Article de méthode

Un Guide pour la Production, la cristallisation et détermination de la Structure des IKK1 humaine/α

DOI :

10.3791/56091

⸱

2 novembre 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) est une protéine kinase de Ser/Thr qui participe à une myriade d’activités cellulaires principalement grâce à l’activation de facteurs de transcription NF-κB. Nous décrivons ici les principales étapes nécessaires à la production et la détermination de structure cristalline de cette protéine.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une classe de stimuli extracellulaires nécessite l’activation de IKK1/α pour induire la production d’une sous-unité de NF-κB, p52, grâce à la transformation de son précurseur p100. P52 fonctionne comme un homodimère ou un hétérodimère avec une autre sous-unité NF-κB, RelB. Ces dimères à son tour régulent l’expression de centaines de gènes impliqués dans l’inflammation, la survie des cellules et le cycle cellulaire. IKK1/α reste avant tout associé de l’IKK2/β et NEMO comme un complexe ternaire. Cependant, on observe aussi une petite piscine de celui-ci comme un complex(es) de faible poids moléculaire. On ne sait pas si l’activité de traitement p100 est déclenchée par l’activation de IKK1/α dans la plus grande ou la plus petite piscine complexe. L’activité constitutive de IKK1/α a été détectée dans plusieurs cancers et maladies inflammatoires. Pour comprendre le mécanisme d’activation de IKK1/α et permettre son utilisation comme cible de drogue, nous avons exprimé IKK1/α recombinant dans des systèmes hôte différent, comme e. coli, insecte et les cellules de mammifères. Nous avons réussi à exprimer IKK1/α soluble dans baculovirus infectés par des cellules d’insecte, obtenir des quantités de mg de protéine très pure, il cristallise en présence d’inhibiteurs et déterminer sa structure cristalline. Nous décrivons ici les étapes détaillées pour produire la protéine recombinante, sa cristallisation et sa détermination de structure cristalline aux rayons x.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Activités de transcriptionnelles de la famille NF-κB de facteurs de transcription dimère sont requises pour les fonctions cellulaires variées allant de l’inflammation et l’immunité à la survie et la mort. Ces activités sont strictement contrôlées dans les cellules et une perte du règlement conduit à diverses conditions pathologiques, y compris les maladies auto-immunes et du cancer1,2,3. En l’absence d’un stimulus, les activités de NF-κB restent inhibées par IκB (inhibiteur de - κB) protéines4. La phosphorylation des résidus Ser spécifiques sur les protéines IκB les marque pour l’ubiquitination et dégradation ultérieure proteasome ou traitement sélectif5. Deux kinases hautement homologues de Ser/Thr, IKK2/β et IKK1/α, agissent comme des régulateurs centrales des activités de NF-κB en effectuant ces phosphorylation événements6,7.

Interactions entre un ligand et un récepteur transduit un signal à travers une série de médiateurs conduisant à l’activation de facteurs de NF-κB. Le processus de signalisation NF-κB peuvent être classé en deux voies distinctes – canoniques et non canoniques (alternative)8. L’activité de l’IKK2/β régit principalement le NF-κB signalisation de la voie canonique qui est essentielle pour des réponses immunitaires innées et inflammatoires9. Une caractéristique particulière de cette voie est une activation rapide et de courte durée de l’IKK2/β10 au sein d’un complexe de IKK jusque-là biochimiquement indéterminé — présumé se compose de IKK1 et IKK2, mais aussi un volet réglementaire, NEMO (NF-κB Essential Modulator )11,12,13. Entre les deux sous-unités IKK catalytiques du complexe IKK, IKK2 est principalement responsable14 pour la phosphorylation des résidus spécifiques de prototypes IκBs (α, β - et γ-) lié au NF-κB et également une protéine IκB atypique, NF-κB1/p105, qui est un précurseur de la NF-κB p50 sous-unité5. La phosphorylation induit par ubiquitination et dégradation de proteasome de IκB (ou traitement des p105) conduit à la libération et l’activation d’un ensemble spécifique de NF-κB dimères15. Activité de NF-κB aberrante grâce à une fonction mal réglementée de l’IKK2 a été observée dans nombreux cancers, ainsi que dans des maladies auto-immunes2,3,16.

Contrairement à l’IKK2/β, activité de IKK1/α réglemente NF-κB, signalisation de la voie non canonique, qui est essentielle pour le développement et l’immunité. IKK1 phosphoryle des résidus spécifiques de NF-κB2/p100 sur son segment C-terminal IκBδ, qui mène à son traitement et la génération de p52. La formation de p52:RelB transcriptionnellement actif hétérodimère initie une réponse lente et soutenue aux signaux du développement7,17,18,19,20. Fait intéressant, la génération de la p52 de facteur NF-κB central de cette voie est gravement dépendante sur un autre facteur,21,NF-κB induisant Kinase (NIK)22, mais pas sur IKK2 ou NEMO. Dans les cellules au repos, le niveau de NIK reste faible en raison de la dégradation constante de le dépendant du protéasome23,24,25. Lors de la stimulation des cellules par des ligands « non canoniques » et dans certaines cellules malignes, NIK devient stabilisé afin de recruter et d’activer IKK1 / α. les activités de Kinase de NIK et IKK1 sont essentielles pour le traitement efficace des p100 dans p527. IKK1 et NIK phosphorylent trois sérines (Ser866, 870 et 872) de NF-κB2/p100 sur son segment C-terminal IκBδ menant à son traitement et la génération de p52. Aberrante activation de la voie non canoniques a été impliquée dans nombreuses tumeurs malignes dont le myélome multiple26,27,28.

Plusieurs inhibiteurs hautement efficaces et spécifiques pour IKK2/β sont connus, même si aucun jusqu'à présent ont avéré pour être un médicament efficace. En revanche, les inhibiteurs α-IKK1/spécifiques sont rares. Cela peut s’expliquer en partie par notre manque d’informations structurales et biochimiques sur IKK1/α, ce qui limite notre compréhension de la base mécaniste de l’activation de NF-κB par IKK1 dans les cellules et design rationnel des médicaments. Les structures des IKK2/β nous a fourni un aperçu du mécanisme d’activation de l’IKK2/β29; Cependant, ces structures ne pourraient pas révéler comment différents stimuli en amont déclencher l’activation du IKK1/α ou IKK2/β pour réguler des ensembles distincts de NF-κB activités 30,31. Pour comprendre les bases mécanistiques qui sous-tendent la fonction signalisation distincte de IKK1/α et d’établir une plate-forme pour la conception rationnelle de médicaments, nous nous sommes concentrés sur la détermination de la structure de IKK1/α.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. préparation du Virus Recombinant adapté à l’Expression de la grande échelle d’IKK1/α

  1. Préparation de virus P1 32
    1. Jour 1 : Les cellules Sf9 plaque (~ 6 X 105) (numéro du passage inférieur à 10) dans 2 mL du milieu cellulaire insectes Sf900 III dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 27 ° C. Passage des cellules lorsqu’ils atteignent une densité de 2 à 3 X 106 cellules / mL en suspension par dilution dans les supports neufs avec une densité d’environ 6 X 105.
    2. Jour 2 : Diluer 8 µL de réactif de Sf9-transfection dans 100 µL de milieu d’insecte Sf900 III ou de Grace sans antibiotique et sérum. Vortex brièvement.
    3. Diluer 1 µg de bacmid recombinant purifié kit (les détails sont fournis dans les « Résultats représentant »)32 dans un autre 100 µL de milieu même, dans une éprouvette.
    4. Combiner l’ADN dilué et réactif de transfection (volume total ~ 210-220 μl) et incuber à température ambiante pendant 15 à 30 min.
    5. Retirez le support du puits. Ajouter 1 mL de milieu frais sans antibiotique et le sérum.
    6. Ajouter le mélange de réactif dilué ADN-transfection goutte à goutte sur les cellules. Ajuster la taille des gouttes telle qu’il ne pas déloger les cellules adhérentes.
    7. Après environ 6 h, ajouter 1,5 mL de milieu frais sur le dessus ou enlever le milieu et ajouter 2,5 mL de milieu frais. Milieu frais tiède à 25-27 ° C avant l’addition.
    8. Incuber les cellules à 27 ° C. Vérifier les puits périodiquement toutes les ~ 12 h des signes d’infection virale. Effectuer toutes Sf9 entretien et expression à 27 ° C.
    9. Jour 5 : Retirer le support contenant des cellules 60 à 72 heures après l’infection. Centrifuger pendant 5 min à 500 x g et 4 ° C. Sauver le surnageant ; C’est le stock de P1-virus. Congeler de petites parties aliquotes à-80 ° C.
  2. Sélection des meilleures exprimant clone virus P1.
    1. Cellules de la plaque de la même façon, tel que décrit à l’étape 1.1.
    2. Prochain post jour ou ~ 6 h, électrodéposition, ajouter 20 µL et 50 µL de différents stocks de clone de virus P1 sur les cellules dans les différents puits.
    3. Déloger les cellules adhérentes en pipettant également, doux et de récolter la cellules infectées 60 à 72 heures après l’infection par centrifugation pendant 5 min à 500 x g et 4 ° C. Sauver le surnageant. C’est le stock de virus de P2. Magasin de petites parties aliquotes du stock à-80 ° C.
    4. Ajouter 100 µL de tampon de x Laemmli SDS 2 au culot cellulaire récoltés. Chauffer à > 95 ° C pendant 10 min. Centrifuger (typiquement > 10 000 x g) pendant 5 min.
    5. Exécutez 10-15 µL de chaque échantillon sur 8-10 % SDS-PAGE à 120-160 V jusqu'à ce que le front de colorant atteigne le bas du gel.
    6. Electro-transfert les protéines résolus par standard demi-sec transfert protocol (20 V, 30-45 min) sur une membrane de Nitrocellulose/PVDF.
    7. Éponger avec un anticorps anti-IKK1 (dilution ~ 1:2, 000, doit être optimisé) ou anticorps anti-PentaHis (dilution ~ 1:3, 000, doit être optimisé) pour l’expression.
    8. Choisissez le meilleur clone de virus P1 en comparant l’expression de IKK1 recombinante.
  3. Préparation de vastes stocks de virus de P3.
    1. Cellules de la plaque de même tel que décrit à l’étape 1.1 dans une plaque de 15 cm contenant 25-30 mL de milieu Sf900 III.
    2. ~ 6 h post électrodéposition, ajouter 150-300 µL du mieux exprimer leur stock de virus P1 dans les cellules.
    3. Après 72 h après l’infection, aspirer le milieu délicatement de la plaque dans un tube adapté (stérile) et centrifuger le tube à 500-1000 X g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le culot cellulaire (si on est formée) et enregistrez le surnageant. Il s’agit d’actions de virus P3.
  4. Déterminer le titre du virus optimale pour l’expression de la protéine à grande échelle
    1. Cellules de plaque dans 2 mL de milieu de Sf900 III, tel que décrit au point 1.1, dans une plaque 6 puits.
    2. Ajouter 20, 30, 40 et 50 µL de P3 stock de virus dans autre puits ~ 6 h post placage. Inclure un contrôle non infecté.
    3. Récolter les cellules de chaque infection de post bien 48-60 h.
    4. Ajouter 100 µL de tampon de Laemmli de X SDS 2. Chauffer à > 95 ° C pendant 10 min. Centrifuger (généralement à 14 000 x g) pendant 5 min.
    5. Résoudre les 10-15 µL de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE de 8 à 10 %.
    6. Résolu de protéine de transfert sur une membrane de Nitrocellulose/PVDF tel que mentionné dans 1.2.6.
    7. Éponger avec un anticorps anti-IKK1 (dilution ~ 1 : 2000, doit être optimisé) ou anticorps anti-PentaHis (dilution ~ 1 : 3000, doit être optimisé).
    8. Utiliser le virus avec les meilleurs exprimant le titre pour les expressions à grande échelle.

2. grande échelle Expression de 6 x-His tag humaine IKK129,33

  1. Réaliser l’expression à grande échelle dans une culture en suspension. Fractionner les cellules dans 1 L de milieu de Sf900 III dans un erlenmeyer de 2 L avec un bouchon ventilé. La densité cellulaire devrait être d’environ 5 x 105 cellules/mL.
  2. Cultiver ces cellules en suspension à ~ 100 tr/min à 27 ° C dans un agitateur pendant environ 2 jours jusqu'à ce qu’elle atteigne une densité de 1-2 x 106/ml. La densité cellulaire ne doit pas dépasser 2 x 106/ml.
  3. Ajoutez la quantité désirée de virus P3, tel qu’évalué à 1,4.
  4. Cultiver la culture infectée pendant 48-60 h à ~ 100 tr/min à 27 ° C dans un agitateur.
  5. Récolter les cellules par centrifugation à < x 1 500 g à 4 ° C.
  6. Sauver le culot cellulaire et jeter le milieu.
  7. Passez directement à la purification de la protéine. Flash gel le culot cellulaire en azote liquide et les conserver à-80 ° C pour une utilisation future.

3. purification de l’His-IKK133

  1. Jour 1, resuspendre le culot dans 40 mL de tampon de lyse (25 mM Tris pH 8,0, 0,2 % NP-40, 200 mM NaCl, imidazole de 10 mM, 10 % de glycérol, 5 mM β-mercaptoéthanol et inhibiteur de la protéase cocktail).
    Remarque : Le wet culot cellulaire masse n’a pas été déterminée. En général, 2 ~ L de la culture a été utilisé pour cette étape.
  2. Lyse des cellules par sonication à 60-70 %, heavy duty, 5-10 impulsions de durée de 30 s à un intervalle de > 1 min, maintien de la suspension cellulaire réfrigérés sur la glace.
    Remarque : Cette étape nécessite une optimisation avec chaque modèle de sonicateur. Ne laissez pas l’échantillon à chauffer au-dessus de 10 ° C.
  3. Clarifier le lysat par centrifugation à ≥ 28 000 x g pendant 45 min à 4 ° C.
  4. Equilibrer les 4 mL de résine Ni-NTA Agarose avec tampon de lyse et mélanger les clarifié lysat (surnageant) suivant le protocole du fabricant.
  5. Permettre à la protéine lier la résine en incubant pendant 2 h sur un mélangeur rotatif dans une pièce de 4 ° C.
  6. Laver soigneusement la résine avec le tampon de lyse contenant imidazole de 30 mM. Vérifier la concentration de protéines dans la fraction de laver périodiquement à l’aide d’analyse de Bradford. Lavage jusqu'à ce que cette concentration de protéine dans la fraction de lavage s’élève à 0,1 mg/mL. Généralement > 20 volume de lit du tampon de lavage est nécessaire pour atteindre ce point.
  7. Éluer les protéines His-tag IKK1/α sous l’écoulement par gravité, à l’aide de 20 mL de tampon d’élution (le tampon de lyse contenant imidazole 250 mM). Recueillir des fractions de 1 à 1,5 mL.
  8. Vérifier la pureté de la protéine éluée sur un gel SDS PAGE 8 ou 10 % de 5-10 μL d’échantillon de chargement de toutes les fractions mélangées au tampon de Laemmli.
  9. Piscine des fractions de pic (concentration ≥ 2mg/mL) et mesurer la concentration de protéines à l’aide de l’analyse de Bradford.
  10. Digérer avec TEV (01:30-50 (protéase : IKK1 TEV)) protéase du jour au lendemain (≥12 h) à 4 ° C.
    NOTE : Optimiser la quantité de protéase TEV requis pour compléter la digestion (≥ 95 %) de la balise X-His 6 a priori. Protéase TEV a été purifiée dans la maison.
  11. Le matin du jour 2, incuber la protéine avec 1 mM ATP en présence de 20 mM MgCl2, β-glycérophosphate de 20 mM, 10 mM NaF et 1 mM orthovanadate de sodium pendant 1 h à 27 ° C.
  12. Filtrer la solution de protéines à travers un filtre de 0,45 ou 0,22 μm.
  13. Charger 6 mL de l’échantillon sur une colonne d’exclusion stérique ~ 120 mL préparative connectée à un système automatisé de chromatographie en phase liquide. Équilibrer la colonne avec tampons A (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5 % glycérol), préalable à l’application de l’échantillon de protéine.
    Remarque : Une colonne plus petite peut s’appliquer selon le rendement de protéine après l’étape de purification d’affinité Ni-NTA. Réglages/calculer le volume de charge pour 5 % du volume de la colonne).
  14. Exécutez la chromatographie d’exclusion stérique à un débit de 1 mL/min et surveiller l’élution à 280 et 254 nm. Recueillir des fractions de 2 mL.
  15. Vérifier la pureté des fractions de pic (généralement autour de ~ 60-70 mL) sur un gel SDS-PAGE de 8 à 10 %.
  16. Mettre en commun les fractions pures (pureté ≥ 95 % avec une concentration de 0,5 mg/mL) et se concentrent dans un 10 kDa ou concentrateur centrifuge protéine coupure de 30 kDa poids moléculaire suivant les instructions du fabricant.
  17. Vérifier la concentration du concentré de protéines par la méthode de Bradford périodiquement et concentrer l’échantillon jusqu'à 8 à 12 mg/mL.
  18. Pipeter 25 μL aliquotes et flash congélation dans l’azote liquide. Stocker ces flash échantillons congelés dans le congélateur à-80 ° C.

4. l’écran État de cristallisation du IKK1

  1. Calculer la quantité totale (en volume) de la protéine nécessaire pour dépister les cristaux suivant les méthodes décrites ci-dessous.
  2. Essayez différents inhibiteurs (inhibiteurs de la kinase générique : AMPPNP et la Staurosporine ; IKK-specific inhibiteurs : MLN120B, le composé A et XII IKK-inhibiteur) pour effectuer le dépistage de cristallisation. Faire des solutions mères de ces composés suivant les instructions du fabricant. Veiller à ce que la concentration maximale du composé dans sa solution-mère ne dépasse pas 20 μM.
  3. Préparer la IKK:inhibitor complexe pour l’écran de cristallisation par mélange à 100 μM de IKK1 avec l’inhibiteur 200 μM et incuber à 18-20 ° C pendant 30-40 min. Centrifuger ce mélange à > 15 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Sauver le surnageant pour écran de cristallisation.
  4. Utilisez les écrans de cristallisation disponibles dans le commerce (voir la Table des matières).
  5. Distribuer 80-100 μL de chaque réactif de cristallisation (solutions de réservoir), à l’aide d’une pipette multicanaux ou un robot, dans le réservoir d’une plaque de 96 puits. La plaque est maintenant prête à mettre en place les gouttes. Veiller à ce que la plaque est ajusté à la cristallisation de 2 à 3 gouttes afin que les inhibiteurs de 2 à 3 peuvent être projetés en une seule plaque.
  6. À l’aide d’un robot de cristallisation, de distribuer et de mélanger 0,2 et 0,25 μL de IKK1:inhibitor complexe avec le même volume de solution de réservoir.
    Remarque : Préalable peut être effectuée manuellement à l’aide de plus gros volumes de goutte (0,5 à 1,0 μL de IKK1:inhibitor complexe avec le même volume de solution de réservoir). Cependant, utilisation d’un robot pourrait aider à sauver réactifs précieux.
  7. Sceller les plaques immédiatement après le réglage des gouttes avec films transparents pour éviter l’évaporation. Sceller correctement à l’aide d’applicateur approprié. Faire des plaques de réplique pour chaque ensemble d’inhibiteur. Incuber une plaque à 18 ° C et l’autre dans la chambre froide (température ~ 4 – 6 ° C). Assurez-vous que les incubateurs ne sont pas affectés par la vibration.
  8. Utilisez un stéréomicroscope avec un polariseur à vérifier pour l’apparition de cristaux dans chaque goutte chaque jour pour les sept premiers jours, puis à des intervalles plus longs. Systématiquement, noter et marquer ces observations.
    Remarque : Utilisez un stéréomicroscope avec un polariseur afin que les défauts de croissance dans les cristaux peuvent être évalués visuellement. Ici, cristaux est apparu dans un État où la solution du réservoir contenait 3 % p/v Dextran sulfate sodium sel Mr 5 000, 0,1 M pH BICINE 8.5, 15 % w/v polyéthylèneglycol 20 000. Cristaux de IKK1 se développe uniquement en présence de XII IKK-inhibiteur.

5. croissance des cristaux optimisation29,33

  1. Préparation des solutions mères.
    1. Préparer 30 % w/v du sulfate de Dextran de différents poids moléculaires (moy. MW 5 000, 8 000, 15 000, 40 000 Da) dans désionisée H2solution O. filtre à l’aide de 0,22 μm filtres.
    2. Préparer des stocks 1 M ou 0,5 M de différents tampons à des pH allant de 6,5 à 9. Filtrer les solutions utilisant des filtres 0,22 μm.
    3. Préparer 25 % ou 50 % (p/v) de poids moléculaire différent des solutions de PEG (moy. MW:1000, 1 500, 3 350, 4 000, 6 000, 8 000, 10 000, 12 000, 20 000 Da). Filtrer les solutions utilisant des filtres 0,22 μm.
    4. Effectuer un écran de la grille en faisant varier systématiquement pH, type de tampon, concentration et le type de cheville et de Sulfate de Dextran.
  2. Optimiser le dépistage à 18 ° C, tant dans la chambre froide (température ~ 4-6 ° C).
  3. Mélanger une quantité égale de la IKK1:Inhibitor complexe avec la solution puite et incuber leur solution bien dans un environnement fermé. Cette étape peut être effectuée manuellement ou à l’aide d’un robot de distribution.
    NOTE : Ici, les cristaux plus gros et bien définies (tel qu’évalué par une couleur uniforme sous le polariseur qui indique une croissance uniforme) ont été obtenus dans les conditions suivantes : 100 mM BisTris pH 7.0, de 2,8 à 3,5 % de Sulfate de Dextran (moyenne MW 15 kDa), 20 de PEG de 8,5 à 10 % kDa dans la chambre froide.

6. en croissance de cristaux en grand nombre

  1. Préparer les solutions suivantes et filtrez-les à travers 0,22 μm filtre.
    1. Préparer 0,5 M BisTris pH 7.0 et BisTris propane pH 7,0 et 7,5.
    2. Préparer 30 % (p/v), Sulfate de Dextran (moyenne MW ~ 15 kDa). Conserver à 4 ° C.
    3. Préparer 50 % PEG (moyenne MW ~ 12 kDa).
  2. Utilisation 24 bien accroché chute de plaques.
  3. Appliquez de la graisse d’étanchéité sur les anneaux en relief de chaque puits.
  4. Préparer la solution bien comme suit (concentration finale) : 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2,8 à 3,5 % Sulfate de Dextran ~ 15 kDa, PEG de 8,5 à 10 % ~ 12 kDa. Préparer 1 mL de solution bien dans des tubes de 1,5 mL.
    Remarque : Une variation mineure en état de cristallisation a été observée selon le lot de protéine, et/ou Sulfate de Dextran, donc un procès d’une gamme étroite est recommandé. Les BisTris et les BisTris tampons de propane de la même gamme de pH donnent des monocristaux.
  5. Garder les plaques graissés et les solutions bien dans la chambre froide pendant au moins 1 h.
  6. Préparer IKK1:Inhibitor complexe tel que décrit en 4.3. Transférer les solutions bien des tubes de 1,5 mL dans les puits individuels de la plaque 24 puits.
  7. Nettoyer siliconé (commerciales ou internes (siliconage/silanisation)) verre de lamelles à l’aide de chiffons non pelucheux et applique des jets d’air haute pression mis en évidence à l’aide de dépoussiérant aérosol disponibles dans le commerce.
  8. Placer 1 – 1,5 μL de solution bien sur une lamelle couvre-objet propre. Pipette à volume égal d’IKK1:inhibitor complexes, mélanger doucement en pipettant également monter et descendre 3 - 4 fois. Tourner le verre couvre-objet et placez sur la respectifs bien avec une pince et sceller le puits en appuyant sur la graisse.
  9. Après avoir configuré toutes les gouttes d’une plaque 24 puits, incuber la plaque dans la chambre froide dans l’obscurité. Vérifier occasionnellement les gouttes sous un microscope pour l’apparition et la croissance des cristaux.
    NOTE : Il n’a pas été testé si en incubant des plaques de cristal sous la lumière allait changer le résultat. Il est essentiel, cependant, que les boîtes sont incubées dans un milieu où la vibration minimum/no.

7. Cryo Protection des cristaux

  1. Préparation des solutions de cryo.
    1. Préparer la Cryo A (~ 2 % Sulfate de Dextran, ~ 10 % PEG 12000, 60 mM BisTris au propane (du même pH que la solution prévue bien), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 2,5 % glycérol).
    2. Préparer Cryo B (Sulfate de Dextran, environ 10 % de ~0.3% PEG 12000, 60 mM BisTris au propane (du même pH que la solution prévue bien), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 20 ou 25 % glycérol ou 20 ou 25 % d’éthylène Glycol).
      Remarque : Testez différents cryo-protecteurs en plus de glycérol et de l’éthylène Glycol (p. ex., PEG 200, PEG 400, PEG MME 550, PEG 1000).
  2. Doucement, retirer la lamelle de verre contenant le cristal et placez-la sur une surface solide avec la goutte de cristal vers le haut. Doucement ajouter 10 μL de la solution Cryo A sur le dessus de la goutte et mélanger doucement en pipettant également, afin que le cristal n’est pas touché.
    Remarque : Cela nettoie la surface du cristal des débris et aider à équilibrer le cristal avec le tampon de cryo initial. Éviter les contraintes mécaniques et thermiques pour le cristal. Effectuez toutes les étapes subséquentes au microscope pour éviter d’endommager le cristal.
  3. Retirer doucement peu de liquide de cristal et garder sur 5-8 μL de la solution. Éviter la déshydratation du cristal. Prenez grand soin d’éviter les contraintes mécaniques et la déshydratation du cristal dans toutes les étapes subséquentes.
  4. Doucement, ajouter 2,5 – 4 μL de la solution Cryo B sur la goutte, mélanger très doucement en pipettant également. Couvrir avec une petite boîte de Pétri pour éviter la circulation d’air sur le cristal. Attendre 5 min. toujours faire attention que le cristal ne subit pas de variations rapides de pression osmotique ou déshydratation.
  5. Répétez l’étape 7.4 quatre fois se pour acclimater lentement le cristal dans la solution cryo.
  6. Garder 10 – 20 μL de la solution cryo à ce stade (c.-à-d., laissez le cristal pour être baigné dans environ 20 à 25 % solution contenant cryo-protecteur). Faire tremper pendant différentes périodes de temps (5 min à 1 h) à la cryo-solution finale.
  7. Geler les cristaux multiples à différents moments.
  8. Prélever soigneusement un monocristal dans le menu déroulant en cryo-boucle appropriée montée sur une base appropriée et le plongeon-gel liquide N2. Effectuez cette étape en douceur et rapidement pour éviter la formation de glace sur le cristal.
    Remarque : Choisir le cristal à l’aide d’un diamètre de boucle légèrement supérieur à l’axe le plus long du cristal afin qu’il peut être monté dans la robotique goniomètre utilisé dans Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory.
  9. Stocker le cristal contenant cryo-boucles en rondelles immergés dans le liquide N2. Stocker ces rondelles en liquide N2 Dewar fiole jusqu'à ce qu’elles sont prêtes à être expédiées pour la diffraction des rayons x au synchrotron. Procéder à la collecte de données de diffraction des rayons x et de traitement (Articles 8 et 9).
    NOTE : Les données de Diffraction des cristaux de IKK1 de sources de rayons x maison n’étaient pas de résolution suffisamment élevée pour les essais de détermination de structure, bien qu’il indique la qualité des cristaux à être projeté au synchrotron. Toutes les données de diffraction ont été prélevées à différents faisceaux (principalement 19ID) Source de photons Advance, Argonne National Laboratory, USA.

8. collecte de données de rayons x

  1. Recueillir des données de diffraction des rayons x à la source de rayonnement ID19 de la source de rayonnement synchrotron APS, à l’aide de données distantes collection logiciel34.
    NOTE : Plus de 100 cristaux ont été testés pour leurs propriétés de diffraction. Les cristaux diffractée systématiquement à une résolution de 7-11 Å, rarement cristaux qui diffractés à au-delà de 5 Å ont été observé et seul un gros cristal diffracté au-delà de 4,5 Å. Étant donné que les cristaux cariées rapidement lors de la collecte de données, datasets à différentes parties du même cristal ont été recueillis. Cela a été possible car les cristaux sont grandes (plus de 400 µm), et le diamètre du faisceau utilisé est de 100 µm.

9. traitement de données de rayons x

  1. Fusionner tous les ensembles de données recueillies sur les différentes parties de la même cristal34.
    NOTE : sept ensembles de données ont été fusionnées le meilleur cristal et les données qui en résulte a été achevée à 93 %. L’ensemble j’ai / σ était ~ 6,8) et Rmerge était de 89 % dans le bac à plus haut résolution (5,4-4.5 Å).
  2. Processus des groupes de données avec HKL200034 pour obtenir le groupe d’espace, dimensions de maille, teneur en solvant et composition plausible de l’unité asymétrique.

10. structure Solution

  1. Préparation de modèles de recherche
    1. Basé sur des modèles structuraux disponibles de hIKK2 (pdb id 4E3C et 4KIK35), générer une série de dimères avec différentes orientations de la KD N-terminal (qui restitue une ouverture de 30 et 62 Å, entre P578 de deux KD dans le dimère). Aucun de ces modèles s’est arraché une solution de recherche remplacement moléculaire après de nombreux essais.
    2. Générer une carte de IKK1 de particule cryo-EM données33.
    3. Créer un modèle de IKK1 humaine de la structure de résolution plus élevée de l’IKK2 (pdb id 4KIK).
    4. Ancrer les domaines individuels du modèle IKK1 humain dans la carte cryo de densité EM de IKK1 humaine à l’aide de FOULQUE36. Ceci pivote l’orientation KD environ 24 degrés et modifié le N-terminal ouvrant à 58 ~ Å.
    5. Appliquer l’orientation KD du modèle cryo-EM monté (monomère) à tous les dimères générées en 10.1.1.
  2. Remplacement moléculaire
    1. Utilisez les dimères de 10.1.1 et 10.1.5 comme modèles de recherche dans les programmes PHASER37, MOLREP38 et CNS39,40.
      NOTE : Ici, utilisez l’une des dimères de 10.1.5 (ouverture de 52 Å) comme un modèle de recherche, six dimères (deux hexamères) sont trouvaient dans l’unité asymétrique en utilisant MOLREP. Les 52 Å ouvrant dans le modèle de recherche est similaire à l’ouverture de Å 49-50 des dimères (tous les six dimères) dans la structure raffinée.

11. structure raffinement

  1. Procédure de raffinement de structure
    1. Fixer l’orientation et la position de ce modèle initial par le raffinement du corps rigide en CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Affiner la structure en utilisant minimisation et recuit simulé avec une fonction cible de maximum de vraisemblance et une correction de plat en vrac-solvant à l’aide de la CNS système39,40.
    3. Construire le modèle basé sur 2F +O+ FC et Fo-Fc des cartes en utilisant Xtalview41.
      Remarque : Appliquez raffinement DEN assistée42 et NCS retenir pendant les raffinements pour une meilleure précision du modèle. En effet, raffinement DEN amélioré de façon spectaculaire des géométries et R-facteurs de la structure et le facteur R était de 22,2 % et gratuit facteur R était de 27,8 % pour le modèle final. L’amélioration spectaculaire de le R libre doit être à cause du modèle de grande précision de IKK1 domaines qui ont été générés à partir du modèle de l’IKK2 (4KIK).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clonage et expression de différentes constructions de IKK1/α
Pleine longueur qu'ikk1/α humain a été cloné dans le baculovirus expression vector pFastBacHTa au sein de ses sites de restriction EcoRI et NotI pour obtenir un N-terminale hexa-Histidine tag IKK1. La balise pourrait être supprimée par digestion protéasique TEV. Étant donné que pleine longueur IKK1/α contient des zones flexibles sur les deux extrémités, et régions souples rendent habituellement une protéine d...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solution de production, la cristallisation et la structure de deux protéines IKK reliées
Nous partons pour déterminer la structure cristalline du IKK1/α la notion qu’il serait un exercice relativement simple étant donné notre expérience avec la production de protéines IKK2/β, cristallisation et détermination de la structure. Cependant, nous avons été très surpris que ces deux protéines apparentées se sont comportés très différemment au sujet de la facilité de la cristallisation. Malgré les efforts de ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le personnel de la 19ID de ces faisceaux, 24ID et 13ID à Advanced Photon Source, Lemont (Illinois), pour le soutien au cours de la collecte de données sur différents cristaux. Nous sommes reconnaissants à Dmitry Lyumkis, Salk Institute pour nous aller chercher la carte de cryo-EM basse résolution des stades précoces de EM carte/modèle de construction, qui a été utilisé pour construire le modèle initial de la recherche du remplacement moléculaire IKK1. La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de subventions de NIH AI064326, CA141722 et GM071862 à GG. SP est actuellement Wellcome Trust DBT Inde intermédiaire boursier.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin n’est plus fabriqué, remplacé par Cellfectin II
Sf900 III Milieu cellulaire d’insecteThermo Fisher Scientific12658-027
Cellules SF9Thermo Fisher Scientific12659017
anticorps anti-IKK1Novus BiologicalsNB100-56704Précédemment vendu par Imgenex
anticorps anti-PentaHisQiagen34460
Membrane PVDFMilliporeIPVH00010Nitrocellulose peut également être utilisé
Agarose Ni-NTAQiagen30210
Bradford réactif de dosageBioRad500001
Superdex 200 colonneGE Healthcare28989335
Concentrateur AmiconMilliporeUFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Composé ABayer
Calbiochem IKK-inhibiteur XIICalbiochem401491
StaurosporineSIGMAS4400
MLN120BMilleniumCadeau
AMPPNPSIGMAA2647
Sulfate de dextranSIGMA51227, 42867, 31404,
Sulfate de dextranAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172Certains d’entre eux sont nouveaux Cat # sur le catalogue SIGMA. Ce que nous avions était à l’origine de Fluka qui avait différents Cat #.
cristallisation
Crystal Screen I et II (Crystal Screen HT)Hampton ResearchHR2-130
Index HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion et PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 et PEGRx 2 (PEGRx HT)Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 et SaltRx 2 (SaltRx HT)Hampton ResearchHR2-136
Montures de cristalHampton ResearchHR8-188, 190, 192, 194
SynchrotronLa source de photons avancée (APS) au département américain de l’énergie' s Lignede faisceau 19d’Argonne ID La source de photons avancée (APS) au Département de l’énergie des États-Unis Le laboratoire national d’Argonne fournit des faisceaux de rayons X générés par des anneaux de stockage d’énergie ultra-brillants et à haute énergie pour la recherche dans presque toutes les disciplines scientifiques.
Écrans de du Laboratoire national

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

IKK1 AlphaProtein ExpressionInsect CellsBaculovirus SystemProtein PurificationSize Exclusion ChromatographyProtein CrystallizationX ray CrystallographyMolecular ReplacementStructure Determination

Articles connexes