Article de méthode

Un système hybride de levure modifié pour les études d'interaction complexe-ADN de protéines hétérogènes

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DOI :

10.3791/56080

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24 juillet 2017

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Southern California, 2Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego

Dans cet article

Résumé

L'essai à un hybride de levure modifié décrit ici est une extension de l'essai à base d'hybride (Y1H) de levure classique pour étudier et valider l'interaction de l'ADN-complexe hétérologue-ADN dans un système hétérologue pour toute étude de la génomique fonctionnelle.

Résumé

Au cours des années, le dosage de la levure à un hybride s'est avéré être une technique importante pour l'identification et la validation des interactions physiques entre les protéines telles que les facteurs de transcription (TF) et leur cible d'ADN. La méthode présentée ici utilise le concept sous-jacent du Y1H mais est encore modifiée pour étudier et valider les complexes de protéines qui se lient à leur ADN cible. Par conséquent, on appelle l'essai à base d'un hybride (Y1.5H) de levure modifiée. Ce dosage est rentable et peut être effectué facilement dans un environnement de laboratoire régulier. Bien que l' utilisation d'un système hétérologue, la méthode décrite pourrait être un outil précieux pour tester et valider la liaison du complexe de protéines hétéromériques à leur (s) cible (s) d'ADN pour la génomique fonctionnelle dans tout système d'étude, en particulier la génomique végétale.

Introduction

En général, pour comprendre les interactions protéine-ADN, le dosage Y1H est le système préféré utilisé avec succès dans un laboratoire 1 . Le dosage basique de Y1H implique deux composants: a) une construction rapporteur avec un ADN d'intérêt cloné avec succès en amont d'un gène codant pour une protéine rapporteur; Et b) une construction d'expression qui générera une protéine de fusion entre le TF d'intérêt et un domaine d'activation de la transcription de la levure (AD). L'ADN d'intérêt est généralement appelé «appât» tandis que la protéine de fusion est connue sous le nom de «proie». Au cours des dernières années, des versions multiples du test Y1H ont été développées pour répondre à des besoins spécifiques avec leurs propres avantages 2 . Le test Y1H existant peut être mis en œuvre avec succès pour identifier et valider l'interaction d'une protéine à la fois avec son appât d'ADN, mais n'a pas la capacité d'identifier les interactions protéines-ADN hétérodimères ou multimériques.

"> La méthode décrite ici est une version modifiée du Y1H permettant aux chercheurs d'étudier simultanément plusieurs protéines se liant à leurs séquences d'ADN cible. L'objectif de ce dosage est d'exprimer la protéine d'intérêt avec un domaine d'activation (pDEST22: TF) et évaluer l'activation des régions d'ADN candidates fusionnées à un journaliste en présence et / ou en l'absence du partenaire protéinant interactif (pDEST32ΔDBD-TF) dans le système de levure. Ce dosage nous permettra de déterminer si l'interaction entre ces deux Les protéines sont nécessaires pour l'activation de la cible. Il s'agit d'un système compatible de clonage GATEWAY et donc possible d'utiliser dans un environnement de laboratoire régulier. Ce protocole est basé sur une transformation directe, ce qui facilite la co-transformation de différents TF dans un système de levure . Ainsi, il s'agit d'une stratégie avantageuse pour valider les complexes de protéines qui se lient à leurs cibles d'ADN possibles pour la validation moléculaire et fonctionnelle in vitro fOu tout système. Les techniques actuelles telles que les méthodes de purification par affinité Tandem (TAP) sont coûteuses et nécessitent beaucoup de main-d'œuvre, mais permettent de détecter des protéines hépatiques à grande échelle 3 , 4 , 5 . Cette levure modérée à un hybride peut être exécutée avec succès dans un calcul de laboratoire régulier sur une petite échelle ( figure 1 ) et est également rentable. Le test Y1.5H peut aider les chercheurs de la communauté à tester et à valider leur hypothèse afin de définir le rôle de la liaison du complexe de protéines multimériques à une cible d'ADN commune en utilisant un système hétérologue. Sur la base des résultats, l'hypothèse pourrait être validée in vivo dans le système d'étude préféré. Récemment, nous avons utilisé cette approche pour définir le rôle d'un TF et son mode d'action pour réguler la floraison dans Arabidopsis 6 .

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Protocole

1. Préparation des plasmides de construction et de rapporteurs

  1. La PCR amplifie les régions promoteurs / "fragments" (de préférence ~ 250 - 500 pb) de l'ADN cible à analyser pour un clonage supplémentaire dans le vecteur d'entrée en utilisant E. coli (TOP10).
  2. Lors de la confirmation de séquençage, sous-clone le clone positif dans un vecteur d'expression pGLacZi compatible 7 comme décrit précédemment 8 , 9 , 10 , 11 .
  3. Transformer la souche de levure pour l'intégration du promoteur (YM4271) par recombinaison homologue de pGLacZi pour générer une souche rapportrice de levure comme décrit précédemment 12 , 13 . Les étapes de transformation et de confirmation de la souche de levure avec la région d'ADN ainsi que la recette des médias ne sont pas décrites ici, car les étapes sont similaires au protocole Y1H classiqueAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Le plasmide de contrôle pEXP-AD502 peut être utilisé à des fins de normalisation tout en quantifiant l'activité de la β-galactosidase comme décrit précédemment 8 .
  4. Cloner le TF ou la protéine d'intérêt et ensuite cloner le partenaire de la protéine interagissant dans les vecteurs d'expression pDEST22 et pDEST32ΔDBD (pDEST32 moins ADN Binding Domain). Les fragments de promoteur de levure transformés et les clones de TF sont ensuite utilisés plus loin dans le protocole.

2. Modification du protocole Y1.5H

  1. Le jour 1 (après-midi), commencez par 5 mL de culture dans SD-Ura à partir d'une boîte de Petri ou de glycerol et incubés pendant une nuit dans un agitateur de 30 ° C.
    NOTE: Cette culture peut être démarrée à partir d'une assiette fraîchement rayée ou directement à partir d'un stock de glycérol à 25% ou à 30% de la levureClone avec le fragment d'ADN.
  2. Le jour 2 (après-midi), inoculer 10 mL de milieu YPDA avec 500 μL de culture pendant la nuit et incuber pendant une nuit dans un agitateur à 30 ° C.
  3. Jour 3 (tôt le matin et toute l'après-midi): Préparez les cellules compétentes (tôt le matin).
    1. Inoculer 100 ml de milieu YPDA avec les 2 ml de la culture d'une nuit et incuber dans un agitateur à 30 ° C. Faites pousser cette culture fraîche jusqu'à ce que la DO 600 atteigne 0,4-0,8 (3-5 h).
      REMARQUE: Vérifiez la DO 600 de la culture de nuit et assurez-vous que le point de départ OD 600 pour cette étape est de 0,1 à 0,2. L'utilisation d'une culture en sur ou sous-cultivée peut prolonger l'expérience.
    2. Centrifugez pendant 5 min à 1000 xg et 21 ° C. Jeter le surnageant.
    3. Reconstituer les pastilles dans 10 ml d'eau stérile en utilisant un tourbillon ou un pipettage vers le haut et vers le bas.
    4. Centrifugez pendant 5 min à 1000 xg et 21 ° C. Jeter le surnageant.
    5. ReconstitutionDes pastilles en 2 ml d'acide tris-éthylènediaminetétraacétique (TE) / acétate de lithium (LiAc) en utilisant un vortex ou un pipettage vers le haut et vers le bas.
      REMARQUE: voir la recette pour TE / LiAc dans le tableau 1 .
    6. Centrifugeuse de 5 min 1000 xg et 21 ° C. Jeter le surnageant.
    7. Remettre en suspension les pastilles dans 4 mL de TE / LiAc + 400 μL d'ADN de sperme au saumon (10 mg / mL) en pipetant vers le haut et vers le bas et passer à l'étape suivante.
  4. Co-transformation: Choc thermique des cellules (tard dans l'après-midi)
    1. Distribuer 20 μL de cellules par puits dans une plaque mélangeuse à 96 puits (U-bottom).
    2. Ajouter 150 ng (~ 1,5 μL) du plasmide pDEST22: TF, pDEST32ΔDBD: plasmide TF et pEXP-AD502 plus pDEST32ΔDBD: TF (contrôle de normalisation) aux puits.
      NOTE: Des résultats optimaux sont attendus avec ~ 150 ng chacun de pDEST22: TF et pDEST32ΔDBD: plasmide TF pour une co-transformation réussie. Peut varier avec les expressions de construction et de plasmide, doncDoivent être optimisés avec chaque expérience. Un autre contrôle pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD peut également être inclus à la discrétion de l'utilisateur.
    3. Ajouter 100 μL de TE / LiAc / polyéthylène glycol (PEG) par puits ( mélanger trois fois ).
      REMARQUE: voir la recette pour TE / LiAc / PEG dans le tableau 1 .
    4. Couvrir la plaque avec un joint respirant et incuber pendant 20 à 30 min (peut être plus long) à 30 ° C (pas d'agitation nécessaire).
    5. Choc thermique pendant 20 minutes ( précisément ) à 42 ° C.
  5. Placer les cellules.
    1. Centrifugez pendant 5 min à 1000 xg et 21 ° C. Retirer le surnageant à l'aide d'une pipette multicanaux. Ajouter 110 μL de TE et mélanger.
    2. Centrifugez pendant 5 min à 1000 xg et 21 ° C. Retirer 100 μL du surnageant en utilisant une pipette multicanaux. Re-suspendre la pastille avec le perforateur.
    3. Transférer les cellules sur des plaques d'agar SD-Trp-Leu . Incuber les assiettesÀ 30 ° C jusqu'à l'étape suivante.
  6. Jour 5 (après-midi): Transférer les cellules sur de nouvelles plaques en utilisant un réplicateur de perforateur / microplaque.
    1. Remplissez une plaque de mélange stérile à 96 puits (U-bottom) avec 50 μL de TE à l'aide d'une pipette multicanaux. Préchauffer le perforateur dans TE.
      REMARQUE: Le perforateur ou le réplicateur de microplaque doit être stérilisé avant cette étape et plus tard dans le protocole. La manière courante de stériliser le punch comme l'immerge dans l'éthanol (100%, pas la qualité de la biologie moléculaire) et ensuite le brûler à la flamme peut être appliqué. Attendez 1 min pour refroidir les épingles du poinçon.
      Attention: si vous effectuez la stérilisation sur le banc; Assurez-vous que le banc est pré-nettoyé avec de l'éthanol et sans aucun matériau combustible. Portez un équipement de protection individuelle approprié (EPI).
    2. Punch des colonies et ré-suspendre dans la plaque remplie de TE.
      NOTE: S'il y a une croissance régulière sur la plaque, les colonies peuvent être poinçonnées directementÀ la plaque remplie de TE ou, en variante, une colonie unique (dans le cas de colonies multiples) doit être choisie à l'aide d'un cure-dent stérilisé sur la plaque remplie de TE et ensuite le perforateur peut être utilisé pour l'étape suivante.
    3. Transférez-les sur de nouvelles plaques d'agar SD-Trp-Leu pour une couverture de surface optimale. Incuber les plaques à 30 ° C jusqu'à l'étape suivante.
  7. Jour 7 (après-midi): Démarrez la culture pour mesurer l'activité de la β-galactosidase.
    1. Remplissez une plaque de mélange stérile à 96 puits (U-bottom) avec 50 μL de support SD-Trp-Leu à l'aide d'une pipette multicanaux.
    2. Remplissez un bloc de puits stérile de 96 puits avec 180 μL de support SD-Trp-Leu à l'aide d'une pipette multicanaux.
    3. Préchauffer le perforateur dans les médias et transférer les colonies de la plaque aux 50 μL de médias.
    4. Transférer 20 μL de levure sur les 180 μL de supports SD-Trp-Leu et sceller le bloc avec un joint respirant. IncuberPendant 36 h à 30 ° C shaker.
  8. Jour 9 (matin): Démarrez la culture pour la mesure enzymatique.
    1. Transférer 100 μL de culture à 500 μL de milieu YPDA dans un bloc de puits à puits 96 stérilisés.
    2. Couvrir la plaque de puits profond stérilisé avec un joint respirant et incuber pendant 3 à 5 heures à 30 ° C avec agitation à 200 tr / min (jusqu'à OD 600 0,3-0,6).
    3. Ré-suspendre la culture et transférer 125 μL à l'aide d'une pipette multicanal sur une plaque de spectrophotomètre (mesure OD 600 ).
      REMARQUE: Attention: ne pas réparer la dernière goutte pour éviter les bulles, si la DO 600 est inférieure à 0,3 - 0,6, incuber les cellules restantes pendant 1 à 2 h de plus en fonction de la lecture. La culture de 125 μL utilisée à cette étape peut être rejetée ou transférée au bloc de puits profond original à la discrétion de l'utilisateur.
    4. Centrifuger les cellules restantes dans le bloc de puits profond pendant 10 min à 3000 xg et 21 ° C. Supprimer le surnageantT en inversant.
    5. Ajouter 200 μL de Z-buffer et vortex.
      REMARQUE: voir la recette pour le tampon Z dans le tableau 1 .
    6. Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg et 21 ° C. Retirer le surnageant en inversant.
    7. Ajouter 20 μL de tampon Z et vortex.
    8. Couvrir la plaque avec du film d'étanchéité qui peut résister à la congélation des cycles de décongélation. Effectuer 4 cycles de congélation / décongélation à l'aide d'azote liquide dans une hotte aspirante puis à 42 ° C dans un bain-marie (2 min chacun).
    9. Ajouter 200 μL de tampon Z / bêta-mercaptoéthanol (β-ME) / Ortho-nitrophényl-ß-galactoside (ONPG) (12 ml, 21 μL, 8,4 mg, respectivement, donneront une solution de 20 ml, préparez-vous toujours à l'état frais ).
      REMARQUE: L'ONPG prendra du temps pour se dissoudre correctement, afin de préparer la solution une heure avant d'atteindre cette étape. L'ONPG sert de substrat à la mesure de l'activité de la β-galactosidase.
    10. Incuber jusqu'à 17 - 24 h à 30 ° C (vérifier entre, si la couleur se développe avant prPassez à l'étape suivante).
  9. Jour 10 (matin): Arrêtez la réaction et mesurez.
    1. Ajouter 110 μL de Na 2 CO 3 1M pour arrêter la réaction et enregistrer le temps.
    2. Vortex et centrifuger pendant 10 min à 3000 xg et 21 ° C.
    3. Prendre 125 μl de surnageant en utilisant un multicanal et mesurer la DO 420 .
      REMARQUE: Attention, ne pas distribuer la dernière goutte pour éviter les bulles.
    4. Calculer l'activité β-gal: 1000 x OD 420 / (temps (min) x volume (mL) x OD 600 dans une feuille de calcul.

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Résultats

La procédure générale de mise en place des plaques pour la co-transformation des régions d'ADN dans les cellules de levure avec une protéine d'intérêt ( figure 2 ). La configuration de la plaque peut être modifiée en fonction de la nécessité de l'expérience et du nombre de régions / fragments d'ADN testés. Après le jour 5 du protocole, une plaque bien cultivée et positive devrait être visible comme dans la figure 3

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Discussion

La procédure standard Y1H existante est appropriée pour identifier une proie protéique unique se liant à son appât d'ADN. Avec diverses modifications techniques, le système existant a été exploité pour définir les réseaux réglementaires transcriptionnels. Cependant, les TF sont connus pour fonctionner comme une partie des complexes impliquant deux ou plusieurs TF ou protéines, avec seulement une partie du TF capable de se lier à l'ADN. Les protéines ou TF qui ne possèdent que les domaines de liaison aux protéine...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclament aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Nous remercions SS Wang, M. Amar et A. Galla pour la lecture critique du manuscrit. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de la santé selon les numéros de récompense RO1GM067837 et RO1GM056006 (à SAK). Le contenu relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
pDEST22 vectorInvitrogenPQ1000101Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBDInvitrogenPQ1000102Pro-Quest Two hybrid system kit ; ce vecor est modifié. Il s’agit de pDEST32 moins liaison à l’ADN Domaine
pENTR/D-TOPO Kit de clonageInvitrogenK240020
YM4271 SoucheClontechK1603-1MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502InvitrogenPQ1000101Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mixInvitrogen11791020
YPDA mediaClontech630410
SD-AgarClontech630412
SD minimal mediaClontech630411
Uracil DO SupplementClontech630416
Tryptophane DoSupplement Clontech630413
Tris BaseFisher ScientificBP152-1
EDTAFisher ScientificS311-500
LiAcSigma-AldrichL4158
Saplmon Sperme (10mg/ml)Invitrogen15632011
96 puits à fond rondPlaque Greiner bio-one650101 PEG3350
Sigma-Aldrich1546547
96-deep well blockUSA Scientific1896-2000
Feuille scellableUSA Scientific2923-0110
ArasealExcel ScientificB-100
2-mercaptoéthanolFisher Scientific034461-100
ONPGSigma-Aldrich73660
Na2CO3Sigma-Aldrich223484
Na2HPO4  ;Sigma-AldrichS3264
NaH2PO4  ;Sigma-AldrichS3139
KCLFisher ScientificBP366-500
MgSO4  ;Sigma-Aldrich83266
HCLFisher ScientificSA54-4
Bain secThermo Fischer
VoretxThermo Fischer
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5810R
Lecteur de plaquesDispositifSPECTRAMAX PLUS Spectrophotomètre
de microplaquesIncubateurThermo FisherModèle n° 5250- 37 degrés, 6250-30 degrés
Agitateur IncubateurNouveau-Brunswick
Bain-marieThermo FisherIsoTemp 205
Puncher
50 ml FalocnBD Falcon
BeakerNalgene
FlaconNalgene
Petriplates (150mm)Greiner bio-one
moléculaire

Références

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  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
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Mots-clés

Liaison des facteurs de transcriptiontransformation de la levuredosage de la b ta galactosidasemilieu SD avec omission d acides amin sprotocole de co transformationcycles de cong lation d cong lationg nomique fonctionnelle

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