Article de méthode

Criblage de nanoparticules bioactives dans des cellules immunitaires phagocytaires pour les inhibiteurs de la signalisation des récepteurs de type péage

DOI :

10.3791/56075

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26 juillet 2017

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1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

Dans cet article

Résumé

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La signalisation des récepteurs à péage (TLR) joue un rôle important dans la pathophysiologie de nombreuses maladies inflammatoires humaines et la régulation des réponses TLR par nanoparticules bioactives devrait être bénéfique dans de nombreuses conditions inflammatoires. Les cellules rapporteurs à base de cellules THP-1 fournissent une plate-forme de dépistage polyvalente et robuste pour identifier de nouveaux inhibiteurs de la signalisation TLR.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La régulation pharmacologique des réponses des récepteurs Toll-like (TLR) est très prometteuse dans le traitement de nombreuses maladies inflammatoires. Cependant, des composés limités ont été disponibles jusqu'ici pour atténuer la signalisation TLR et il n'y a pas eu d'inhibiteurs cliniquement approuvés de TLR (à l'exception de l'hydroxychloroquine antipaludique) en usage clinique. À la lumière des progrès rapides de la nanotechnologie, la manipulation de la réactivité immunitaire à l'aide de nano-dispositifs peut constituer une nouvelle stratégie pour traiter ces maladies. Nous présentons ici une méthode de dépistage à haut débit pour identifier rapidement de nouvelles nanoparticules bioactives qui inhibent la signalisation TLR dans les cellules immunitaires phagocytaires. Cette plate-forme de criblage est construite sur des cellules rapporteurs à base de cellules THP-1 avec des tests colorimétriques et de luciférase. Les cellules rapporteurs sont conçues à partir de la lignée cellulaire monocytaire THP-1 humaine par intégration stable de deux constructeurs de rapporteurs inducibles. On exprime un gène de phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP)Sous le contrôle d'un promoteur inducible par les facteurs de transcription NF-κ B et AP-1, et l'autre exprime un gène rapporteur de luciférase sécrété sous le contrôle de promoteurs inducibles par des facteurs régulateurs d'interféron (IRF). Lors de la stimulation TLR, les cellules rapporteurs activent Facteurs de transcription et ensuite produire SEAP et / ou luciférase, qui peuvent être détectés en utilisant leurs réactifs de substrat correspondants. En utilisant une bibliothèque d'hybrides peptides-or nanoparticules (GNP) établis dans nos études précédentes comme exemple, nous avons identifié un hybride peptide-GNP qui pourrait inhiber efficacement les deux bras de la cascade de signalisation TLR4 déclenchée par son ligand prototypique, le lipopolysaccharide (LPS). Les résultats ont été validés par des techniques biochimiques standard, y compris l'immunoblot. Une analyse plus approfondie a montré que cet hybride responsable avait un large spectre inhibiteur, agissant sur plusieurs voies TLR, y compris TLR2, 3, 4 et 5. Cette approche expérimentale permet une évaluation rapide deLa nanoparticule (ou d'autres composés thérapeutiques) peut moduler une signalisation TLR spécifique dans des cellules immunitaires phagocytaires.

Introduction

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Les récepteurs Toll-like (TLR) sont l'un des éléments clés du système immunitaire inné contribuant à la première ligne de défense contre les infections. Les TLR sont responsables de la détection des agents pathogènes envahissants en reconnaissant un répertoire de motifs moléculaires associés aux pathogènes (ou PAMP) et en augmentant les réactions de défense par une cascade de transduction de signal 1 , 2 . Il y a 10 TLR humains identifiés; Sauf TLR10 pour lequel le ou les ligands restent incertains, chaque TLR peut reconnaître un groupe distinct et conservé de PAMP. Par exemple, TLR2 et TLR4, principalement situés sur la surface de la cellule, peuvent détecter les lipoprotéines et les glycolipides à partir de bactéries Gram-positives et Gram négatives, respectivement; Tandis que TLR3, TLR7 / 8 et TLR9, principalement présents dans les compartiments endosomaux, peuvent détecter les produits d'ARN et d'ADN à partir de virus et de bactéries 3 . Lorsqu'ils sont stimulés par les PAMP, les TLR déclenchent des réponses immunitaires essentielles en libérant pro-infLes médiateurs lammatoires, le recrutement et l'activation des cellules immunitaires effectrices, et la coordination des événements immunitaires adaptatifs subséquents 4 .

La transduction de signalisation TLR peut être simplement classée en deux voies principales 5 , 6 . L'un dépend du facteur de différenciation myéloïde de la protéine adaptateur 88 (MyD88) - la voie dépendante de MyD88. Tous les TLR, à l'exception de TLR3, utilisent cette voie pour activer le facteur nucléaire Kappa-chaîne légère activatrice de cellules activées B (NF-κB) et de protéines kinases associées à des mitogènes (MAPK), conduisant à l'expression de médiateurs pro-inflammatoires tels que le TNF- Α, IL-6 et IL-8. La deuxième voie utilise l'interféron-β inducteur d'adaptateur contenant le domaine TIR (TRIF) - la voie indépendante de la dépendance de TRIF ou de MyD88 - pour activer les facteurs de régulation de l'interféron (IFN) et NF-κ B, ce qui entraîne la production de IFN de type I. Signalisation TLR intacteEst essentiel à notre protection quotidienne contre les infections microbiennes et virales; Les défauts dans les voies de signalisation TLR peuvent entraîner une immunodéficience et sont souvent préjudiciables à la santé humaine. 7

Cependant, la signalisation TLR est un «épée à double tranchant» et une activation excessive et non contrôlée de TLR est nocive. Les réponses TLR hyperactives contribuent à la pathogenèse dans de nombreuses maladies inflammatoires humaines aiguës et chroniques 8 , 9 . Par exemple, la septicémie caractérisée par une inflammation systémique et une lésion multi-organique est principalement due à des réponses immunitaires aiguës et écrasantes à l'égard des infections, avec TLR2 et TLR4 jouant un rôle crucial dans la pathophysiologie du septicémie 10 , 11 , 12 . En outre, TLR5 a contribué à l'inflammation pulmonaire chronique de patients atteints de fibrose kystique 13, 14 . En outre, la signalisation TLR endosomale dysregulée (par exemple, TLR7 et TLR9) est fortement associée au développement et à la progression de plusieurs maladies auto-immunes, y compris le lupus érythémateux systémique (SLE) et la polyarthrite rhumatoïde (RA) 15 , 16 . Ces lignes convergentes de preuve identifient la signalisation TLR comme une cible thérapeutique potentielle pour de nombreuses maladies inflammatoires 17 .

Bien que la régulation pharmacologique des réponses TLR soit avantageuse dans de nombreuses conditions inflammatoires, malheureusement, il existe actuellement très peu de composés cliniquement disponibles pour inhiber la signalisation TLR 9 , 17 , 18 . Cela s'explique en partie par la complexité et la redondance des voies TLR impliquées dans l'homéostasie immunitaire et la pathologie pathologique. Par conséquent, la recherche de roman, potenLes agents thérapeutiques pour cibler de multiples voies de signalisation TLR pourraient combler une lacune fondamentale et surmonter le défi d'avancer les inhibiteurs de TLR dans la clinique.

À la lumière des progrès rapides de la nanocience et de la nanotechnologie, des nanodispositifs apparaissent comme les modulateurs TLR de nouvelle génération en raison de leurs propriétés uniques 19 , 20 , 23 . La taille nanométrique permet à ces nano-thérapeutiques d'avoir une meilleure distribution biologique et une circulation soutenue 24 , 25 , 26 . Ils peuvent être encore fonctionnalisés pour répondre aux profils pharmacodynamiques et pharmacocinétiques souhaités 27 , 28 , 29 . Plus activement, la bioactivité de ces nouveaux nanodispositions provient de leurs propriétés intrinsèques, qui peuvent être adaptées pourDes applications médicales spécifiques, plutôt que d'agir simplement comme un véhicule de livraison pour un agent thérapeutique. Par exemple, une nanoparticule à forte densité de lipoprotéines (HDL) a été conçue pour inhiber la signalisation TLR4 en éliminant le ligand TLR4 LPS 23 . De plus, nous avons développé un système hybride peptidique-nanoparticule d'or, où les peptides décorés peuvent altérer les propriétés de surface des nanoparticules d'or et leur permettre d'avoir diverses activités biologiques 30 , 31 , 32 , 33 . Cela en fait une classe spéciale de médicament (ou "nano-drogue") comme la nouvelle génération de nano-thérapeutique.

Dans ce protocole, nous présentons une approche pour identifier une nouvelle classe d'hybrides peptide-or nanoparticules (peptide-GNP) qui peuvent inhiber de manière efficace de multiples voies de signalisation TLR dans les cellules immunitaires phagocytaires 32 , 33 . L'approche est basée sur des lignées de téléphone journalières THP-1 disponibles dans le commerce. Les cellules rapporteurs sont constituées de deux constructeurs régulateurs stables et inducibles: l'un porte un gène de phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) sous le contrôle d'un promoteur inducible par les facteurs de transcription NF-κB et la protéine activatrice 1 (AP-1); L'autre contient un gène rapporteur de luciférase sécrété sous le contrôle de promoteurs inducibles par des facteurs de régulation d'interféron (IRF). Lors de la stimulation par TLR, la transduction du signal conduit à l'activation de NF-κB / AP-1 et / ou IRF, ce qui active les gènes rapporteurs sur le SEAP secret et / ou la luciférase; De tels événements peuvent être facilement détectés en utilisant leurs réactifs de substrat correspondants avec un spectrophotomètre ou un luminomètre. À l'aide de cette approche pour l'affichage de notre bibliothèque préalablement établie d'hybrides peptidiques-GNP, nous avons identifié des candidats principaux qui peuvent inhiber de manière potentielle les voies de signalisation TLR4. L'activité inhibitrice du peptide plomb-Les hybrides GNP ont ensuite été validés en utilisant une autre approche biochimique de l'immunoblot et évalués sur d'autres voies TLR. Cette approche permet un dépistage rapide et efficace de nouveaux agents ciblant les voies de signalisation TLR.

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Protocole

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1. Préparation des milieux de culture cellulaire et des réactifs

  1. Préparer le milieu de culture cellulaire complet R10 en ajoutant les suppléments de 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium dans le milieu RPMI-1640.
    1. Préparez le milieu de culture de sélection R10-Z en ajoutant les antibiotiques Zeocin (200 μg / mL) à R10 pour maintenir l'expression de SEAP sous le contrôle de l'activation NF-κB / AP-1. Pour sélectionner les cellules exprimant les gènes journalistes SEAP et luciférase, ajouter à la fois la zéocine (100 μg / mL) et la blasticidine (10 μg / mL) à R10 (comme R10-ZB).
  2. Préparer la solution de substrat SEAP en dissolvant un sachet de poudre de substrat (par ex., Quanti-bleu) dans 100 ml ultrapure, de l' eau sans endotoxine dans un ballon en verre de 125 ml propre.
    1. Faire tourner doucement la solution et l'incuber à 37 ° C pendant 1 h pour assurer la dissolution complète des substrats.
    2. Filtrer la solution à l'aide d'une membrane de 0,2 μm pour assurer sa stérilité (optionnelle) et la conserver à 4 ° C jusqu'à 2 semaines avant l'utilisation.
  3. Préparer la solution de substrat de luciférase en dissolvant une poche de la poudre de substrat ( par exemple , QUANTI-Luc) dans 25 ml d'eau ultrapure, sans endotoxine dans un tube de centrifugeuse stérile de 50 ml.
    1. Après avoir dissous complètement la poudre, utilisez la solution immédiatement. Sinon, conservez la solution à 4 ° C (jusqu'à une semaine) ou à -20 ° C (jusqu'à un mois) avant utilisation.
      ATTENTION: les deux solutions de substrat sont sensibles à la lumière et devraient éviter toute exposition à la lumière chaque fois que cela est possible. Les cycles multiples de congélation-décongélation de la solution peuvent provoquer une instabilité du substrat et raccourcir sa durée de conservation.
  4. Préparer la solution mère de 13-acétate de 13-myristate de phorbol (PMA) dans du diméthylsulfoxyde de qualité moléculaire (DMSO) pour avoir une concentration de 500 μg / mL. Faire des aliquotes de la solution mère (10 μL dans un tube de 500 μL) et les stocker à -20 ° C.
  5. Préparez la solution mère LPS (E-coli K12) dans de l'eau stérile et sans endotoxine à une concentration de 5 mg / mL, et faites des aliquotes pour un stockage à long terme à -20 ° C. Préparez une solution LPS fonctionnant en diluant le LPS stock dans une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 100 μg / mL et stockez à -20 ° C avant l'utilisation.
    ATTENTION: La préparation de réactif pour les utilisations de culture doit être effectuée dans un coffret de sécurité biologique et tous les récipients doivent être stérilisés avant utilisation. Les cycles de congélation-décongélation répétés des solutions PMA et LPS devraient être évités.

2. Culture des macrophages dérivés des cellules rapporteurs THP-1

  1. Utilisez deux lignées de téléphone journalières THP-1: cellules THP-1-XBlue et THP-1-Dual. Le premier a un gène régulateur SEAP contrôlé par NF-κB / AP-1, et ce dernier a un système de gènes rapporteurs, le même gène rapporteur SEAP et un gène luciférase contrôlé par IRF. leLes procédures de culture ir sont identiques sauf les médias de culture de sélection.
    1. Décongeler un stock de cellules de travail (~ 5 x 10 6 cellules) dans 10 ml de milieu R10, faire basculer les cellules à 300 xg pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu R10 et les transférer dans un flacon de culture T75. Échangez le milieu de culture tous les 2-3 jours jusqu'à ce que les cellules atteignent une densité de 1 x 10 6 cellules / mL.
    2. Lorsque la croissance cellulaire atteint sa capacité, les cellules de passage réduisent la densité cellulaire dans la gamme de 2-5 x 10 5 cellules / mL, de sorte que les cellules peuvent continuer à croître.
    3. Après au moins 1 passage, commencez à cultiver les cellules dans le milieu de culture de sélection: R10-Z pour THP-1-XBlue et R10-ZB pour THP-1-Dual. Après culture des cellules avec un milieu de culture de sélection pour au moins 1 passage, les cellules sont prêtes pour l'expérience.
      ATTENTION: le surcroissance cellulaire peut entraîner une mort cellulaire significative; La viabilité cellulaire devrait maintenir> 98%. Gardez un registre du numéro de passage en tant que celCela peut s'avérer différent après de nombreux passages (> 20 passages).
      NOTE: Les flacons de culture cellulaire peuvent être réutilisés plusieurs fois pour économiser des coûts; Cependant, cette pratique peut augmenter le risque de contamination générale et de contamination croisée entre différents flacons (si vous manipulez différentes lignées cellulaires en même temps). Pendant l'échange de média et le passage de la cellule, la centrifugation est réglée à 300 xg pendant 5 min.
  2. Pour effectuer un test de cellule rapporteur, les cellules de graines dans une plaque de culture cellulaire à fond plat à 96 puits et les différencier en macrophages. Les procédures sont décrites ci-après.
    1. Transférer les cellules du ballon à un tube de centrifugation, centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 minutes et les remettre en suspension dans le milieu R10 à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml. Ajouter des aliquotes de la solution PMA dans les suspensions cellulaires avec une concentration finale de 50 ng / mL.
    2. Transférer 100 μL des suspensions cellulaires dans chaque puits du 96-weLl en utilisant une pipette multicanaux. Incuber la plaque à 37 ° C (dans un incubateur à culture cellulaire) pendant 24 h.
    3. Après l'incubation, retirer soigneusement le milieu de culture à l'aide d'un aspirateur (ou avec une pipette à plusieurs canaux), et laver délicatement les cellules avec du PBS (100 μl / puits) deux fois; Ajouter 100 μL de milieu R10 frais dans chaque puits. Reposer les cellules pendant 2 jours dans un incubateur avant de mener le test du journaliste.
      ATTENTION: L'étape de repos est très importante pour permettre aux cellules de se calmer après la stimulation PMA dans leur état de tranquillité normale. Cela peut réduire considérablement les signaux de fond des gènes rapporteurs dans des conditions non stimulées.
      NOTE: Après une stimulation 24 avec PMA, les cellules sont différenciées en phénotype de type macrophage, avec une caractéristique de l'adhésion cellulaire au fond du puits et une caractéristique morphologique des pseudopodes.

3. Dépistage des Nano-inhibiteurs TLR4 potentiels à l'aide des Cellules Reporter

REMARQUE: Étant donné que la signalisation TLR4 utilise les voies dépendantes de MyD88 et dépendantes de TRIF, elle est sélectionnée comme cible principale pour englober une large gamme de voies de signalisation TLR. Les cellules journalières THP-1-XBlue sont utilisées pour examiner principalement l'activation NF-κB / AP-1 alors que les cellules THP-1-Dual sont destinées à l'activation IRF à partir de la transduction du signal dépendant de TRIF.

  1. Identifiez la dose optimale de LPS en générant une courbe dose-réponse avant le dépistage.
    1. Diluer la solution LPS fonctionnelle à une concentration finale de 0,01 à 100 ng / mL dans du milieu R10 (faire une dilution dans l'échelle log10). Concevez la conception de la plaque et faites la dilution dans une plaque de culture à fond de 96 puits. Assurez-vous que chaque puits a un minimum de 110 μl de solution après dilution.
    2. Retirez doucement le milieu de culture de la plaque à semences cellulaires (à partir de 2.2.3) en utilisant un aspirateur à vide.
    3. Transférer le LPS contenant le milieu R10 préparé dans la plaque de dilution (3.1.1) iDans la plaque de culture selon la disposition des échantillons. Incuber la plaque à 37 ° C (dans un incubateur à culture cellulaire) pendant 24 h.
    4. À 24 h, transférer soigneusement les surnageants (80 μL / puits) dans une nouvelle plaque à fond rond à 96 puits. Effectuer le dosage de luminescence colorimétrique et / ou luciférase sur ces solutions immédiatement ou les stocker à 4 ° C (plusieurs heures) ou -20 ° C (jours) avant le développement du dosage.
      REMARQUE: La conception de la disposition des plaques doit être simple et claire pour l'expérimentation et l'analyse des données. Pour chaque condition, 2-4 répétitions doivent être prises en considération. Toujours inclure un groupe témoin négatif (LPS null). Il est recommandé d'utiliser les cellules THP-1-XBlue pour l'activation NF-κB / AP-1 car les cellules Dual ont un fond relativement élevé de l'activation NF-κB / AP-1 après avoir été différenciées en macrophages. Cependant, il est possible d'utiliser les cellules Dual pour signaler l'activation NF-κB / AP-1 et IRF.
  2. Développez la couleurDosage imétrique pour l'activation NF-κB / AP-1 et le test de luminescence luciférase pour l'activation IRF.
    1. Pour évaluer l'activation NF-κB / AP-1, transférer 20 μL de surnageant de chaque échantillon dans une nouvelle plaque de culture à fond plat de 96 puits; Et ajouter 180 μL de solution pré-chauffée de substrat SEAP dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 - 2 h pour permettre le développement de la couleur (rose à bleu foncé). Recueillir l'absorption à 655 nm sur un lecteur de plaques.
      ATTENTION: Le temps d'incubation peut varier en fonction du développement de la couleur (30 minutes jusqu'à l'incubation durant la nuit). Il est recommandé d'attendre jusqu'à ce que la densité optique (OD) de la couleur la plus sombre dépasse 1, tout en évitant la saturation du développement de la couleur (OD> 3).
    2. Pour l'analyse de l'activation de l'IRF, transférer 10 μL de surnageant de chaque échantillon dans une plaque blanche à fond plat à 96 puits. Ajouter la solution de luciférase (50 μL) et collecter immédiatement la luminescence wPar le puits.
      REMARQUE: Il est fortement recommandé d'utiliser un lecteur de plaque à luminescence avec une fonction d'auto-injection pour assurer la cohérence dans la lecture de la luminescence du bien au puits et de la plaque à la plaque. Si les solutions de substrat sont injectées manuellement, assurez-vous un temps d'incubation constant et une configuration de lecture pour chaque puits.
  3. Effectuer le test de criblage sur divers hybrides peptidiques-GNP avec une stimulation LPS de 10 ng / mL (basée sur 3.1). Suivez la même procédure en 3.2 pour le développement du test journaliste.
    1. Concentrer les hybrides peptide-GNP à 200 nM dans un milieu R10 en utilisant la méthode de centrifugation. Centrifuger 20 volumes de la solution hybride (10 nM) à 18 000 xg pendant 30 min, et jeter soigneusement les surnageants. Collectez les hybrides (au bas du tube) dans un tube, lavez-les avec PBS deux fois et ré-suspendez les hybrides dans un volume du milieu R10.
    2. Mélanger les volumes égaux des hybrides concentrés et lesLPS (20 ng / mL) contenant du milieu R10 pour avoir une concentration finale des hybrides et LPS à 100 nM et 10 ng / mL, respectivement.
    3. Retirer le milieu de culture de la plaque cultivée (2.2.3) et ajouter 100 μL de la solution mélangée dans chaque puits (3 répétitions pour chaque condition); Inclure un contrôle négatif (moyen seulement) et un contrôle LPS (10 ng / mL LPS sans hybrides).
    4. Après 24 h d'incubation à 37 ° C, transférer le milieu de chaque puits dans un tube et centrifuger les tubes à 18 000 xg, 4 ° C pendant 30 min. Recueillir les surnageants (50-80 μL / tube) dans une plaque à fond rond à 96 puits, et effectuer l'analyseur rapporteur comme décrit dans 3.2.
      ATTENTION: Lors du rejet des surnageants après centrifugation, ne pas agiter les hybrides au bas du tube.
      NOTE: La centrifugation à l'étape 3.3.4 est très importante pour éliminer les hybrides de nanoparticules non internalisées du milieu de culture et peut éviter l'interférence des hybrides avec le coLectures lorimétriques / luminescence. C'est parce que les nanoparticules d'or peuvent absorber de larges longueurs d'onde en fonction de leur taille et de leur agglomération.

4. Validation de l'effet inhibiteur des candidats potentiels

NOTE: Pour confirmer l'effet inhibiteur des candidats potentiels à partir du dépistage, deux approches sont utilisées. L'un consiste à examiner les réponses de dose des stimulants (LPS) à une concentration hybride fixe (ou l'inverse); L'autre est de regarder directement l'inhibition sur les signaux NF-κB / AP-1 et IRF3 via immunoblot.

  1. Dans l'approche un, effectuez le dosage du journaliste avec 100 nM des hybrides de plomb et deux concentrations de LPS à 1 ng / mL et 10 ng / mL selon les mêmes procédures décrites dans 3.3. Inclure un hybride inactif (basé sur les résultats du dépistage) comme un contrôle hybride pour comparaison.
  2. Pour l'approche d'immunoblot, suivez la norme eProcédures expérimentales.
    1. Culturez les cellules THP-1 dans un milieu R10, graissez les cellules dans une plaque de culture à 12 puits (2 x 10 6 cellules / puits) et différenciez-les en macrophages en traitant les cellules avec 50 ng / mL de PMA pendant 24 h suivi d'un repos pendant 2 jours.
    2. Après la différenciation cellulaire, stimuler les cellules avec 10 ng / mL de LPS avec / sans les hybrides (100 nM) dans le temps (jusqu'à 4 h). Dans différents points de temps (0, 5, 15, 30, 60, 120 et 240 min), préparer les lysats cellulaires pour immunoblot. Inclure un hybride inactif comme contrôle.
    3. Protestez les signaux de IκBα, p65 phosphorylé et IRF3 phosphorylé pour examiner l'effet inhibiteur des hybrides de plomb sur l'activation de NF-κB et IRF3. Probez les signaux de β-actine et IRF3 totaux en tant que contrôles internes.
      NOTE: La transduction du signal se manifeste souvent beaucoup plus rapidement (en quelques heures) puis l'expression des enzymes rapporteurs SEAP et luciférase (24 h). Il est fortement recommandé de perforerLe test de viabilité des hybrides testés à 24 h comme autre méthode de validation.

5. Évaluation de la spécificité TLR

NOTE: Pour étudier la spécificité TLR du peptide lead-GNP, d'autres voies de signalisation TLR sont testées, y compris TLR2, TLR3 et TLR5. TLR7, 8 et 9 sont exclus parce que les macrophages dérivés de THP-1 ne répondent pas bien à la stimulation de ces TLR en raison du manque d'expression de TLR7, 8 et 9 dans les macrophages 34 .

  1. Testez diverses concentrations (1 ng / mL à 25 μg / mL) des ligands spécifiques à TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poly I: C) et TLR5 (flagelline) sur les deux cellules rapporteurs des macrophages dérivés pour obtenir la concentration optimale suivant la même Procédure de 3.1 et 3.2.
  2. Traiter les cellules avec les mélanges de l'hybride plomb (100 nM) et chaque ligand TLR à la concentration obtenue à partir de 5,1 pour évaluer la spécificité inhibitrice du plomb hYbrid selon la procédure expérimentale décrite au 3.3. Incluez l'hybride inactif comme témoin de comparaison.

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Résultats

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L'approche expérimentale globale est illustrée à la figure 1 . Les deux lignées de journalistes THP-1, THP-1-XBlue et THP-1-Dual, sont utilisées pour écouter rapidement les réponses TLR en sondant l'activation de NF-κB / AP-1 et IRF, respectivement. L'activation de NF-κB / AP-1 peut être détectée par le test colorimétrique SEAP, alors que l'activation IRF est surveillée par la luminescence luciférase. Les cellules monocycliques de THP-1 peuvent être facileme...

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Discussion

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Étant donné que les TLR sont impliqués dans la pathogenèse de nombreuses maladies inflammatoires, ils sont apparus comme des cibles thérapeutiques pour la modulation des réponses immunitaires et des affections inflammatoires. Cependant, le développement clinique de la thérapeutique pour inhiber les voies de signalisation TLR a connu un succès limité à ce jour. Le médicament antipaludique hydroxychloroquine qui inhibe TLR7 et TLR9 est en usage clinique 35 , 36 . ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Les auteurs souhaitent remercier le programme de professeur de nomination spéciale (Eastern Scholar) aux établissements d'enseignement supérieur de Shanghai (HY), le fonds de départ de Shanghai First People's Hospital (HY), le soutien de la médecine clinique Gaofeng de Shanghai Jiaotong La Faculté de médecine de l'Université (HY) et le financement de la Fondation canadienne de la maladie de Crohn et de la Colite (CCFC) (SET et HY).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
THP-1-XBlue cellule rapporteureInvivoGenthpx-spmaintenir le passage de la culture cellulaire sous 20
THP-1-Dual repotercell InvivoGenthpd-nfismaintenir le passage de la culture cellulaire en dessous de 20
RPMI-1640 (sans L-glutamine)GE Health CareSH30096.02Se réchauffer jusqu’à 37 ° ; C avant utilisation ; ajouter des suppléments pour faire un milieu complet R10
Sérum fœtal bovin (qualifié)Thermo Fisher Scientific12484028Chaleur inactivée ; 10 % dans le RPMI-1640
L-glutamineThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM dans le milieu complet R10
Pyruvate de sodiumThermo Fisher Scientific11360-0701 mM dans le milieu complet R10
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, 1X, sans calcium, magnésiumGE Health CareSH30028.02Utilisation pour le lavage cellulaire et la préparation de réactifs
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1Substrat SEAP
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Substrat luciférase
ZeocinInvivoGenant-zn-1Sélection des antibiotiques pour cellules
BlasticidineInvivoGenanti-bl-1Sélection des antibiotiques pour les cellules rapporteures
Diméthylsulfoxyde (DMSO) pour la biologie moléculaireSigmal-AldrichD8418-100MLUtilisation pour la préparation de réactifs
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pour la biologie moléculaireSigmal-AldrichP1585-1MGUtilisation pour la différenciation cellulaire
Lipopolysaccharide (LPS) d’E. coli K12InvivoGentlrl-eklpsTLR4 ligand
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsTLR2/1 ligand
Poly (I :C) HMWInvivoGentlrl-picTLR3
ligand Flagellin de S. Typhimurium (FLA-ST), ultra-purInvivoGentlrl-epstflaTLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 lecteur de microplaquesMolecular DevicesN/ALire le test colorimétrique
Lecteur de microplaques multimode Infinite M200 Pro avec injecteursTecanN/ALire luminiscience
Centrifugeuse Microfuge 22RBeckman CoulterN/AMicro-centrifugeuse à température contrôlée (jusqu’à 18 000 g)
Centrifugeuse Allegra X-15RBeckman CoulterN/ACentrifugeuse à usage général à température contrôlée (pour la culture cellulaire)
Plaque de dosage Costar, 96 puits blanc avec fond plat transparent, culture tissulaire traitéeCorning Costar3903Utilisé pour le dosage de la luminescence
rapporteures

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461(2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265(2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374(2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).

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