyse qui ont été publiés dans Sarkes al 2015 14.
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Les auteurs n’ont rien à divulguer
Protéines bactériennes affichage bibliothèques est une technique éprouvée pour la découverte des réactifs de peptide d’affinité, une alternative robuste aux anticorps. La méthode de tri semi-automatisée ci-après a rationalisé les protéines pour diminuer l’apparition de faux positifs. Nous illustrons ici le processus de pensée et des techniques appliquées à l’évaluation des candidats et en minimisant l’analyse en aval.
Les auteurs tiennent à souligner l’appui de la programme de bourses postdoctorales US Army Research Laboratory (ARL), administrés par les universités de Oak Ridge Associated grâce à un contrat avec ARL, par le biais de la nomination du Dr Justin P. Jahnke. Reste du financement a été fourni par les capteurs et les électrons périphériques Direction des ARL. Les auteurs tiennent également à remercier le laboratoire Daugherty UCSB pour partager l’écran bactérienne Bibliothèque et information pour le réactif de YPet Mona, Dr. Bryn Adams pour soutien à cloner le réactif de YPet Mona à ARL, Dr. Joshua Kogot pour ses premiers travaux sur le clonage et formation au criblage de bibliothèques d’affichage bactérienne, Alena calme d’Edgewood chimiques et biologiques Center pour le partage des plasmides utilisés pour exprimer et purifier moslim et protéines rivax, Brandi Dorsey pour le support technique pour l’isolation des peptides de liaison PA, Qin Guo pour le support technique des expériences préliminaires pour l’isolement des peptides de liaison de moslim et Dr Jessica Terrell pour discussions utiles au sujet de ce manuscrit.
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | Séparateur de cellules automatisé pour utilisation avec des billes magnétiques |
| Luria Broth, Miller (LB) | Fisher Scientific | BP1426-500 | Milieu de croissance |
| Chloramphénicol | Fisher BioReagents | BP904-100 | Antibiotique |
| Agar | Fisher Scientific | BP2641-500 | Agent |
| épaississant/gélifianteCPX 3.0 Bacterial Display Peptide | Library Cytomx Therapeutics | N/A ; http://cytomx.com/contact/ | On-cell peptide display library. Fourni par des collaborateurs de l’USCB. |
| L-arabinose | Sigma | A3256-500G | Sucre, pour l’induction de l’expression protéique |
| Phosphate Saline tamponnée pH 7,4 (PBS) | Amresco | 0780-10L | Tampon |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotine, No-Weigh | Thermo Scientific | PI21327 | Ajoute une molécule de biotine aux amines primaires |
| Perce Kit de quantification de la biotine | Thermo Scientific | PI28005 | Assure la liaison covalente de la molécule de biotine à la protéine |
| Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads | Invitrogen | 65601 | Perles magnétiques pour la capture des protéines congugées par la biotine |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma | A9647-100G | Protéine, utilisée comme agent bloquant pour la liaison non spécifique |
| D-glucose | Sigma | G8270-1KG | Sucre, pour la croissance et l’inhibition de l’expression inductible des protéines |
| Ypet, Mona | ,UCSB et ARL | N/A | : contrôle positif pour la surveillance de l’expression d’eCPX 3.0. Produit par des auteurs et des collaborateurs ; Voir les références 12 et 13. |
| Dylight 488 NHS Ester | Thermo Scientific | 46403 | Pour conjuguer une cible protéique à un fluorophore |
| Streptavidine, R-Phycoérythrine conjuguée (SAPE) | Thermo Scientific | S866 | Contrôle négatif pour la surveillance de la liaison non spécifique à la streptavidine |
| BD FACSFlow | Becton, Dickinson, and Company | 342003 | Tampon pour l’exécution de l’instrument FACS |
| autoMACS Colonnes | Miltenyi Biotech | 130-021-101 | Pour la séparation MACS |
| Tampon de fonctionnement autoMACS &ndash ; Tampon de séparation MACS | Miltenyi Biotech | 130-091-221 | Pour la maintenance des instruments autoMACS. Danger : contient 0,09 % d’azoture. |
| autoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi Biotech | 130-092-987 | Pour l’entretien des instruments autoMACS |
| 70 % Ethanol | VWR | E505-4L | Décontamination de l’autoMACS |
| Glycerol | Sigma | G6279-1L | Pour les stocks de congélation bactérienne |
| Chill 15 rack | Miltenyi Biotec | 130-092-952 | Pour la séparation MACS |
| BD FACSCanto II | Becton, Dickinson et société | 744810 ; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview | Pour l’évaluation de la liaison peptidique à la cible |
| BD FACSDiva Software | Becton, Dickinson et 659523 pour | l’évaluation de la liaison peptidique à la cible | |
| Dynabeads Concentrateur de particules magnétiques MPC-S | Thermo Scientific | A13346 | Séparateur de cellules de paillasse pour une utilisation avec |
| des billes magnétiques Séquençage de colonie | Genewiz | N/A ; https://www.genewiz.com/ | Services de séquençage d’ADN et de séquençage de colonie |
| Excel | Microsoft | 323021400 ; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 | À utiliser avec l’analyse de séquence macro |
| Antigène protecteur de l’anthrax (PA) | List Biological Laboratories, Inc. | 171 | Protéine cible utilisée comme exemple pour des résultats représentatifs. |
| Abrax | ECBC et ARL | N/A | Protéine cible utilisée comme exemple pour des résultats représentatifs. Produit par des auteurs et des collaborateurs ; Voir les références 1 et 15. |
| Rivax | ECBC et ARL | N/A | Protéine cible utilisée comme exemple pour des résultats représentatifs. Produit par des auteurs et des collaborateurs ; Voir les références 1 et 15. |
