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Article de méthode

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

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DOI :

10.3791/56105

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19 septembre 2017

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1Department of Microsystems Engineering, University of Freiburg, 2Freiburg Materials Research Center, University of Freiburg, 3Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Une plateforme de biocapteurs microfluidiques a été conçue et fabriqué en utilisant la technologie de résine photosensible feuil sec peu coûteux pour la quantification rapide et sensible des analytes différents. Ce système à usage unique permet la lecture électrochimique du-puce-immobilisé les dosages-enzymatique au moyen de la technique d’arrêt de débit.

Résumé

Ces dernières années, diagnostic biomarqueur est devenu un outil indispensable pour le diagnostic de la maladie humaine, en particulier pour les diagnostics de point-of-care. Une plateforme facile à utiliser et peu coûteux de capteur est hautement souhaitée pour mesurer différents types d’analytes (p. ex., biomarqueurs, hormones et des médicaments) quantitativement et spécifiquement. Pour cette raison, la technologie de résine photosensible feuil sec - permettant pas cher, fabrication facile et haut débit - servait à fabriquer les biocapteurs microfluidiques présentées ici. Selon l’essai biologique utilisé par la suite, la plate-forme polyvalente est capable de détecter différents types de biomolécules. Pour la fabrication de l’appareil, les électrodes de platine sont articule autour d’une feuille souple polyimide (PI) dans l’étape du processus de salle blanche seulement. La feuille PI sert de substrat pour les électrodes, qui sont isolés avec un photosensible à base d’époxy. Le canal microfluidique est ensuite généré par le développement et le laminage de feuilles de résine photosensible (DFR) feuil sec sur la plaquette de la PI. En utilisant une barrière hydrophobe s’arrêter dans le canal, le canal est divisé en deux domaines spécifiques : une section d’immobilisation pour le dosage immunoenzymatique et une cellule de mesure électrochimique pour la lecture du signal ampérométrique.

L’immobilisation de l’essai biologique sur puce est interprétée par l’adsorption de la biomolécules à la surface du canal. L’enzyme oxydase de glucose est utilisé comme un capteur pour la génération de signaux électrochimiques. En présence du substrat, glucose, peroxyde d’hydrogène est produit, qui est détecté à l’électrode de travail platine. La technique de coule-stop est appliquée pour obtenir l’amplification du signal avec une détection rapide. Biomolécules différent peut être mesurée quantitativement au moyen du système microfluidique introduite, ce qui donne une indication des différents types de maladies, ou, en ce qui concerne les drogues thérapeutiques surveillance, facilitant une thérapie personnalisée.

Introduction

Pendant les deux dernières décennies, les applications diagnostiques sont devenus élémentaires pour des études approfondies sur le développement de la santé publique mondiale. Traditionnellement, les outils de diagnostic de laboratoire sont utilisées pour la détection des maladies. Même s’ils jouent encore un rôle essentiel dans le diagnostic des maladies, point-of-care test (FAOP) effectué à proximité du patient ou par le patient lui-même est devenu de plus en plus monnaie courante ces dernières années. Surtout dans de tels cas nécessitant un traitement immédiat, tels que l’infarctus aigu du myocarde ou de suivi de diabète, la confirmation rapide d’une constatation clinique est indispensable. Par conséquent, il y a un besoin croissant de dispositifs FAOP qui peut être utilisé par des non-spécialistes et qui sont en même temps capables d’effectuer des tests de diagnostic précis en vitro dans un court laps de temps1,2,3,4 .

Des améliorations remarquables ont été accomplis dans le domaine de la FAOP. Cependant, il existe encore de nombreux défis à surmonter5,6,7,8. Pour une plate-forme de FAOP qui sera lancé avec succès sur le marché et d’être compétitifs avec les diagnostics de laboratoire, l’appareil doit strictement remplir les exigences suivantes : (i) fournir des résultats précis et quantitatives qui sont en accord avec le laboratoire constatations ; (ii) avoir court échantillon-à-résultat fois, ce qui permet le traitement immédiat du patient ; (iii) disposent d’une manipulation simple et facile, même lorsque utilisé par des personnes inexpérimentées et nécessitent l’intervention de l’utilisateur réduite ; et (iv) comprennent un détecteur de faible coût conçu pour les applications à usage unique. En outre, exempte d’équipement diagnostic est favorables, principalement dans des environnements pauvres en ressources3,4,6.

En raison de ces exigences sévères, que deux systèmes FAOP basés sur détection électrochimique (p. ex., bandelettes de test glycémique) et sur les immuno-essais écoulement latéral (p. ex., les tests de grossesse maison) ont été lancés avec succès sur le marché ainsi jusqu'à maintenant. Cependant, les deux systèmes souffrent de désavantages comme mauvaises performances (c'est-à-dire sang surveillance du glucose a résultats inexacts et essais d’écoulement latéral fournissent seulement des résultats de mesure qualitative de (positifs ou négatifs))4, 6. Ces inconvénients des systèmes conventionnels de FAOP ont conduit à une demande croissante sur l’exploration de nouvelles technologies qui offrent une détection rapide, peu coûteux et quantitative au point de soins4,5.

Pour relever ces défis de dispositifs FAOP, technologie DFR a été récemment employée pour la fabrication de biocapteurs jetables et low-cost9,10,11,12, 13 , 14. par rapport aux matériaux lithographiques mou et liquides, comme le PDMS ou SU-8, DRJ présente de nombreux avantages : (i) sont disponibles dans une variété de compositions et d’épaisseurs (de quelques microns à quelques millimètres) ; (ii) ont une surface très rugueuse, qui facilite l’adhérence aux différents matériaux ; (iii) uniformité d’épaisseur excellente fonctionnalité ; (iv) offrir à peu de frais, facile et haut débit de fabrication pour la production de masse ; (v) sont facile à couper avec divers outils de faible coût, comme une simple paire de ciseaux ; et (vi) permettent la création de structures tridimensionnelles, comme canaux microfluidiques, par empilement des couches multiples de DFR uns sur les autres.

En revanche, DRJ ont en général une résolution relativement faible par rapport aux résines photosensibles liquides, qui sont principalement causés par l’épaisseur du film et de la distance accrue entre le masque et la DRF en raison de la pellicule protectrice, ce qui permet en outre de lumière diffusion. Pourtant, pour la fabrication de biocapteurs microfluidiques intégrée, DRJ est parfaitement adapté à la production de masse de faible coût.

Donc, nous présentons dans ce travail la fabrication et l’application d’un biocapteur axée sur la DFR électrochimique microfluidiques. Le protocole détaillé décrit chaque étape de production de la plateforme de biocapteurs, l’immobilisation sur puce d’un essai de modèle basé sur l’ADN et sa lecture électrochimique en utilisant la technique d’arrêt de débit. Cette plateforme universelle permet la détection de nombreuses sortes de biomolécules, utilisant des technologies de test différents (p. ex., génomique, cellomics et la protéomique) ou formats de test (p. ex., concurrentiel, sandwich ou direct). Basé sur une telle plate-forme DFR, notre groupe précédemment démontré avec succès la quantification rapide et sensible des analytes différents, y compris les antibiotiques13,15,16 (tétracycline, pristinamycine et ß-lactamines), troponine j’ai17et18de la substance P.

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Protocole

1. fabrication de la microfluidique biocapteur utilisant la technologie DFR

  1. gaufrettes de préparation de la PI. Substrat de couper un PI
    1. in 6 - autour de gaufrettes. Mettre la plaquette de la PI dans un four à 120 ° C pendant environ 1 h pour une cuisson au four déshydratation.
  2. Pour le processus de décollage, première étape de photolithographie.
    1. Programme l’essorage-coater à une heure de spinning de 30 s à 3 000 tr/min, avec une accélération de 2 000 tr/min/s. Place la plaquette PI sur le spin-coater et résoudre ce problème, appliquer le vide. Verser 2 mL d’une résistance, permettant le processus de décollage et démarrer le programme d’essorage-coater. Enlever la plaquette de l’essorage-coater et soft-cuire la gaufrette PI sur une plaque chauffante pendant 2 min à 100 ° C.
    2. Ajuster le masque souhaité pour les électrodes sur la plaquette de PI à le œil nu le patterning et l’exposer à la lumière de 2 UV 400 mJ/cm (365 nm). Place la plaquette dans un bol rempli d’un développeur de filtrage de résister dans un agitateur orbital et laissez-le agiter légèrement pendant 1 min.
    3. Après avoir retiré l’excédent resist, utiliser une douche pour rincer la gaufrette de PI à l’eau désionisée (DI-eau) sur un banc humide et ensuite à l’aide d’air comprimé sec.
  3. Dépôt de platine pour la formation des électrodes.
    1. Utilise un procédé de déposition de vapeur physique standard de dépôt 200 nm de platine la gaufrette 19.
    2. Dans un bol, mettre la plaquette. Ajouter le solvant correspondant dans le bol et enlevez la resist déjaugeage et en agitant légèrement la plaquette dans un agitateur orbital jusqu'à ce que tous les excès platine est supprimé. Rincez et séchez la gaufrette PI tel que décrit à l’étape 1.2.3.
  4. Deuxième étape de photolithographie : formant la couche d’isolation.
      ,
    1. Mettre la plaquette de la PI dans un four préchauffé à 120 ° C pendant 5 min déshydrater les it.
    2. Programme de la première étape d’un spin-coater à 5 s de la filature de temps à 500 tr/min. Programme de la deuxième étape de 30 s à 4 000 tr/min, avec une accélération de 700 tr/min/s.
    3. Placer la plaquette PI sur le spin-coater et résoudre ce problème, appliquer le vide. Verser 4 mL d’une photorésine de base d’époxy approprié avant de démarrer le programme d’essorage-coater.
    4. Soft-cuire la gaufrette couchée pendant 3 min à 95 ° C sur une plaque chauffante.
    5. Ajuster le masque pour la couche d’isolation sur la plaquette en utilisant les repères respectifs et une lentille de l’oculaire. Exposer la gaufrette à 100 mJ/cm 2 UV light (365 nm).
    6. Pour une cuisson au four après l’exposition, placer les tranches sur une plaque chauffante préchauffée pendant 2 minutes à 95 ° C.
    7. Placer les tranches dans un bol et développer la résistance avec un développeur approprié (par exemple, 1-méthoxy-2-propyle-acetat pendant 2 min, dans le cas de SU-8) dans un agitateur orbital.
    8. Rincer la gaufrette PI d’abord avec de l’isopropanol et puis rincer et sécher comme indiqué au point 1.2.3.
    9. Dur-cuire la résine photosensible dans une étuve pendant 3 h à 150 ° C.
  5. Assisté par plasma nettoyage des électrodes.
    1. Pour enlever les résidus de résine photosensible, utiliser le plasma d’oxygène avec une unité de plasma standard. Démarrez le programme de nettoyage, à l’aide de puissance de 200 W basse fréquence avec un temps total de 3 min. 100 % O 2 flux et un taux de 250 sccm
    2. Placer la plaquette de la PI dans la chambre de plasma, fixer la plaquette sur la plaque de mise à la terre à l’aide de couvercles en verre et démarrer le processus de plasma.
  6. Argent et dépôts de chlorure d’argent : création de l’électrode de référence sur puce.
    1. Passivation le contact platine tampons de la plaquette avec un ruban adhésif de sensibles aux UV. Couper la feuille à 5 mm de largeur et 11 cm de long rayures et joignez-les à la plaquette, en protégeant les parties ne pas à déposer d’argent.
    2. Pour le dépôt d’argent, mettre un bain à ultrasons (35 kHz) dans une hotte et insérez un conteneur de solution d’électrolyte argent (100 g/L Ag, pH 12,5) dans la baignoire. Mettre le bain à ultrasons à température ambiante et la puissance de 10 %.
      ATTENTION : Solutions électrolytiques argent sont très toxiques et doivent être manipulées avec précaution. Les fumées ne devraient jamais être inhalées.
    3. Connecter le contact en vrac les électrodes de référence à une source de courant constant. Connecter l’électrode du compteur, un fil d’argent qui est immergé dans la solution d’électrolyte argent, à la source de courant à l’aide de câbles de raccordement standards.
    4. Définir la source de courant DC et une densité de courant de -4,5 mA/cm 2, soit un taux de dépôt argent d’environ 0,3 µm/min. commencer le bain à ultrasons et laisser la source actuelle tourner pendant 10 min. Rincer la gaufrette à DI-eau
    5. Pour la chloration de l’électrode de référence, insérez un navire de solution de chlorure de potassium (KCl) 0,1 M dans le bain à ultrasons. Raccorder le contact en vrac de la plaquette et une électrode de platine qui est immergée dans la solution de KCl avec la source de courant constant.
    6. Définir la source de courant DC et une densité de courant de + 0,6 mA/cm 2, soit un taux de dépôt d’environ 0,075 µm/min. commencer le bain à ultrasons et laissez la source de courant pour 7,5 min.
    7. Rincer et sécher le PI de wafer, tel que décrit à l’étape 1.2.3.
    8. Enlever le ruban de sensibles aux UV après un UV (365 nm) exposition de 300 mJ/cm 2 et de rincer et de sécher la gaufrette de PI, à nouveau, comme décrit dans étape 1.2.3.
  7. Troisième étape photolithographie : DRJ aide à créer des canaux microfluidiques.
    1. Coupe les couches DFR nécessaires à une taille similaire à celle de la plaquette (20 x 20 cm 2). Fixer le masque désiré sur l’Exposeur et aligner la couche DFR sur le masque en utilisant l’oeil nu. Illuminer la resist avec 250 mJ/cm 2 UV light (365 nm).
    2. Retirer le film protecteur de la résine photosensible et développer la résistance pendant environ 2 minutes (selon les structures) dans une solution de carbonate de sodium (Na 2 CO 3) de 1 % à l’aide d’un bain à ultrasons standard (35 kHz) préchauffé à 42 ° C et une puissance sonore de 100 %. Pour arrêter la réaction immédiatement, secouez la résister pendant 1 min dans un bain d’HCl 1 % dans un agitateur orbital. Rincer et sécher chaque couche DFR, tel que décrit à l’étape 1.2.3.
      Remarque : Au total, quatre couches DFR doivent être traités comme indiqué dans l’étape 1.7 : couche un canal, un couvre couche et deux couches de dos (empêchant le biocapteur de plier à la fin).
  8. Des couches de stratification de la DRF sur le substrat PI.
    1. Placer la plaquette PI sur une feuille de frais généraux de transparence et fixez-le à l’aide d’un ruban adhésif standard. Ajuster la couche de canal DFR sur la plaquette PI sous un microscope, en utilisant les structures respectives alignement.
    2. Pour la stratification, utiliser une plastifieuse standard de pain chaud et préchauffer le rouleau supérieur à 100 ° C et le rouleau inférieur à 60 ° C. régler la pression à 3 bars, avec une vitesse de 0,3 m/min. Place la gaufrette avec la couche DFR fixe au milieu de la plastifieuse et Démarrez-le ; la DRF est poussée par la plastifieuse. Répétez l’étape après avoir tourné la gaufrette de 180°.
    3. Pour éviter la flexion du biocapteur, stratifié les deux couches de dos développés sur la plaquette suivant étapes 1.8.1-1.8.2.
  9. Employant une barrière hydrophobe s’arrêter et la puce d’étanchéité.
    1. Enlever la couche protectrice de la face avant du chenal DFR laycateur en plaçant un ruban adhésif standard à une extrémité de la DRF et en tirant vers le haut. Utiliser un distributeur de main avec tubes de 0,004 composant logiciel enfichable pour distribuer des petites gouttelettes de polytétrafluoroéthylène dissous dans les puits de la couche d’isolation. Pour sceller la puce microfluidique, laminé la pellicule protectrice DFR sur la couche de canal, tel que décrit à l’étape 1.8.
  10. Dur la cuisson les biocapteurs microfluidiques.
    1. Supprimer tous les protecteur feuilles sur la couverture et le dos de couches DFR. Couper les biocapteurs en lanières à l’aide d’une paire de ciseaux d’ordinaire. Guérir les puces dans un four à 160 ° C pendant 3 h

2. MODE OPERATOIRE immobilisation sur puce

  1. Adsorption d’avidine dans le domaine de l’immobilisation de la chaîne.
    1. Préparer une solution d’avidine 100 µg/mL en 10 mM tampon phosphate salin (PBS) à un pH de 7.4.
    2. Distribuer 2 µL de la solution de l’avidine à la prise du biocapteur.
      Remarque : Le canal est rempli par des forces capillaires jusqu'à ce que le liquide atteigne la barrière hydrophobe arrêt.
    3. Pour s’assurer que la fluidique continue d’arrêt à la barrière pendant le temps entier d’incubation, administrer 2 µL de DI-l’eau à la sortie de la puce. Incuber la puce à 25 ° C pendant 1 h dans un récipient fermé.
    4. Supprimer excès réactifs grâce à l’entrée de la puce en appliquant un vide. Laver le canal avec 50 µL de tampon de lavage (PBS avec 0,05 % Tween 20), distribué à la sortie alors que le vide est appliqué. Sécher le canal pendant 30 s, tandis que le vide est appliqué.
  2. Bloquer la surface du canal pour inhiber la liaison non-spécifique.
    1. Préparer une solution d’albumine sérique bovine (BSA) de 1 % en 10 mM PBS à un pH de 7.4.
    2. Pipette 2 µL de la solution de BSA 1 % sur l’entrée et 2 µL de DI-l’eau à la sortie du canal. Incuber la puce à 25 ° C pendant 1 h dans un récipient fermé. Retirez l’excès réactifs et sécher le canal comme indiqué au point 2.1.4.
  3. Oligos d’incubation de l’ADN marqué avec biotine et 6-Fam.
    1. Préparer à différentes concentrations (0,001-5 µM) de la solution d’ADN en 10 mM PBS à un pH de 7.4.
    2. Distribuer 2 µL d’une concentration de la solution d’ADN sur l’entrée et 2 µL de DI-l’eau à la sortie. Incuber la puce à 25 ° C pendant 15 minutes dans un récipient fermé.
    3. Répéter l’étape 2.3.2 pour les autres concentrations d’ADN à l’aide de jetons supplémentaires biocapteur.
    4. Enlever les excès réactifs et sécher le canal comme indiqué au point 2.1.4.
  4. Anticorps marqués immobilisation de GOx de 6-FAM.
    1. Formuler une concentration de 5 µg/mL d’anticorps 6-FAM en 10 mM PBS à un pH de 7.4.
    2. Introduire 2 µL de la solution d’anticorps à l’entrée et 2 µL de DI-l’eau à la sortie du canal. Incuber les anticorps marqués à 25 ° C pendant 15 minutes dans un récipient fermé. Retirez l’excès réactifs, comme indiqué au point 2.1.4.

3. Ampérométrique Signal Detection Using la Technique coule-Stop

  1. préparation de la solution de substrat pour la détection électrochimique.
    1. Formuler une solution de glucose de 40 mM dans du PBS de 0,1 M à un pH de 7,4 à ultra-pures.
    2. Pour le traitement préliminaire, préparer une solution de PBS de 0,1 M à pH 7,4 dans ultra-pures.
  2. Traitement préliminaire des électrodes travail.
    1. Utiliser le support de la puce sur mesure afin de permettre la mise en place facile de la puce et un lien fluidique et électrique.
    2. Connecter électriquement le biocapteur au potentiostat. Assurer le contact fluidique du canal microfluidique un pousse-seringue et le réservoir de réactif à l’aide de l’adaptateur sur mesure et les tubes. Démarre l’ordinateur portable qui est connecté à la potentiostat et démarrer le contrôleur de pompe seringue, contrôle de la circulation fluidique grâce à la puce.
    3. Démarrer manuellement, le pousse-seringue avec du PBS de 0,1 M à un débit de 20 µL/min. À l’électrode de travail par rapport à l’électrode de référence sur puce, appliquer une tension alternative de 0,8 et de -0,05 V pour 5 s chaque 30 cycles. Suite à cela, s’oxydent l’électrode de travail en appliquant une tension de 0,8 V pendant 60 s.
  3. Lecture de test en utilisant la technique d’arrêt de débit.
    1. Pour commencer la lecture du signal test, attendez jusqu'à ce que le signal mesuré actuel se stabilise. Arrêter la pompe de seringue et basculer le réactif de PBS de 0,1 M à la solution de glucose de 40 mM et démarrez le logiciel sur le contrôleur de pompe seringue ; Il s’arrête automatiquement l’écoulement pour 1, 2 ou 5 min et va redémarrer puis le débit à nouveau. Observez la pointe de courant qui en résulte.
      Remarque : Pour l’analyse des données, la pointe de courant ou de la charge du PIC sont envisageables, comme décrit dans le modèle d’un affichage de signal électrochimique ( Figure 2).

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Résultats

Conception et Fabrication de la plate-forme de biocapteurs microfluidiques :

La fabrication des puces microfluidiques biocapteur est réalisée sur le wafer-niveau par des techniques photolithographiques standard utilisant des couches multiples de DFR. Cette stratégie de fabrication repose sur la stratification de couches développés de DRJ sur un substrat de PI platine à motifs, formant des canaux microfluidiques. Un bref résumé décr...

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Discussion

Le protocole présenté ici pour la fabrication d’un Biocapteur électrochimique microfluidique permet le développement d’une plate-forme abordable, compact et facile à utiliser pour la détection des biomolécules. Selon le test utilisé par la suite sur le biocapteur, plusieurs différents biomarqueurs peuvent être détectées. Cela rend la plate-forme très polyvalent et fournit un accès étendu à divers domaines d’application, des tests de diagnostic standards (p. ex., déterminer la présence de certaines maladies chez ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier la Fondation allemande de la recherche (DFG) pour financer partiellement cette œuvre sous Grant Numbers UR 70/10-01 et UR 70/12-01.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Material
PyraluxDuPontAP8525RUtilisé comme substrat polyimide
MA-N 1420Micro Resist TechnologyMA-N1420Lift-off respit pour définir la déposition de platine
Ma-D 533sMicro Resist TechnologyMaD533SDéveloppeur pour MA-N1420
Platinum--Matériau de l’électrode et du tampon de contact
Ma-R 404sMicro Resist TechnologyMaR404SRemover pour MA-N1420
SU-8 3005MicroChem Corp.SU-8-3005Photorésine pour définir la surface de l’électrode et comme isolant
Acétate de 1-méthoxy-2-propanolSigma-Aldrich108-65-6Révélateur pour SU-8 3005
2-PropanolVWR8.18766.2500Retrait du révélateur SU-8
1020RUltron Systems Inc.1020RRuban adhésif sensible aux UV pour la protection des tampons de contact
Arguna SDegussa1935Pour le dépôt d’argent sur l’électrode de référence
KClMethrom62308.020Pour la chloration de l’électrode de référence en argent
PyraluxDuPontPC1025Film sec photosensible
Sodium carbonatFluka71352Révélateur pour Pyralux PC1025
Chlorure d’hydrogèneSigma-Aldrich30720Pour couronner le développement du DFR
Téflon AF 1600DuPontAF1600Pour l’utilisation de la barrière d’arrêt
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
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PA104Mega Electronics-Bubbleetch tank
FED 53Binder9010-0018Four
SPIN150APT-Spin
coater Prä ; zithermHarry Gestigkeit GmbHPZ 28-2Plaque chauffante
HellasBungard Elektronik40000Unité d’exposition
Tetra30-LF-PCDiener-Unitéplasma
Univex 500Leybold-Unité dedépôt physique en phase vapeur
Shaker S4ELMI-Vibrateurorbital
Sonorex Super 10 PBandelin783Bain sonique
6221 DC et ACKeithley-Sourcede courant
HRL 350Ozatec-Unitéde lamination
Stylo sous videEFD-Stylovide
à

Références

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Réimpressions et autorisations

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