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Article de méthode

Génération d’un modèle de maladie pulmonaire Obstructive chronique chez les souris par exposition à l’Ozone répétées

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DOI :

10.3791/56095

⸱

25 août 2017

 ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Dans cet article

Résumé

Cette étude décrit la génération réussie d’un nouveau modèle animal de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) par une exposition répétée souris à des concentrations élevées d’ozone.

Résumé

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est caractérisée par persistants d’air limitation et poumon parenchyme destruction. Il a une incidence très élevée dans le vieillissement de la population. Les thérapies conventionnelles actuelles pour la MPOC se concentrer principalement sur symptôme médicaments modificateurs ; ainsi, le développement de nouvelles thérapies est absolument nécessaire. Qualifié de modèles animaux de la BPCO pourraient contribuer à caractériser les mécanismes sous-jacents et peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues nouvelles. Les modèles actuels de MPOC, tels que les lipopolysaccharides (LPS) ou l’élastase pancréatique porcin (EPI)-emphysème induite par modèle, générer des BPCO-comme des lésions dans les poumons et des bronches, mais ne ressemblent pas autrement à la pathogenèse de la BPCO humaine. Une fumée de cigarette (CS)-modèle induit reste l’un des plus populaires car elle ne simule pas seulement BPCO-comme des lésions dans le système respiratoire, mais il est également basé sur l’une des principales matières dangereuses qui provoque la BPCO chez les humains. Cependant, les aspects de longues et fastidieuses du modèle induite par le CS limitent considérablement son application dans le dépistage des drogues nouvelles. Dans cette étude, nous avons généré avec succès un nouveau modèle de BPCO en exposant des souris à des concentrations élevées d’ozone. Ce modèle a démontré ce qui suit : 1) ont diminué le volume expiratoire maximal 25, 50 ou 75/forcé la capacité vitale (FEV25/FVC, FEV50/FVC et FEV75/FVC), indiquant la détérioration de la fonction pulmonaire ; 2) les alvéoles pulmonaires élargie, avec destruction parenchymateuse pulmonaire ; 3) réduit le temps de la fatigue et la distance ; et 4) augmente l’inflammation. Pris ensemble, ces résultats démontrent que le modèle d’exposition (OE) de l’ozone est un modèle animal fiable qui est semblable à l’homme car la surexposition de l’ozone est l’un des facteurs étiologiques de la BPCO. En outre, il n’a fallu 6-8 semaines, issus de nos travaux antérieurs, pour créer un modèle de OE, considérant qu’il faut de 3 à 12 mois pour induire le modèle de la fumée de cigarette, ce qui indique que le modèle de OE peut être un bon choix pour la recherche de la MPOC.

Introduction

Il a été estimé que la MPOC, y compris l’emphysème et la bronchite chronique, pourrait être la troisième cause de décès dans le monde en 2020,1,2. L’incidence potentielle de la BPCO chez une population de plus de 40 ans est estimé à 12,7 % chez les mâles et 8,3 % chez les femmes au sein de la prochaine 40 ans3. Aucuns médicaments ne sont actuellement disponibles pour inverser la détérioration progressive de patients BPCO4. Modèles animaux fiables de la BPCO non seulement exigent l’imitation du processus pathologique de la maladie mais également besoin d’une période de génération court. Les modèles actuels de la MPOC, y compris les LPS ou un modèle induite par le PPE, peuvent induire des symptômes emphysème5,6. Une seule administration ou un défi de la semaine de LPS ou PPE de souris ou rats génère une neutrophilie marquée dans le lavage bronchoalvéolaire (LBA), augmentation des médiateurs pro-inflammatoires (p. ex., TNF-α et IL-1β) dans la BALF ou le sérum, produit du poumon parenchymateuses élargie à la destruction des espaces d’air et limites d’air5,6,7,8,9,10. Cependant, LPS ou EPI ne sont pas des causes de la MPOC humaine et ainsi ne pas imiter le processus pathologique11. Un modèle induite par le CS produit une limitation persistante d’air, de la destruction parenchymateuse pulmonaire et réduit la capacité fonctionnelle d’exercice. Cependant, un protocole de CS traditionnel nécessite au moins 3 mois pour générer une MPOC modèle12,13,14,15. Ainsi, il est important de générer un nouveau modèle animal plus efficace qui répond à deux exigences.

Récemment, en plus de l’usage de la cigarette, la pollution atmosphérique et l’exposition professionnelle sont devenues des causes plus courantes de MPOC16,17,18. L’ozone, comme l’un des principaux polluants (bien que pas la composante majeure de la pollution atmosphérique), peuvent directement réagir avec les voies respiratoires et endommager le tissu pulmonaire des enfants et des jeunes adultes19,20,21 ,22,23,24,25. L’ozone, mais aussi d’autres stimulateurs dont LPS, PPE et CS, sont impliqués dans un grave des voies biochimiques du stress oxydatif pulmonaire et dommages à l’ADN et sont liés à l’initiation et la promotion des BPCO26,27. Un autre facteur est que les symptômes de certains patients BPCO se détériorent après avoir été exposés à l’ozone, ce qui indique que l’ozone peut perturber la fonction de poumon18,28,29. Par conséquent, nous avons généré un nouveau modèle de BPCO par exposition répétée des souris à des concentrations élevées d’ozone pendant 7 semaines ; Il en est résulté les défauts d’air et des lésions parenchymateuses pulmonaires semblables à ceux des précédentes enquêtes30,31,32. Nous avons étendu le protocole OE à des souris femelles dans cette étude et reproduit avec succès l’emphysème observé chez les souris mâles dans nos précédentes études30,31,32. Parce que la mortalité de la BPCO a diminué chez les hommes, mais augmenté chez les femmes dans de nombreux pays33, un modèle de BPCO chez les femmes est nécessaire pour étudier les mécanismes et d’élaborer des méthodes thérapeutiques pour les patientes de MPOC. L’applicabilité du modèle OE à tous les genres étaye davantage son utilisation comme un modèle de MPOC.

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Protocole

Remarque : modèle de l’OE a été générée et utilisée en recherche a déjà été indiqué 30 , 31 , 32. Toutes les expériences animales ont été approuvées par l’utilisation Comité (IACUC) de l’Université Jiaotong de Shanghai et d’institutionnels animalier.

1. souris

Centre de
  1. maison exempts de micro-organismes pathogènes, âgés de 7 à 9 semaines femelles souris BALB/c dans des cages ventilées individuelles chez un animal sous contrôlée température (20 ° C) et humidité (40-60 %). Fournir un 12 h de lumière et sombre cycle de 12 h dans l’établissement. Fournir de la nourriture et l’eau ad libitum.

2. L’ozone ou l’exposition à l’Air

  1. générer l’ozone avec un générateur électrique dans une étanchéité boîte acrylique (par exemple Perspex). Souffler l’air hors de la boîte à l’aide d’un petit ventilateur à travers un tuyau d’évacuation aérienne qui est connecté à l’intérieur et à l’extérieur de la boîte. Surveiller la concentration d’ozone dans la boîte à l’aide d’une sonde d’ozone. Attendez jusqu'à ce que la concentration d’ozone dans la zone atteint 2,5 parties par million (ppm).
    Remarque : La sonde d’ozone peut activer automatiquement le générateur d’ozone ou désactiver et peut maintenir le niveau d’ozone dans la boîte à 2,5 ppm.
  2. Placer les souris dans la boîte quand le niveau d’ozone a atteint 2,5 ppm. Garder les souris dans la zone pendant 3 h chaque fois des pour exposer à l’ozone.
    Remarque : La boîte peut maintenir un niveau d’ozone de 2,5 ppm durant les 3 h en commutant automatiquement le générateur d’ozone on ou off et soufflant le CO 2 qui est produite par les souris hors de la boîte.
  3. Donner deux exposition à l’ozone (chaque exposition Durée 3 h) par semaine (une fois tous les 3 jours) pendant 7 semaines, exposer les souris de contrôle à l’air en même temps et pour la même période.

3. Micro-tomodensitométrie

  1. à la fin de la semaine 7, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de pelltobarbitalum natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) adapter la dose selon les situations individuelles de voir que la souris ne fonctionne pas répondre à un orteil pincée. moniteur et garder la souris à une fréquence de respiration régulière ; et assurez-vous qu’aucun mouvements volontaires n’existent pendant les procédures.
  2. Placer les souris anesthésiés dans la chambre d’une micro-la tomodensitométrie (µCT).
  3. Calibrer le µCT utilisant le protocole standard et le fabricant ' instructions de s. Fixer le tube à rayons x à 50 kV et le courant à 450 µA.
    NOTE : Les rayons x et le détecteur tournent autour des souris.
  4. Exécuter l’analyse µCT en acquérant 515 projections avec une taille de pixels effectifs de 0,092 mm, un temps d’exposition de 300 ms pour une tranche et une épaisseur de tranche de 0,093 mm.
  5. Reconstituer le poumon avec les images acquises à l’aide d’un logiciel. Ajuster la luminosité de l’image en niveaux de gris en définissant le minimum et le maximum de l’échelle des gris-750 et -550 unités Hounsfield, respectivement.
    Remarque : Le logiciel calculera automatiquement le volume de parenchyme pulmonaire et la zone faible atténuation (LAA) 34 , 35.
  6. Calculer le pourcentage de LAA (LAA %) en divisant le volume LAA par le volume pulmonaire totale.

4. tapis roulant Test

  1. donner les souris une adaptation d’essai à une vitesse de 10 m/min pendant 10 min sur une machine de tapis roulant en cours d’exécution. Note : l’électricité est toujours éteint lorsque la procédure est menée.
  2. administrer un test de fatigue à la souris.
    1. Réchauffer les souris à une vitesse de 10 m/min pendant 5 min.
    2. Augmenter la vitesse à 15 m/min pendant 10 min.
    3. Augmenter l’intensité de l’exercice : en augmentant la vitesse de 5 m/min, à partir de 20 m/min, toutes les 30 minutes jusqu'à ce que la souris ne peut pas continuer à courir 36.
  3. Enregistrer le total distance courante et durée respectivement comme distance de fatigue et temps de fatigue,.

5. mesures de la fonction pulmonaire

  1. anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de pelltobarbitalum natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) adapter la dose selon les situations individuelles de voir que la souris ne ne répond pas à une pincée d’orteil et attendre que les souris ont maintenu la respiration spontanée. moniteur et garder la souris à une fréquence de respiration régulière ; et assurez-vous qu’aucun mouvements volontaires n’existent pendant les procédures.
  2. Soigneusement tracheostomize les souris et placez-les dans une pléthysmographie de corps qui est reliée à un ventilateur commandé par ordinateur.
    Remarque : La Ventilation est contrôlée via une soupape située dans la partie proximale de la sonde endotrachéale. Le programme d’installation fournit différentes manœuvres semi-automatique, y compris la manœuvre du volume pression quasi statique et la manœuvre des débit rapide.
  3. Imposer une moyenne fréquence de 150 respirations/min pour la souris anesthésiée par l’intermédiaire de ventilation sous pression contrôlée jusqu'à une respiration régulière de respiration et d’expiration complète à chaque cycle respiratoire est obtenue.
  4. Effectuer la manœuvre de pression-volume quasi statique avec le dispositif à l’aide de pressions négatives générées dans le pléthysmographe.
  5. Effectuer la manœuvre de volume de débit rapide dans les boucles de pression-volume quasi statique pour enregistrer la FVC et le VEMS. Gonfler les poumons à + 30 cm H 2 O et immédiatement après le connecter à une pression très négative pour appliquer l’expiration jusqu'à ce que le volume résiduel est à-30 cm H 2 O. Record le FEV dans les 25 premiers, 50 et 75 ms d’exhalation (FEV 25 FEV 50 et 75 de FEV, respectivement). Rejeter les manœuvres sous-optimale. Pour chaque test avec chaque souris, effectuer un minimum de trois manœuvres acceptables pour obtenir un moyen fiable pour tous les paramètres numériques.

6. BALF Collection

  1. après anesthésie terminal avec pelltobarbitalum natricum ((1 %, 1,8-2,4 ml/100 g) adapter la dose selon les situations individuelles de voir que la souris ne pas répondre à une pincée d’orteil et perdre haleine), lavage du souris avec 2 mL de PBS via un tube endotrachéal de 1 mm de diamètre et puis récupérer la BALF 10.
  2. Réunir les aliquotes de lavage récupérée et centrifuger à 4 ° C et 250 x g pendant 10 min.
  3. Recueillir le surnageant pour une utilisation immédiate et stocker le reste à l’azote liquide ou de-80 ° C.
  4. Compter le nombre total de cellules utilisant un hémocytomètre.
  5. Resuspendre le culot dans du PBS et essorage (1 400 x g, 6 min) puis de 250 µL de cellules resuspendues sur diapositives à l’aide d’une centrifugeuse spinner de diapositive.
  6. Wright appliquer la coloration de cellules sur les diapositives selon le fabricant ' protocole de s.
  7. Compter 200 cellules par souris ; identifier les cellules comme les macrophages ou neutrophiles, selon morphologie standard, sous un grossissement de X 400 ; et compter leurs numéros.

7. Les prélèvements sanguins cardiaques

  1. recueillir le sang par ponction cardiaque, chargez-le dans des tubes de 1,5 mL et gardez-le sur glace pendant 30 min.
  2. Centrifuger les échantillons de sang pendant 5 min à 2 000 x g et 4 ° C.
  3. Transférer le surnageant (sérum) dans un nouveau tube et conserver à-80 ° C ou liquide azote.
  4. Préparer le sérum pour IL-1β, IL-10 et les tests de détection de TNF-α en utilisant les kits ELISA respectifs.

8. L’analyse morphométrique poumon

  1. disséquer les poumons et les trachées des souris.
    1. Positionner chaque souris euthanasiés sur une planche chirurgicale immédiatement après le sacrifice.
    2. Disséquer loin le peaucier et les muscles trachées antérieurs pour visualiser et accéder aux anneaux trachées.
    3. Ouverte vers le haut le thoracique cavité. Disséquer les poumons et la trachée, mais ne séparent pas le cœur des poumons.
  2. Connecter la sonde endotrachéale à une seringue contenant 4 % de paraformaldéhyde à travers un tube de polyéthylène PE90.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique. Porter des gants et des lunettes de sécurité et d’utiliser la solution à l’intérieur d’une hotte aspirante.
  3. Gonfler les poumons complètement à l’aide de paraformaldéhyde à 4 % (10 gouttes, ~ 200 µL) par le biais de la sonde endotrachéale. Enlever le coeur à l’issue de l’inflation.
  4. Maintenir le poumon dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 4 h.
  5. Intégrer le poumon à la paraffine. Obtenir des sections de 5 µm par bloc de paraffine sectionnant avec un microtome rotatif. Au cours de la découpe, exposer la surface maximale du tissu pulmonaire dans la zone de l’arbre bronchique.
  6. Pour analyse morphométrique, effectuer l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration sur les sections.
  7. Les sections d’image avec un microscope droit lumineux-zone (porte-objectif, 20 X, temps d’exposition, ms 1,667).
  8. Ont deux enquêteurs aveuglés au protocole de traitement indépendamment de compter les coupes histologiques. Utiliser le point d’intersection linéaire moyenne (L, m) en tant que paramètre pour mesurer la distance de la paroi septale inter alvéolaire. Déterminer la L m en suivant les étapes suivantes :
    1. Ouvrez les images des sections dans Photoshop et d’en tirer une réticule-grille sur l’image avec des lignes longues de cinq 550 µm.
    2. Compter le nombre d’alvéoles à travers la ligne de grille.
    3. Calculer le L m en divisant la longueur de la ligne de la grille par le nombre d’alvéoles. Pour la quantification, image cinq sections par souris. Acquérir des dix images de chaque section (une image par champ) et évaluer de façon aléatoire. Pendant la sélection du champ, éviter les champs des voies respiratoires et les navires en déplaçant un champ avant ou dans une autre direction.
      Remarque : Les données sont présentées comme la moyenne ± S.E.M. Un non-apparié t-test a été effectué pour comparaison entre souris exposés à l’air et des souris exposées à l’ozone. Trois animaux de chaque groupe ont servi à calculer la différence significative. Une valeur p de < 0,05 était considérée comme significative.

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Résultats

Exemples d’images 3D µCT de chaque groupe sont affichés dans la Figure 1a. Les souris exposées à l’ozone avaient considérablement accroître le volume pulmonaire totale (Figure 1a et b) et LAA % (Figure 1c) que la souris de contrôle exposés à l’air. Le volume pulmonaire et LAA % est demeurée élevées après six semaines de l’ozone exposition

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Discussion

Dans cette étude, nous présentons une méthode fiable permettant de générer un nouveau modèle de MPOC. Par rapport aux autres modèles (c.-à-d., LPS ou modèles d’EPI), ce modèle de OE récapitule le processus pathologique des patients BPCO. Parce que la fumée de cigarette est la principale matière dangereuse qui cause des BPCO chez les patients humains40, le modèle CS reste le plus populaire MPOC modèle41,42. Toutefois, le modèle CS ...

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Déclarations de divulgation

Z.W.S. et W.W. sont employés actuels et les détenteurs de stock-options du groupe biomédecine cellulaire (NASDAQ : CBMG). Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier M. Boyin Qin (Shanghai Public Health Clinical Center) pour l’assistance technique à l’évaluation de µCT dans le présent protocole.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris BALB/cSlac Laboratory Animal, Shanghai, ChineN/ADes souris femelles BALB/c âgées de 7 à 9 semaines ont été utilisées dans cette étude.
Cages individuelles ventiléesSuhang, Shanghai, ChineNuméro de modèle : MU64S7Les cages ont été utilisées pour loger les souris dans l’animalerie.
Boîte d’étanchéité en plexiglasSuhang, Shanghai, ChineN/ALa boîte a été utilisée pour contenir le générateur d’ozone. Les souris ont été exposées à l’ozone à l’intérieur de la boîte.
Groupe électrogènePonceuse ozoniseur, Uetze-Eltze, AllemagneModèle 500  ;L’appareil a été utilisé pour générer de l’ozone.
Sonde d’ozoneATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UKOzone 300L’appareil a été utilisé pour la surveillance et le contrôle de la production d’ozone.
Pelltobarbitalum natricumSigma, St. Louis, MO, USAP3761Les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de pelltobarbitalum natricum.
Micro-tomodensitométrieGE Healthcare, London, ON, CanadaRS0800639-0075Cet appareil a été utilisé pour l’acquisition d’images du poumon.
Micro-view 2.01 Logiciel ABAGE Healthcare, London, ON, CanadaMicro-view 2.01  ;Cet appareil a été utilisé pour reconstruire le poumon et analyser le volume, LAA du poumon.
Tapis roulantDuanshi, Hangzhou, Zhejiang, ChineDSPT-208Cette machine a été utilisée pour le test de fatigue.
Pléthysmographe corporeleSpira&trade ; Système de manœuvres forcées, EMMS, Édimbourg, Royaume-UniSystème de manœuvres forcéesCet appareil a été utilisé pour tester la fonction pulmonaire de spirométrie.
VentilateureSpira&trade ; Système de manœuvres forcées, EMMS, Édimbourg, Royaume-UniSystème de manœuvres forcéesCet appareil a été utilisé pour tester la fonction pulmonaire de spirométrie.
Centrifugeuse à lames DenvilleScientific, Holliston, MA, USAC1183  ;Il a été utilisé pour faire tourner des cellules BALF sur des lames.
Wright StainingHanhong, Shanghai, ChineRE04000054  ; Il était utilisé pour colorer les macrophages, les neutrophiles dans le BALF en suspension.
HémocytomètreHausser Scientific, Horsham, Pennsylvanie, États-Unis4000Il était utilisé pour compter les cellules.
IL-1 et bêta ;Abcam, Cambridge, MA, USAab100704Ils ont été utilisés pour tester les facteurs respectifs dans le sérum.
IL-10Abcam, Cambridge, MA, USAab46103Ils ont été utilisés pour tester les facteurs respectifs dans le sérum.
TNF-&alpha ;Abcam, Cambridge, MA, USAab100747Ils ont été utilisés pour tester les facteurs respectifs dans le sérum.
Paraformaldéhyde  ;Sigma, St. Louis, MO, USAP6148Le poumon a été gonflé par 4 % de paraformaldéhyde.
ParaffineHualing, Shanghai, Chine56#Il était utilisé pour enfoncer le poumon.
Microtome rotatifLeica, Wetzlar,  ; Hesse, AllemagneRM2255Il a été utilisé pour sectionner le poumon.
La hgaématoxyline et l’éosine (H& E) solution de colorationSolarbio, Pékin, ChineG1120H& Une coloration E a été réalisée pour l’analyse morphométrique.
Microscope droit à champ clairOlympus, Center Valley, PA, USACX41Il a été utilisé pour imager le H& E lames de coloration.
Adobe Photoshop 12Adobe, San Jose, CA, USAAdobe Photoshop 12Il était utilisé pour compter le nombre d’alvéoles sur le H& E images tachées.
GraphPad prism 5Graphpad Software Inc., San Diego, CAGraphPad prism 5Il a été utilisé pour l’analyse de données et la production de chiffres.

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