Ce protocole décrit par voie intratrachéale inoculations de rats Fischer 344 avec Francisella tularensis. Cette procédure imite pulmonaire exposition des humains à cet agent de bioterrorisme potentiel et peut être utilisé pour tester les vaccins et l’efficacité thérapeutique contre la tularémie pulmonaire.
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Article de méthode
L’Inoculation par voie intratrachéale de Fischer 344 Rats avec Francisella tularensis
Dans cet article
Résumé
Résumé
Infection pulmonaire par la bactérie Francisella tularensis peut conduire à la maladie grave et potentiellement mortelle, tularémie, chez l’homme. En raison de l’absence d’un vaccin de tularémie approuvés pour les humains, la recherche est axée sur le développement de vaccins utilisant des modèles animaux appropriés. Les rats Fischer 344 a émergé comme un modèle qui reflète la susceptibilité à l’infection de F. tularensis et est donc un modèle attrayant pour le développement de vaccins tularémie. L’inoculation par voie intratrachéale du rat Fischer 344 avec F. tularensis imite l’exposition pulmonaire chez l’homme. La mise en œuvre réussie dans la trachée de rat est critique pour l’administration pulmonaire. Un laryngoscope avec éclairage sert à intuber correctement les trachées de rats anesthésiés ; le placement correct dans la trachée est déterminé par un dispositif simple pour détecter la respiration. Suite à l’intubation, la culture de F. tularensis est livrée dans une dose mesurée par seringue. Cette technique standardise administration pulmonaire de F. tularensis dans la trachée de rat pour évaluer l’efficacité du vaccin.
Introduction
F. tularensis (Ft) provoque la maladie humaine, tularémie. Lors de la bactérie est acquis par la voie pulmonaire, cela conduit à la tularémie pulmonaire, qui a le taux élevé de morbidité et de mortalité1. F. tularensis est considéré comme un agent de bioterrorisme à cause du danger associé à des formes en aérosol et il n’existe actuellement aucun vaccin approuvé pour usage humain aux États-Unis Un effort intensif est en cours pour développer des vaccins et des mesures thérapeutiques contre la tularémie pulmonaire, pour protéger la population humaine contre l’utilisation illicite de ce bioterrorisme bactérienne.
Une grande partie de la recherche de tularémie a mis l’accent sur le modèle de la souris, en raison de l’extrême sensibilité de la souris à l’infection de F. tularensis et la prévalence des réactifs. Cependant, les souris ont prouvé un modèle difficile pour le développement de vaccins, en raison de la difficulté de prouver l’efficacité du vaccin dans ce modèle2. Les rats Fischer 344 a récemment été développé comme un modèle pour la tularémie vaccin développement3. La sensibilité du rat Fischer 344 à diverses sous-espèces de F. tularensis imite la sensibilité humaine4, et les rats peuvent être protégés contre l’infection pulmonaire F. tularensis par vaccination avec une souche de vaccin vivant connue pour protéger les humains5,6,7. Parce que les rats Fischer 344 modèles quelques caractéristiques de F. tularensis infection humaine, il peut être un modèle extrêmement utile pour le développement d’un vaccin qui protège contre pulmonaire F. tularensis exposition.
Un vaccin efficace a besoin pour protéger les humains contre l’exposition pulmonaire à F. tularensis. L’exposition pulmonaire probablement partir comme arme F. tularensis serait en aérosol bactéries inhalées dans les poumons8. Cependant, génération d’aérosols de F. tularensis est dangereux et lourde et nécessite de confinement et équipements spécialisés. Un autre itinéraire d’exposition pulmonaire chez le rat qui est peut-être plus adaptables pour plusieurs laboratoires manque matériel spécialisé, c’est par l’intermédiaire de l’inoculation par voie intratrachéale6. Cette technique utilise un laryngoscope pour le placement correct d’un cathéter dans la trachée d’un rat anesthésié. Placement dans la trachée, plutôt que de le œsophage, est vérifiée par un dispositif simple qui visualise les flux d’air dans les poumons. F. tularensis est ensuite livrée dans les poumons par l’intermédiaire du cathéter par l’administration avec une seringue, suivie par l’introduction d’air dans le cathéter pour assurer l’administration pulmonaire de la bactérie. En revanche, Jemski5 a déjà signalé que F. tularensis inoculés à des rats Fischer 344 par voie intranasale ne pourrait pas être cultivées dans les poumons jusqu'à 3 jours après l’inoculation, indiquant que l’inoculation par voie nasale chez les rats est pas de résultat en livraison directe de bactéries dans les poumons.
Sélectionnez agent formes de F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) nécessitent des procédures de confinement de biosécurité de niveau 3 (BSL3), ce qui empêcheraient la vidéographie. Cependant, F. novicida (Fn) est exonérée de l’état de l’agent de sélection en raison de ses avirulence chez l’homme sain et peut être utilisé en toute sécurité sous conditions de niveau de biosécurité 2 (BSL2)9,10. De plus, Fn sert de base pour les vaccins vivants atténués qui peut protéger contre l’exposition pulmonaire F. tularensis lorsque livré via intratrachéale inoculation11,12,13. La technique présentée ici permet l’étude des infections qui se produisent par l’intermédiaire de la voie pulmonaire utilisant le rat comme modèle pour l’homme. Cette technique peut être réalisée sans la nécessité d’un équipement spécialisé qui produisent des aérosols. FN a été utilisée pour les techniques tournés ici.
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Protocole
cette œuvre était jouée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health. Protocoles animales impliquant des rongeurs ont été approuvés par l’Université du Texas à San Antonio animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) en vertu du protocole MU009(RA).
1. cathéter préparer, l’indicateur de la trachée et F. tularensis Inoculum
- Préparer le cathéter (20 x 2 po)
- coupe le 20 x 2 en aiguille et de morcellement de la pointe de l’aiguille à un blunt et lisse finition avec un outil rotatif.
Remarque : La longueur de l’aiguille atténuée devrait permettre la pointe métallique d’annuler environ 3 mm dans la douille de cathéter lorsque complètement calé sur l’aiguille émoussé. L’aiguille émoussé donne la rigidité structurale du cathéter permettent un positionnement de la sonde dans la trachée, et l’absence de la pointe de l’aiguille émoussés qui sort de la gaine du cathéter empêche un dommage à la trachée. - Nettoyer les aiguilles émoussés et les cathéters à l’aide d’éthanol à 70 % et stériliser sous lumière UV pendant 15 min.
- coupe le 20 x 2 en aiguille et de morcellement de la pointe de l’aiguille à un blunt et lisse finition avec un outil rotatif.
- Indicateur de trachée préparer
- tailler une pointe de pipette 1 000 µL pour permettre à la pointe de s’asseoir dans une ouverture de cathéter et forme un joint étanche à l’air.
- Supprimer un filtre d’une 200 µL aérosol barrière de pipette et place à l’intérieur de l’embout de la pipette précédemment taillée 1 000 µL.
- S’assurer que le filtre puisse se déplacer librement à l’intérieur de l’embout de la pipette 1 000 µL lorsque la pointe pointe pointe vers le bas.
- F. tularensis Inoculum
- Grow F. tularensis souche du jour au lendemain sur gélose approprié à 37 ° C. gratter environ 100 µL de la pelouse bactérienne de la gélose avec une solution stérile Inoculer une boucle et permet d’inoculer un erlenmeyer contenant 250 mL de milieu de culture liquide approprié de 500 mL (pour Fn : bouillon trypticase soja (TSB) additionné de monohydrate de chlorhydrate de L-cystéine 0,1 %) et incuber secouant une nuit à 37 ° C.
NOTE : F. novicida utilisé dans la vidéo a été cultivé sur une plaque de gélose (TSA) de trypticase soja additionnée de monohydrate de chlorhydrate de L-cystéine 0,1 %. - Centrifuger la culture liquide cultivée durant la nuit à 4 221 x g à température ambiante pendant 10 min et retirez le surnageant sans déranger le culot de bactéries.
ATTENTION : Veuillez suivre institution ' s biosécurité recommandations visant à jeter le surnageant. - Doucement Resuspendre le culot bactérien avec 25 mL de milieu liquid approprié (Fn : BST additionné de monohydrate de chlorhydrate de L-cystéine 0,1 %) contenant 10 % de glycérol, à l’aide d’une pipette 25 mL.
- à l’aide d’une pipette de 1 mL, partie aliquote de la culture bactérienne remises en suspension dans 500 µL d’extraits dans des flacons, congeler dans un bain de glace carbonique et de l’éthanol et stocker à -80 ° C.
- Pour déterminer le titre des coupes congelées de la culture, retirer les deux flacons congelés conservés à-80 ° C, décongeler sur la glace et effectuer des dilutions successives en tampon Phosphate salin (PBS) suivi par ensemencement sur milieu de culture approprié (Fn : TSA contenant 0,1 % L-cystéine chlorhydrate de). Les plaques sont couvé 24-48 h à 37 ° C, et d’unités formant colonies (UFC) sont énumérées pour calculer le nombre de cellules bactériennes dans les flacons de culture congelée (moyenne des deux flacons).
- Préparer l’inoculum bactérien de dégeler un flacon congelé sur la glace et puis diluer la culture avec du PBS à la concentration finale de 10 7 UFC/100 µL. L’inoculum doit être à une concentration qui produire la CFU désirée dans 100 µL (la concentration finale de glycérol dans l’inoculum ne peut pas être plus de 3 %, afin d’éviter l’asphyxie du rat). Flacons de culture congelés conservés à-80 ° C peuvent être utilisés jusqu'à six mois après préparation.
- Grow F. tularensis souche du jour au lendemain sur gélose approprié à 37 ° C. gratter environ 100 µL de la pelouse bactérienne de la gélose avec une solution stérile Inoculer une boucle et permet d’inoculer un erlenmeyer contenant 250 mL de milieu de culture liquide approprié de 500 mL (pour Fn : bouillon trypticase soja (TSB) additionné de monohydrate de chlorhydrate de L-cystéine 0,1 %) et incuber secouant une nuit à 37 ° C.
2. Anesthésie de rat
- connecter la chambre de l’anesthésie pour le vaporisateur isoflurane correctement fonctionnement d’une machine d’anesthésie.
- Connecter le tube sur la chambre de l’anesthésie pour le système de gaz de gaz.
- Ouvrir le débit d’oxygène sur la machine d’anesthésie à 4 L/min.
- 5 % la valeur du vaporisateur isoflurane.
- Placer le rat dans la chambre de l’anesthésie.
Remarque : Nous utilisons généralement un rat entre 8-10 semaines (130 à 180 g) ; jeunes rats sont difficiles à inoculer par l’intermédiaire de cette technique en raison de l’exiguïté de la cavité buccale. - Lorsque l’induction de l’anesthésie a eu lieu, maintenir le rat à l’isoflurane 5 %, la teneur en oxygène de 2 L/min à effet. Cela prend environ 3-10 min.
- Déterminer la profondeur de l’anesthésie par la qualité et le taux de la respiration et du rythme cardiaque et réaction à une stimulation réflexe comme dans le test du pincement orteil. Profondeur idéale de l’anesthésie est indiquée par 1 à 1,5 s comptez entre chaque respiration.
3. L’Inoculation par voie intratrachéale
- retirer le rat de la chambre de l’anesthésie et placez le rat sur le dos sur le stand de rongeurs intubation. Fixez les incisives du rat au titulaire pour garder le rat en place.
Remarque : Si le rat commence à s’éveiller au cours de la procédure, le cathéter peut être enlevé et le rat retourné à la chambre de l’anesthésie pour atteindre un plan plus profond de l’anesthésie. - Utiliser la main dominante vers la langue du même côté que la main de prise en charge avec une pince de pouce large point vinaigrette.
- Utilisation support main et fixer la langue avec le laryngoscope contre le rat ' s mâchoire inférieure et visualiser la trachée et l’oesophage de l’animal. La trachée va ouvrir et fermer comme le rat respire.
- Insérer le cathéter contenant un calibre 20 aiguilles émoussées, préparé à l’étape 1.1, dans la trachée. Il y a peut-être une légère résistance et insertion dans la trachée peut être " bosselé " à cause du cathéter se frottant les cartilages trachées. En raison de l’humidité ou la respiration peu profonde, la trachée peut être couvert par l’épiglotte qui empêche la visualisation de la trachée. Toucher doucement le bord du cartilage épiglotte provoquera le clapet de cartilage d’ouvrir et de découvrir la trachée.
- Enlever l’aiguille émoussée du cathéter tout en assurant le cathéter à demeure dans la trachée.
- Prendra quelques secondes passer de rat pouvoir respirer autour de cathéter inséré dans la trachée.
- Asseoir fermement l’indicateur de la trachée sur le cathéter d’ouverture. Mouvement de la barrière de l’aérosol indiquera le cathéter est inséré correctement dans la trachée.
- Veiller à ce que le rat est la pose sur le stand d’intubation telle que la poitrine de l’animal fait face perpendiculaire au plan du stand intubation.
- Supprimer l’indicateur de la trachée et de livrer 100 µL (10 7 UFC) de l’inoculum contenant F. tularensis, à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL, solidement assise la pointe contre l’ouverture du cathéter.
- Attacher une seringue de tuberculine 1 mL feuillet pointe remplie d’air et de livrer 300 µL d’air afin d’assurer l’inoculum atteint les poumons du rat.
- Retirer le cathéter de la trachée et retirer le rat de la plate-forme chirurgicale.
- Laissez le rat réveiller et revenir à la cage. Veillez à ce que la respiration est revenue à la normale.
- Déterminer la CFU dans la F. tularensis inoculum comme indiqué au point 1.3.5 pour confirmer l’UFC livré dans la trachée.
- Répétez les points 3.1 à 3.9 sur des animaux non vaccinés (naïve) avec 100 µL de PBS à la place de l’inoculum.
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Résultats
La réponse humorale à l’inoculation par voie intratrachéale de F. tularensis chez le rat peut être déterminée par dosage immunoenzymatique (ELISA) contre les bactéries inactivées UV, comme décrit plus haut11. Réponse de l’immunoglobuline G (IgG) Total des rats Fischer 344 à germes entiers inactivés bactéries a été évalué post-intratrachéale inoculation avec une souche atténuée du Fn (inoculum d’UFC 107 ) au jour 14 et 28 (Fi...
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Discussion
Les rats Fischer 344 devient un modèle important pour la tularémie vaccin développement3. Exposition à F. tularensis , par le biais de la voie pulmonaire est essentielle pour démontrer l’efficacité contre des formes comme armes de F. tularensis, parce que ceux-ci sont livrés sous forme d’aérosols. L’inoculation par voie intratrachéale du rat facilite l’exposition des poumons rat à F. tularensis sans nécessiter de gros, coûteux et compliqué aérosol matériel de production....
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Remerciements
Cette étude a été soutenue par la défense menace réduction Agency (DTRA) sous contrat HDTRA1-14-C-0116 et le centre d’Excellence en génomique de l’Infection (DOD #W911NF-11-1-0136).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lame à fibre optique GreenLine taille 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh profil américain |
| GreenLight système laryngoscope poignée | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Seringues stériles 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 &mu ; Embout barrière L | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1 000 &mu ; Pointe de pipette L | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Kit d’outils rotatifs | Dremel | 3000228 | |
| Support d’intubation pour rongeurs | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Appareil d’anesthésie pour rongeurs | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Chambre d’anesthésie pour rongeurs | Braintree Scientific | AB 1 |
Références
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- Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952(2010).
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Réimpressions et autorisations
