Method Article

Criblage à haut débit pour l’héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode de haut-débit pour dépister fonctionnellement héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le codage de l’information biologique qui est accessible aux générations futures est généralement réalisé par l’intermédiaire de modifications apportées à la séquence d’ADN. Longévifs héritage codé en protéine conformation (au lieu de séquence) a longtemps été considéré comme paradigme, mais rares. Les exemples les mieux caractérisées de tels éléments épigénétiques sont des prions, qui possèdent un comportement auto-assemblage qui permet de piloter la manifestation héréditaire de nouveaux phénotypes. Prions archétypales beaucoup affichent un biais de séquence riche en N/Q frappant et assemblent dans un giron amyloïde. Ces caractéristiques inhabituelles ont informé la plupart des efforts dépistage pour identifier de nouvelles protéines prion. Cependant, au moins trois prions connues (y compris le prion fondateur, PrPSc) héberger pas ces caractéristiques biochimiques. Nous avons donc mis au point une autre méthode pour sonder l’étendue de l’héritage à base de protéines basé sur un terrain d’action de masse : la passagère surexpression de la protéine prion augmente la fréquence à laquelle ils acquièrent une conformation self-création de modèles. Cet article décrit une méthode pour analyser la capacité de la levure ORFeome pour susciter l’héritage à base de protéines. En utilisant cette stratégie, nous avons constaté précédemment que > 1 % des protéines de levure pourrait alimenter l’émergence des traits biologiques qui étaient à long terme, stable et se pose plus fréquemment que la mutation génétique. Cette approche pouvant servir au haut débit à travers toute ORFeomes ou comme un paradigme de dépistage ciblé pour réseaux génétiques spécifiques ou des stimuli environnementaux. A l’instar des écrans génétiques avant définissent de nombreuses voies de signalisation et de développement, ces techniques offrent une méthodologie pour étudier l’influence de l’héritage basées sur les protéines dans les processus biologiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les systèmes biologiques expérience fréquemment des fluctuations transitoires dans l’abondance de la protéine. Ne sait pas si ceux-ci ont un impact durable dans l’élaboration du phénotype d’un organisme ou des générations futures. Les instances plus connus de cette biologie impliquent une classe rare des protéines prions, qui entraînent l’apparition de caractères héréditaires sans modification du génome. Au lieu de cela, ces particules de fectious proteinaceous et entransmettent les phénotypes via des changements qui se perpétues à la conformation de protéine1,2. Ce type d’héritage a été découvert comme étant la cause des modèles héritage inhabituelle d’une maladie neurodégénérative. Toutefois, des études dans les organismes allant des champignons aux mammifères3,4,5,6,7,8,9,10 ont révélé depuis que le prion comme éléments peuvent conférer la valeur adaptative. Néanmoins, les prions ont été considérées comme une fascinante mais rare curiosité biologique.

Cette sagesse qui prévaut est tenue en partie parce que la caractérisation de l’héritage à base de protéines a longtemps été limitée par un petit ensemble d’exemples. Les efforts récents de dépistage systématique ont élargi cette photo significativement en identifiant plusieurs nouveaux bona fide prions11 et protéines de près de deux douzaines de domaines12 avec la capacité de conversion conformationnelle de prion comme carburant. Cependant, puisque ces approches portent généralement sur des préjugés séquence des acides aminés, les prions qui ont été découverts partagent les propriétés biochimiques de la fondatrice levure prions [PSI+]13,14, [URE3]15et [RNQ+]11,16. Ceux-ci incluent : domaines 1) modulaires qui sont riches en longs polymères s’étend de l’asparagine (N) et de la glutamine (Q), ensemble 2) dans un amyloïde [PRION+] conformation17,18,19et 3) complet dépendance disaggregase Hsp104 fonction de multiplication fidèle de mère en fille13,20,21. En effet, nombreux bona fide prions, y compris [GAR+], [Het-s] et même l’origine prion (PrP-Sc), qui serait incomprise en vertu de ces critères stricts. Peut-être plus important encore, ils seraient incapables de capturer tout nouveaux mécanismes d’héritage à base de protéines,22. Ainsi, la vraie largeur biologique de ces phénomènes peut être beaucoup plus courante dans la nature que prévu.

Pour étudier cette question, a été employée une stratégie haut-débit, à l’échelle du protéome. Une caractéristique des prions tous, y compris les PrPSc, [GAR+], et [Het-s], est que la surexpression transitoire des causalité protéines augmente fortement le taux de prion acquisition15,23,24,25,26. Nous avons profité de cette fonctionnalité de systématiquement demander, sur l’ensemble de la levure ORFeome, si des États stables basées sur les protéines, épigénétiques pourraient être initiées par transitoirement induire la surexpression de protéines individuelles. Il est bien connu que la surexpression de protéines peut altérer les phénotypes27. Toutefois, la protéine prion est inhabituelle car leur surproduction temporaire produit un changement dans le phénotype c’est héréditaire pour plusieurs centaines de générations après la surexpression initiale. Nous avons déjà pris parti de cette fonctionnalité, ainsi que les patrons de succession inhabituelle d’éléments génétiques basées sur les protéines, à identifier des dizaines de protéines capables de duplications recâblage paysages phénotypiques sans altérer le génome28. Bien que certains ont identifié les protéines étaient anciennement prions, la plupart n’étaient pas, soulignant la puissance de cette approche pour découvrir de nouvelles formes d’héritage à base de protéines.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Surexpression initiale

  1. Transformer les cellules de levure (dans ce cas, BY4741 MAT a haploïdes) préalablement cultivées dans un liquide YPD (10 g d’extrait de levure, 20 g de peptone et 20 g de glucose pour 1 L) avec les constructions candidates souhaitées de la banque FLEXGene ORFeome (ORF de levure sous le contrôle d’un promoteur inductible au galactose dans le squelette plasmidique centromérique marqué URA3, pBY01129).
  2. Utilisez des cure-dents autoclavés pour choisir quatre colonies distinctes de ces transformations afin de servir de réplicats biologiques. Cultivez-les pendant 48 à 72 h dans 150 μL de SRaffinose-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés et 20 g de raffinose pour 1 L) dans des plaques de 96 puits. Inoculer les colonies du premier ORF dans le puits A1 de toutes les plaques, les colonies du deuxième ORF dans A2 de toutes les plaques, etc.
    REMARQUE : Toutes les étapes de croissance sont effectuées à 30 °C et à des niveaux atmosphériques de CO2 (407,05 ppm), sauf indication contraire.
  3. Confirmer que les cultures sont saturées (cellules visibles à l’œil nu au fond de chaque puits) et utiliser un robot de manipulation de liquides pour inoculer un réseau 1:4 de 1 μL de chaque puits à plaque de 96 puits dans 4 puits distincts d’une plaque de 384 puits remplie de 45 μL de SGal-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, et 20 g de galactose par puits.
    REMARQUE : Cela crée une plaque composite dans laquelle 4 répétitions biologiques de chaque ORF sont disposées dans un motif carré.
  4. En même temps, préparer des plaques distinctes de 384 puits contenant 45 μL de SGal-URA avec les facteurs de stress d’intérêt (p. ex., chlorure de manganèse à 20 mM) par puits. Inoculer cette plaque de la même manière qu’à l’étape 1.3.
    REMARQUE : Pour obtenir la plus grande plage dynamique pour la détection phénotypique, il est recommandé d’utiliser une série de dilutions 2 fois autour de la concentration DL50 d’un facteur de stress donné. Cela peut être fait à l’avance pour déterminer la concentration optimale à laquelle observer à la fois une croissance accrue et réduite.
  5. Comme dernier contrôle parallèle, inoculer une troisième plaque de 384 puits de la même manière, avec le même facteur de stress inclus dans le milieu qui n’induira pas l’expression plasmidique. Assurez-vous que la plaque contient 45 μL de SD-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés et 20 g de glucose par 1 L) par puits et qu’elle est inoculée comme aux étapes 1.3 et 1.4.
  6. Placez immédiatement les plaques avec les cellules sur un empileur de microplaques et réglez le protocole pour une boucle continue de 72 heures, en mesurant la DO600 avec un lecteur de microplaques équipé d’empileurs à température ambiante et au CO2 atmosphérique (407,05 ppm).
    Remarque : La fréquence de la mesure de la croissance dépendra du nombre de plaques (déterminé en fin de compte par le nombre de gènes et de conditions que l’enquêteur veut sonder) utilisées dans l’essai. Plus il y a de plaques utilisées, plus le lecteur de plaques mettra de temps à boucler une boucle et donc plus le temps entre les mesures sera long (le temps de mesure par plaque est de ~45 s, selon l’instrumentation utilisée).
  7. Après les mesures de croissance, utilisez le même robot de manipulation de liquide pour transférer 1 μL par puits des cultures induites par SGal-URA (c’est-à-dire celles qui ont présenté une surexpression des protéines) vers de nouvelles plaques de 384 puits contenant 45 μL de SD-URA par puits (milieu qui ne permet pas l’expression protéique du plasmide).
    1. En parallèle, effectuer des inoculations analogues d’un deuxième ensemble de plaques de 384 puits contenant 45 μL de SD-URA par puits à partir des cultures qui ont été cultivées dans du SD-URA en présence des facteurs de stress (c’est-à-dire celles de l’étape 1.5).
    2. Faites pousser les plaques pendant 48 h à 30 °C jusqu’à saturation dans une chambre humidifiée (c’est-à-dire un bac en plastique refermable avec un essuie-tout humide à l’intérieur).
  8. Prenez les plaques de l’étape précédente et réinoculez 1 μL par puits dans des plaques de 384 puits contenant 45 μL de SD-URA. Ensuite, effectuez une réinoculation distincte de 1 μL par puits à partir de la même plaque source dans une plaque distincte de 384 puits contenant 45 μL de SD-URA avec l’agent de stress.
    REMARQUE : Cela déterminera si les phénotypes de sensibilité/résistance à un facteur de stress persistent après la fin de la surexpression de la protéine.
  9. Placez immédiatement les plaques avec les cellules sur un empileur de microplaques et définissez le protocole pour une boucle continue de 48 heures mesurant la DO600 avec un lecteur de microplaques à température ambiante et au CO2 atmosphérique (407,05 ppm).
  10. Exportez les mesures de temps par rapport à OD600 sous forme de tableau XY à l’aide du logiciel de lecture de plaques. Regroupez les colonnes de la DO600 pour chaque répétitions biologiques et calculez la moyenne. Créez un graphique XY du temps en fonction deOD 600 pour générer des courbes de croissance.
    1. Comparez les taux de croissance des cultures qui avaient été soumises à une surexpression antérieure (c’est-à-dire celles induites à l’origine dans un milieu contenant du galactose avant la réinoculation dans le SD-URA) par rapport aux cultures qui ne l’avaient pas fait (c’est-à-dire celles qui s’étaient propagées dans le glucose), comme décrit précédemment 30.
  11. Pour les cultures qui présentent des différences de croissance significatives en réponse à un facteur de stress donné, en fonction de la surexpression de la protéine ancestrale, prélever 1 μL de chaque répétition biologique, le diluer dans 10 mL d’eau, puis mettre 50 μL sur des plaques contenant du 5-FOA (0,74 g de CSM-URA, 1 g de 5-FOA, 50 mg d’uracile, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, 20 g de glucose et 20 g de gélose par litre). Cultiver à 30 °C pendant 3 jours.
    1. Si cela se traduit par un nombre trop élevé ou insuffisant de colonies par boîte, ajustez le facteur de dilution en conséquence.
      Remarque : Le 5-FOA est converti en un intermédiaire toxique par la voie de biosynthèse de l’uracile. Cela provoquera une perte du plasmide d’expression marqué URA3 transformé dans un premier temps.
  12. Prélever 8 à 32 colonies individuelles avec des cure-dents autoclavés et les épingler sur des plaques de 96 puits contenant 150 μL de SD-CSM. Croissance jusqu’à saturation pendant 48 à 72 h dans une chambre humidifiée à 30 °C. Utilisez ces cultures pour inoculer deux nouveaux ensembles de plaques à 96 puits contenant 150 μL de SD-CSM, avec et sans les facteurs de stress de l’étape 1.11.
  13. Placez les plaques sur un empileur de microplaques et réglez le protocole pour mesurer l’OD600 sur une boucle continue de 48 heures.
  14. Analysez les données comme à l’étape 1.10 et confirmez que les différences de croissance significatives observées à l’étape 1.10 sont maintenues après la perte de plasmide.
    REMARQUE : Ces cellules hébergent des états phénotypiques stables qui pourraient être révélateurs d’une hérédité basée sur les protéines.
  15. Testez les cellules qui ont maintenu les phénotypes induits pour les caractéristiques classiques de l’hérédité basée sur les protéines (voir ci-dessous).

2. Tests pour l’héritage de type prion

  1. La « guérison » médiée par un chaperon
    1. Testez la dépendance du chaperon Hsp104.
      1. Choisir une colonie d’une souche de levure présentant un état phénotypique stable, s’étendre à des colonies simples sur une plaque YPD (10 g d’extrait de levure, 20 g de peptone, 20 g de glucose et 20 g de gélose pour 1 L) contenant 3 mM de GdnHCl et cultiver à 30 °C pendant 3 jours. En parallèle, de la même manière, il faut faire passer une colonie d’une souche naïve à des colonies uniques sur YPD+ 3 mM GdnHCl comme témoin.
      2. Répéter l’opération 2 fois de plus sur des plaques YPD fraîches contenant 3 mM de GdnHCl.
      3. Étant donné que l’exposition au GdnHCl peut augmenter la fréquence à laquelle les petites cellules apparaissent, choisissez plusieurs colonies qui ont subi 3 passages sur GdnHCl et vérifiez la respiration mitochondriale fonctionnelle en examinant leur capacité à se développer en colonies visibles sur les plaques YP-Glycérol (10 g d’extrait de levure, 20 g de peptone, 20 ml de glycérol et 20 g de gélose pour 1 L) après 7 jours.
      4. Prélever plusieurs colonies dans les plaques de glycérol YP et tester le maintien d’états phénotypiques stables en utilisant la croissance en présence du facteur de stress par rapport aux témoins non « guéris » et naïfs (c’est-à-dire des cellules isogéniques qui n’hébergent pas l’état phénotypique, comme les haploïdes BY4741 MAT) de la même manière que celle décrite à l’étape 1.13.
    2. Testez la dépendance du chaperon Hsp70.
      1. « Guérir » via un plasmide.
        1. Transformez à la fois des cellules naïves et des cellules hébergeant des états phénotypiques stables avec des plasmides marqués URA3 exprimant un allèle négatif dominant de Hsp70 (K69M)25,31 à partir d’un promoteur constitutif fort (GPD).
        2. Choisissez des transformants uniques pour chacun, striez en colonies simples sur une plaque SD-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, 20 g de glucose et 20 g de gélose pour 1 L), et cultivez pendant 3 jours à 30 °C et au CO2 atmosphérique
          3. .
        3. Répétez ce passage 2 fois de plus sur les plaques SD-URA.
        4. Choisissez plusieurs colonies et striez en colonies simples sur des plaques 5-FOA pour éliminer le plasmide.
        5. Choisissez plusieurs colonies uniques pour chaque isolat et testez la rétention (ou la perte) des états phénotypiques stables de la même manière que celle décrite à l’étape 1.13.
      2. « Guérir » par croisement génétique.
        1. Croisez BY4741 MAT, une souche haploïde hébergeant des états phénotypiques stables, et des souches naïves du type d’accouplement opposé (dans ce cas, BY4742 MATα) hébergeant des délétions génétiques dans deux des quatre paralogues Hsp70 de la levure (ssa1Δ ssa2Δ).
          REMARQUE : Cette souche est déficiente en fonction chaperonne Hsp70.
        2. Sélectionner pour la croissance des diploïdes en les striant en colonies simples sur un milieu à double chute SD-LYS-MET (0,74 g de CSM-LYS-MET, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, 20 g de glucose et 20 g de gélose par 1 L).
        3. Cueillir des colonies diploïdes simples et faire croître pendant 24 h à 30 °C dans 8 mL de milieu de pré-sporulation (0,8 % d’extrait de levure, 0,3 % de peptone, 10 % de dextrose et 100 mg/L de sulfate d’adénine).
        4. Faites tourner les cultures pendant 3 minutes à 3 000 xg, aspirez le milieu de pré-sporulation (pré-SPO) et lavez les granulés une fois avec de l’eau stérile.
        5. Remettre les pastilles en suspension dans 2 ml de milieu de sporulation (1 % d’acétate de potassium, 0,1 % d’extrait de levure, 0,05 % de glucose et 0,01 % de mélange d’acides aminés (2 g d’histidine, 10 g de leucine, 2 g de lysine et 2 g d’uracile)). Cultiver à 25°C pendant 5 jours.
        6. Déplacez les cultures à 30 °C et incubez pendant 48 h supplémentaires.
        7. Évaluez l’efficacité de la sporulation en recherchant la présence de tétrades à l’aide d’un microscope optique32.
        8. Prendre 40 μL de culture, tourner pendant 1 min à 3 000 xg dans un tube de 1,5 mL et remettre en suspension dans un volume égal de mélange d’enzymes zymolyase (1 M de sorbitol, 0,1 M d’EDTA et 10 mg/mL de zymolyase 100T)
        9. Incuber à 25 °C pendant 5 min.
        10. Appliquez 10 μL de culture digérée sur une plaque de gélose YPD très sèche et très plate et laissez la culture se répandre lentement le long de la plaque en ligne droite.
        11. Laisser sécher les plaques pendant au moins 30 min dans une hotte à flux laminaire.
        12. À l’aide d’un microscope de dissection, séparez les spores en tétrades et disposez-les sur la plaque.
        13. Permettre aux spores haploïdes individuelles de se développer en colonies et tester leur capacité à se développer sur des plaques SD-HIS-LEU (0,67 g de CSM-HIS-LEU, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, 20 g de glucose et 20 g de gélose par 1 L), indiquant qu’elles hébergent les deux délétions génétiques (ssa1Δ ssa2Δ).
        14. Tester chacun d’eux pour le maintien de l’état phénotypique dans le fond déficient en Hsp70 de la même manière que celle décrite à l’étape 1.13.
          REMARQUE : Le croisement de ces spores avec une souche de type sauvage avec la fonction Hsp70 restaurée ne devrait pas restaurer le phénotype du prion.
  2. Test de l’hérédité non mendélienne.
    1. Croisez BY4741 MAT, une souche haploïde abritant des états phénotypiques stables et naïve isogénique, avec une souche naïve isogénique du type d’accouplement opposé (dans ce cas, BY4742 MATα).
    2. Sélectionner pour la croissance des diploïdes en les striant en colonies simples sur un milieu à double chute SD-LYS-MET.
    3. Cueillir des colonies diploïdes simples et faire croître pendant 24 h à 30 °C dans 8 mL de milieu de pré-sporulation.
    4. Répétez les étapes 2.2.2.3 à 2.2.2.12, comme décrit ci-dessus.
    5. Laisser les spores haploïdes individuelles se développer en colonies et tester le maintien de l’état phénotypique par méiose à l’aide de l’essai de croissance, comme à l’étape 1.13.
      Remarque : Une autre caractéristique déterminante des prions est qu’ils peuvent être éliminés héréditairement par l’élimination de la protéine occasionnelle d’origine. Ainsi, le croisement analogue d’une souche prion avec une souche hébergeant une délétion génétique de la protéine induite d’origine abrogera les phénotypes de prions dans les spores qui héritent de la délétion. Notez également qu’il est possible que le prion soit maintenu dans un état « cryptique » chez un tel mutant si le gène supprimé est nécessaire pour manifester le phénotype du prion mais pas pour propager le prion lui-même. Pour distinguer ces deux possibilités, croisez les spores vers une souche sauvage naïve et testez si le phénotype du prion réapparaît dans un fond génétique diploïde, où la fonction du gène a été restaurée.
  3. Cytoduction.
    1. Générez la souche initiale du destinataire BY4742.
      1. Par transformation, introduire un allèle KAR défectueux (kar1-15) qui empêche la fusion nucléaire pendant l’accouplement23.
      2. Rendez cette souche « petite » (c’est-à-dire inapte à la respiration mitochondriale) en inoculant une seule colonie dans un bouillon YPD avec 0,25 % de bromure d’éthidium.
      3. Cultiver la culture à 30 °C jusqu’à la fin de la phase exponentielle/stationnaire (OD600 ~1).
      4. Diluer 1:1 000 dans du YPD frais avec du bromure d’éthidium à 0,25 % et répéter deux fois.
      5. Une fois que la culture atteint la phase exponentielle tardive/stationnaire précoce (DO600 0,8-1,2), la plaque en colonies simples en diluant 1:10 000 dans de l’eau stérile et en plaquant 50 μL sur une plaque YPD. Après une croissance de 3 jours à 30 °C, choisissez plusieurs colonies et testez chacune d’entre elles pour détecter l’insuffisance respiratoire en examinant leur capacité à se transformer en colonies visibles sur des plaques de YP-Glycérol après 7 jours.
    2. Effectuez une cytoduction initiale dans BY4742.
      1. Mélangez des cellules de la souche BY4741 du donneur présentant un état phénotypique stable avec des cellules de la souche naïve receveuse BY4742 kar1-15 à la surface d’une plaque de gélose YPD.
      2. Cultiver pendant 24 h à 30 °C et à la concentration atmosphérique de CO2 (407,05 ppm) et transférer dans un milieu de méthionine contenant du glycérol (SGly-MET : 0,74 g de CSM-MET, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, 20 mL de glycérol et 20 g de gélose pour 1 L).
        REMARQUE : Cela sélectionne les deux marqueurs nucléaires BY4742, tout en permettant la restauration des mitochondries fonctionnelles par échange cytoplasmique.
      3. Après 3 à 5 jours, choisissez plusieurs colonies uniques et effectuez un autre tour de sélection sur SD-MET (0,74 g de CSM-MET, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, 20 g de glucose et 20 g de gélose pour 1 L).
      4. En parallèle, confirmer que les colonies ne sont pas diploïdes en passant sur le milieu SD-LYS-MET.
    3. Effectuer des cytodductions inverses.
      1. Mélangez les nouvelles souches donneuses (cette fois-ci, les cytoductants BY4742 kar1-15 réussis) avec de petites cellules BY4741 naïves (générées comme ci-dessus) sur une gélose YPD.
      2. Répéter les cytoductions, comme décrit précédemment (étapes 2.3.2.1-2.3.2.4), à l’exception de la sélection pour le receveur du BY4741 de marqueurs nucléaires sur un milieu glycérol dépourvu de lysine (SGly-LYS : 0,74 g de CSM-LYS, 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, 20 ml de glycérol et 20 g de gélose pour 1 L).
      3. Choisissez plusieurs cytoductants et testez le maintien d’états phénotypiques stables à l’aide du test de croissance, comme précédemment à l’étape 1.13.
  4. Transformation des protéines.
    1. Préparez le lysat.
      1. Cultiver 50 mL de cellules hébergeant des états phénotypiques stables dans YPD pendant 18 h à 30 °C.
      2. Granulez les cultures à 3 000 x g pendant 4 min puis lavez deux fois : une fois dans du H2O autoclavé puis dans du sorbitol 1 M.
      3. Remettre les cellules en suspension dans 200 mL de tampon SCE (1 M de sorbitol, 10 mM d’EDTA, 10 mM de DTT, 100 mM de citrate de sodium et 1 comprimé d’inhibiteur de protéase sans mini-EDTA par 50 mL, pH 5,8) avec 50 U/mL d’enzyme lytique de levure 100T.
      4. Incuber le mélange à 35 °C pendant 30 min.
      5. Sonicer les cellules à 20 kHz et à 20 % d’intensité pendant 10 s sur glace avec un démembrateur sonique.
      6. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 10 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
      7. Déplacer les surnageants dans un tube propre et ajouter la RNase I et la DNase biotinylée à un excès de 3 fois (déterminé par les unités d’activité) et incuber à 37 °C pendant 1 h.
      8. Éliminer la DNase I en ajoutant l’excédent de billes de streptavidine-agarose, en incubant pendant 5 minutes et en granulant par centrifugation à 10 000 x g pendant 1,5 min.
      9. Transférez le surnageant dans un tube frais.
    2. Préparez le sphéroplaste receveur.
      1. Cultiver 5 mL de cellules receveuses naïves dans la YPD jusqu’à la phase mi-exponentielle (DO600 variant de 0,5 à 1).
      2. Récolter par centrifugation (3 000 x g pendant 4 min) et laver 4 fois : deux fois en H2O et deux fois en 1 M de sorbitol.
      3. Remettre les cellules en suspension dans 1 M de sorbitol contenant 200 U/mL d’enzyme lytique de levure et incuber pendant 15 min à 35 °C pour digérer les parois cellulaires.
      4. Récoltez les sphéroplastes obtenus avec une centrifugation douce à 600 x g pendant 5 min et lavez-les avec 1 ml de sorbitol 1 M, puis à nouveau avec 1 ml de tampon STC (1 M de sorbitol, 10 mM de Tris pH 7,5 et 10 mM de CaCl2).
      5. Remettre en suspension les sphéroplastes lavés dans 50 μL de tampon STC.
        REMARQUE : Utilisez des ciseaux pour couper les derniers ~0,7 cm d’une pointe de pipette ; Cela créera une bouche plus large et empêchera la lyse des sphéroplastes.
    3. Transformer les cellules naïves avec des protéines.
      1. Transformez 50 μL d’aliquotes de sphéroplaste avec 50 μL de lysat de donneur, 20 μL d’ADN de spermatozoïde de saumon (2 mg/mL) et 5 μL d’un plasmide de sélection marqué URA3 (p. ex., pAG426-GFP)28,33.
      2. Incuber le mélange à 25 °C pendant 30 min.
      3. Centrifuger pendant 5 min à 600 x g pour recueillir les sphéroplastes et les remettre en suspension dans 150 μL de tampon SOS (1 M de sorbitol, 7 mM de CaCl2, 0,25 % d’extrait de levure et 0,5 % de peptone).
      4. Récupérez pendant 30 min à 30 °C.
      5. Plaquez toute la culture sur des plaques SD-URA.
      6. Superposer rapidement la culture en plaque avec du SD-ura chaud (~45 °C) CONTENANT 0,8 % d’agar.
        Remarque : Cela empêchera les sphéroplastes d’éclater
      7. Incuber les plaques de transformation pendant 2-3 jours à 30 °C.
      8. À l’aide d’un cure-dent, choisissez les cellules en croissance de la plaque recouverte et retracez les stries en colonies uniques sur les plaques SD-URA.
      9. Choisissez des dizaines de colonies pour chacune et striez sur des plaques 5-FOA pour éliminer le plasmide porteur marqué URA3.
      10. Choisissez les colonies qui poussent sur les plaques 5-FOA et testez le transfert d’états phénotypiques stables à l’aide du test de croissance, comme précédemment (étape 1.13).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La surexpression des protéines est connue pour modifier considérablement les phénotypes cellulaires27. En effet, avec une approche de criblage initial, des centaines de nouveaux phénotypes ont été récupérés de manière reproductible à partir de la surexpression de clones de la levure ORFeome en utilisant seulement dix facteurs de stress. Cependant, les tests décrits ci-dessus permettent d’évaluer si les cellules conservent des phénotypes stables à long terme après c...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les premiers prions de levure ont été identifiées par leurs phénotypes inhabituelles et modèles déconcertants de l’héritage. Les caractéristiques de ces prions ont ensuite servis à construire des algorithmes et des outils informatiques pour dépister les protéines prions supplémentaires. La méthode décrite ici, en revanche, est expérimentale et s’appuie sur la surexpression transitoire pour créer une écurie durable de changement-a état codé dans la conformation des protéines. Toutefois, si l’efficacité du « ensemencement ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She et Susan Lindquist ont aidé à développer les dosages utilisés dans ce document, ainsi que les réviseurs pour leurs commentaires judicieux.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chlorhydrate de guanidineSigmaCat#G3272-25G
Chlorure de manganèseSigmaCat#M8054-100GBromure
d’éthidiumchimique SigmaE1510Acide
5-fluoroorotiqueSigmaCat#F5013-50MGChimique
BY4741 MATa (his3&Delta ; 1 leu2 et Delta ; 0 LYS2 met15&Delta ; 0 ura3 et Delta ; 0)Winston et al., 1995 ; Brachmann et al., 1998N/A Souchelevure
BY4741 MAT&alpha ; (his3&Delta ; 1 leu2 et Delta ; 0 lys2 et Delta ; 0 MET15 ura3&Delta ; 0)Winston et al., 1995 ; Brachmann et al., 1998N/ASouche de levure
Hsp70 (K69M)  ;Jarosz et al., 2014bN/APlasmide
FLEXGene libraryHu et al., 2007N/ABibliothèque de plasmides
Dextrose (glucose)Fisher ScientificD16-3Composant multimédia
RaffinoseSigmaR0250-25GComposant multimédia
GalactoseFisher ScientificBP656-500Composant multimédia
CSMSunrise Science1001-100Composant multimédia
CSM-URASunrise Science1004-100Composant multimédia
CSM-LYSSunrise Science1032-100Composant multimédia
CSM-METSunrise Science1019-100Composant multimédia
CSM-LYS-METSunrise Science1035-100Composant multimédia
extrait de levureFisher ScientificBP1422-2Composant du milieu
peptoneResearch Products InternationalP20240-5000Composant du milieu
bacto-peptoneBD211677Composant du milieu
glycérolEMD MilliporeGX0185-2Composant du milieu
d’azote de levure sans acides aminésBD291920Composant du milieu
agarIBI ScientificIB49172Composant multimédia
Adéninesulfate SigmaA3159-25GComposant multimédia
Acétate de potassiumSigmaP1190-500GComposant multimédia
UracilSigmaU0750-100GComposant multimédia
HistidineSigmaH8000-100GComposant multimédia
LeucineSigmaL8000-25GComposant multimédia
LysineSigmaL5501-25GComposant multimédia
RNaseThermo Fisher ScientificEN0601Enzyme
DNase biotinyléeThermo Fisher ScientificAM1906Enzyme
zymolyase 100T (enzyme lytique de levure)Sunrise ScienceN0766555Enzyme
Lecteur de microplaquesBioTekSynergy H1Équipement
Empileur de microplaquesBioTek BioStack3
Équipement Plaque remplisseuseBiotTekEL406
Équipement Robot de manipulation de liquidesBeckman CoulterBiomek FXEquipment
chimique de base

References

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