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Article de méthode

Dérivation de lignées de cellules souches provenant d’embryons préimplantatoires souris

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⸱

DOI :

10.3791/56171

⸱

20 août 2017

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un protocole pour efficacement dérivent et la culture de lignées de cellules souches pluripotentes embryonnaires de souris au stade de blastocyste.

Résumé

Souris des cellules souches embryonnaires (mESC) dérivation est le processus par lequel pluripotentes lignées cellulaires sont établies d’embryons préimplantatoires. Ces lignes conservent la capacité à se renouveler ou faire la différence dans des conditions spécifiques. En raison de ces propriétés, mESC constituent un outil utile en médecine régénérative, modélisation de la maladie et études d’ingénierie tissulaire. Cet article décrit un protocole simple pour obtenir des lignes de mESC avec des rendements élevés de dérivation (60-80 %) en cultivant des blastocystes de souches de souris permissive sur cellules nourricières en milieu défini additionné du facteur inhibiteur de leucémie. Le protocole peut également être appliqué pour calculer efficacement mESC lignes de souches de souris non permissif, par le simple ajout d’un cocktail de deux inhibiteurs de petites molécules au milieu de dérivation (2i moyen). Des procédures détaillées sur la préparation et de la culture de cellules nourricières, collection et la culture des embryons de souris et la dérivation et la culture de mESC lignes sont fournies. Ce protocole ne nécessite pas de matériel spécialisé et peut être effectué dans n’importe quel laboratoire connaissant bien la culture des cellules de mammifères base.

Introduction

Cellules souches embryonnaires (CSE) sont des cellules pluripotentes provenant d’embryons préimplantatoires, qui conservent la capacité à se renouveler ou différencier sous conditions particulières1. Basé sur ces propriétés, les ESC sont devenus un outil utile pour la médecine régénérative, modélisation de maladies et tissus ingénierie études2.

ESC pour la première fois provenaient des embryons de souris préimplantatoire, originaires des lignées de souris ESC (mESC) avec faible succès3,4. Pendant des années, l’efficacité de la dérivation est restée faible en raison de la difficulté de maintenir la pluripotence in vitro. En outre la présence d’alimentation cellules5, qui améliorent l’efficacité de la dérivation, promouvoir l’attachement de la colonie et d’améliorer la stabilité caryotypique6, plusieurs modifications du protocole plomb à une amélioration de l’entretien de la pluripotence. Les plus importants sont l’ajout de la facteur inhibiteur leucémie (LIF) mESC milieu de culture7,8, l’utilisation d’embryons du contexte permissif de 129S29 et la culture de mESC avec additionné défini sérum, libre de potentiel de facteurs de différenciation10. Plus récemment, des preuves convaincantes ont montré que l’ajout d’un cocktail de deux petites molécules modulateurs des voies de signalisation au milieu de culture mESC (appelé 2i) est préférable de maintenir la pluripotence. Le cocktail de 2i se compose d’une combinaison de l’inhibiteur MEK PD0325901, ce qui réduit les signaux de différenciation en inhibant la voie de la kinase (MAPK) protéine mitogène-, et l’inhibiteur de la GSK3β CHIR99021, ce qui améliore la survie des cellules à faible densité en activant la voie de signalisation Wnt11.

Dans le présent article, nous décrivons un protocole simple pour calculer efficacement mESC lignes des blastocystes de souris. Nous suivons des procédures standards, mise en culture des embryons provenant des souches permissives sur cellules nourricières dans dérivation additionné FRV et d’un sérum remplacement12. Suite à ce protocole, les lignes de la mescaline peut être dérivée avec des rendements équivalents à ceux obtenus dans un milieu 2i. Malgré cela, 2i peut être ajoutée pour éviter d’éventuels problèmes avec pluripotence maintenance ou lorsque vous travaillez avec des souches non permissif.

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Protocole

l’utilisation des animaux décrits dans les sections ci-dessous a été approuvée par le Comité d’éthique sur l’Animal et de la recherche humaine de l’Universitat Autònoma de Barcelona et par la d Departament ' Pesca de Agricultura, Ramaderia, j’ai Alimentació de la Generalitat de Catalunya (protocole #8741).

1. Inactivation cellule chargeur et stockage

Remarque : fibroblastes humains prépuce (HFF-1) ont été précédemment gelés dans 1 mL de solution gel composé de 90 % sérum bovin fœtal (SVF) et 10 % diméthyl sulfoxyde ( DMSO) et conservées dans l’azote liquide jusqu'à l’utilisation.

  1. Décongeler un flacon cryogénique de HFF-1 (1 mL) en immergeant le flacon dans un bain-marie à 37 ° C.
  2. Ajouter le contenu décongelé du flacon cryogénique à préchauffé Dulbecco ' s Modified Eagle ' s moyen (DMEM) additionné de 10 % FBS pour faire un 01:10 dilution.
  3. Les cellules dilués (10 mL) de graines dans une fiole de T75 et leur culture à 37 ° C et 5 % de CO 2.
  4. Le lendemain, changer le moyen d’éliminer les restes de DMSO. Enlever le milieu et ajouter 10 mL de DMEM pré chauffé additionné de 10 % BF.
  5. Culture les HFFs et modifier le milieu toutes les 48 h jusqu'à ce que la culture atteint le stade confluent. Cela peut prendre environ 7 à 10 jours.
  6. Pour préparer la solution d’inactivation, diluer la mitomycine C dans DMEM supplémenté de 10 % FBS à une concentration finale de 10 µg/mL. Incuber les cellules avec la solution d’inactivation durant 3 h à 37 ° C et 5 % de CO 2.
  7. Enlever la solution de l’inactivation et rincer les cellules trois fois avec 2 mL de Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) pour éliminer les restes de la mitomycine C.
  8. Pour détacher les cellules inactivés, ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA préchauffée et incuber pendant 5 min à 37 ° C et 5 % de CO 2.
  9. Observer les cellules sous un microscope inversé pour s’assurer qu’ils sont détachés (objectif 10 x avec 0,3 ouverture numérique ou NA). Si ils ne le sont pas, eux incuber pendant plus de quelques minutes à 37 ° C et 5 % de CO 2. Vérifier les cellules de nouveau sous le microscope inversé à.
  10. Pipette de la solution avec une pipette Pasteur afin de dissocier les amas cellulaire.
  11. Neutraliser la solution enzymatique en ajoutant 4 mL de DMEM additionné de 10 % FBS et remettre.
  12. Prélever une partie aliquote de la suspension cellulaire et réaliser une dilution au 1/100 dans HBSS. Pour déterminer le nombre de cellules, charger 10 µL de la dilution dans un Neubauer ' chambre de s. Compter les cellules situés dans l’une des grandes places de la chambre sous un microscope inversé (objectif 20 x avec une NA 0,45).
    1. Répétition du dépouillement dans quatre grands carrés au total. Calculer le nombre total de cellules (N) n = nombre moyen de cellules comptées x volume total x dilution x 10 4.
  13. Centrifuger le reste de l’échantillon pendant 5 min à 200 x g. jeter le surnageant et Resuspendre le culot avec congélation d’une solution à une concentration de 10 6 cellules / mL.
  14. Partie aliquote de la suspension dans des fioles cryogéniques avec 10 6 cellules (1 mL) chacun. Placer les flacons cryogéniques dans un récipient froid et congeler à -80 ° C.
  15. Le lendemain, conserver les flacons cryogéniques dans l’azote liquide.

2. Culture cellulaire chargeur

  1. un à quatre jours avant de commencer le processus de dérivation, inactivé de dégel dans une cuvette cryogénique contenant 1 x 10 6 cellules HFF-1 dans un bain-marie à 37 ° C.
  2. Faire une dilution de 1:6 de la HFF-1 décongelés dans préchauffée DMEM additionné de 10 % FBS et maintenir la température à 37 ° C.
  3. Remplir chaque puits d’une plaque de 4 puits avec 500 µL de gélatine pré chauffé de 0,2 % de peau de porcine et de garder la plaque à 37 ° C pendant 10 min.
  4. Enlever les 500 µL de gélatine provenant des puits et ajouter 500 µL de la dilution HFFs. Balançant doucement la plaque afin d’assurer une distribution uniforme des HFFs au fond des puits. Évitez les mouvements circulaires, dans le cas contraire, les cellules seront concentrera au centre du puits.
  5. Incuber la plaque au moins 24 h à 37 ° C et 5 % de CO 2 pour obtenir une monocouche de HFFs inactivés dans chaque puits.
  6. Le lendemain, observer les cellules sous un microscope inversé (objectif 10 X avec NA 0,3) et vérifier qu’ils sont attachés et distribuées de façon homogène. Changer le support afin d’éliminer les restes de DMSO. Enlever le milieu et ajouter 500 µL de DMEM pré chauffé additionné de 10 % BF.

3. La collecte des embryons et la Culture

  1. quatre jours avant la collecte des embryons, administrer 5 UI de jument gravide ' gonadotropine sérique s par injection intrapéritonéale à des souris femelles de 6 à 12 semaines vieux.
    NOTE : Nous avons utilisé les femmes de la 129S2 ou de B6CFAF1 souches, bien que les femmes des autres souches de souris peuvent être utilisées. Néanmoins, quand travaillant avec des femelles de souches non permissif (p. ex. ABC), milieu devrait être complétée par 2i comme mentionné à l’étape 4.2.
  2. Après 48 h, administrer 5 UI de gonadotropine chorionique humaine par injection intrapéritonéale et accoupler les femelles avec des mâles, au moins 8 semaines, dans un rapport 1:1. Séparer les femelles des mâles le lendemain.
  3. La veille de la collecte des embryons, préparer une culture de cellules de 35 mm boîte de Pétri avec plusieurs 40 gouttes µL de milieu KSOMaag et 4 mg/mL d’albumine sérique Bovine (BSA) et remplir la plaque avec de l’huile minérale pour couvrir entièrement les gouttes. Incuber le plat à 37 ° C et 5 % de CO 2 s’équilibrer le milieu.
  4. Pour préparer des pipettes de manipulation embryonnaire, chauffer la partie la plus mince d’une pointe longue pipette Pasteur en verre à l’aide d’un bec Bunsen. Une fois tendres, sortez-la de la flamme et écartez les deux extrémités. Casser à la longueur souhaitée. Le diamètre intérieur à la pointe devrait être de 100 à 150 µm.
  5. Euthanasier les souris femelles par dislocation cervicale 45-48 h post-coitum (c.p.).
  6. De disséquer les souris pour exposer la cavité abdominale en coupant la peau avec des ciseaux pointus lisses incurvées et du péritoine avec des ciseaux pointus tout droit. Saisir un utérus avec une pince, coupez l’oviducte à l’aide de ciseaux pointus tout droit et placez-le dans le tampon Hepes CZB moyen (HCZB) 13 à 37 ° C. Répétez le processus pour supprimer l’autre oviducte.
  7. Chasse les oviductes avec une seringue de 1 mL chargés avec HCZB maintenu en place par forceps horloger pour recueillir les embryons de 2 cellules.
    Remarque : Pour préparer le rinçage aiguille, prendre une aiguille hypodermique de 30 G, couper la fin et la terre sur une pointe émoussée sur une pierre abrasive.
  8. à l’aide de l’appareil de pipette de bouche, ramasser les embryons, lavez-les dans HCZB et leur culture dans la boîte de Petri embryon préalablement préparée à 37 ° C et 5 % de CO 2 jusqu’au stade blastocyste. Jusqu'à 50 embryons peuvent être cultivées dans chaque goutte de 40 µL. Surveiller le développement de l’embryon toutes les 24 h sous un stéréomicroscope.
    Remarque : Vous pouvez également embryons peuvent être collectées au stade de blastocyste pour raccourcir la culture d’embryons in vitro. Dans ce cas, euthanasier les femelles à jour 3,5 à 4,5 p.c., disséquer l’utérus. et rincez-la avec HCZB.

4. Dérivation de cellules souches

  1. préparation des plaques dérivation
    1. le jour de l’embryon ensemencement, préparer le milieu de la dérivation de compléter un milieu DMEM avec 100 µM 2 β mercaptoéthanol, 1 x des acides aminés Non essentiels , 20 % de sérum de remplacement et 10 3 U/mL FRV.
    2. Si vous le souhaitez, également ajouter 1 µM de l’inhibiteur MEK PD0325901 et 3 µM de l’inhibiteur de GSK3 CHIR99021 pour obtenir un support 2i.
    3. Prendre la plaque de 4 puits avec la monocouche d’inactivé HFFs (étape 2.6) de la incubateur. Enlever le milieu et ajouter 800 µL de milieu de dérivation préchauffé dans chaque puits. Remettez la plaque dans l’incubateur.
  2. Suppression de la zone pellucide et embryon ensemencement
    1. préparer une culture de cellules de 35 mm boîte de Pétri avec gouttes de trois 30 µL d’acide Tyrode ' s solution 14 et gouttes trois 30 µL de milieu de dérivation. Couvrir les gouttes d’huile minérale et de garder le plat à 37 ° C.
    2. Prendre le plat de culture embryonnaire de l’incubateur. Un par un, transférez les blastocystes de la passe de la culture à un acide Tyrode ' goutte de solution de s à l’aide d’une pipette de manipulation d’embryon. Si possible, sélectionnez uniquement les blastocystes élargis pour démarrer le processus de dérivation.
    3. Moniteur la zone pellucide digestion sous le stéréomicroscope. Dès que la zone pellucide disparaît, transfert de blastocyste une baisse moyenne de dérivation afin d’estomper l’acide Tyrode ' solution de s.
    4. Prendre la plaque de 4 puits de dérivation de l’incubateur et semences un zona-free blastocyste sur le chargeur de cellules dans chaque puits.
    5. Retourner la plaque de 4 puits de dérivation à l’incubateur et la culture à 37 ° C et 5 % de CO 2.
  3. Contrôle la croissance des cellules de tige et moyen de changer
    1. surveiller les cultures toutes les 24 h sous un microscope inversé (objectif 20 X avec NA 0,45). Il est important de noter que s’il y a des signes de différenciation des cellules souches, tels que cellules gonflées de réfraction qui entourent l’excroissance ou même écartant la mangeoire cellules.
    2. Tous les jours, changer le milieu de la culture. Prendre la plaque de 4 puits de l’incubateur, retirer le support de chaque puits et ajouter 800 µL de milieu de dérivation pré chauffé additionné de FRV et 2i, si utilisé. Maintenir la culture jusqu'à ce que les excroissances sont observés (6-8 jours).

5. Culture de cellules souches et entretien

  1. Prepare Kolle-comme poignées et pipettes de manipulation des cellules souches. Suivez étape 3.4 pour préparer les pipettes de manipulation des cellules souches dont le diamètre intérieur au bout de 250-300 µm. permet de préparer la poignée Kolle-comme l’autre partie de la pipette Pasteur tirée. Faire chauffer et façonner jusqu'à l’obtention d’un crochet.
  2. Prendre la plaque de culture de 4 puits hors de l’incubateur et localisez l’excroissance sous un stéréomicroscope. Utilisez la poignée pour repousser les cellules différenciées et les mangeoires qui entourent l’excroissance.
    Remarque : Pour éviter d’éventuelle différenciation de l’excroissance, il est important d’éliminer toutes les cellules différenciées du bord de l’excroissance.
  3. Aspirer l’excroissance avec une pipette de manipulation des cellules souches et le placer dans un plat à nouveau une chute de la trypsine-EDTA 50 µL.
  4. Utiliser un scalpel pour couper l’excroissance dans plusieurs régions afin de ventiler il fois mécaniquement et enzymatiquement.
  5. Tout de suite transférer les fragments de l’excroissance dans une nouvelle goutte de milieu de dérivation pour neutraliser l’action de la trypsine.
  6. Transférer les fragments de l’excroissance d’une nouvelle plaque de 4 puits avec une monocouche de mangeoires. Transfert jusqu'à 10 fragments / puits et leur culture avec milieu de dérivation à 37 ° C et 5 % de CO 2.
  7. Maintenir les cultures de cellules souches semblables pendant au moins six semaines avant d’envisager la ligne mESC établie. Changer le support de tous les autres jours et sous-culture eux une fois par semaine.

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Résultats

Suite à ce protocole, plus de 95 % de la formation de l’excroissance devrait être réalisé après la première semaine de la culture (Figure 1 a). Mise en place de lignes de mESC après six passages est variable entre les répliques expérimentales, avec un succès moyen de 60 à 80 %. L’ajout de 2i n’améliore pas significativement les résultats lorsque vous travaillez avec des souches de souris permissive, tels que ceux ayant une formation de 129S2, mais il est néce...

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Discussion

Bien que la dérivation de ligne mESC est une procédure connue couramment utilisée dans de nombreux laboratoires, son efficacité n’est pas toujours plus élevée que prévu en raison des multiples facteurs qui peuvent perturber la pluripotence entretien. Dans le présent article, nous montrons, étape par étape, comment faire pour établir des lignes de mESC avec des rendements élevés à l’aide d’un protocole simple et fiable. Ces gains d’efficacité sont similaires à ceux rapportés dans la littérature.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Jonatan Lucas pour son assistance technique pour la culture de cellules d’engraissement, Servei Estabulari de la UAB pour soins aux animaux et Domènec Martín pour l’enregistrement de la vidéo. Ce travail a été soutenu par le Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R et la Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC est bénéficiaire d’une bourse de recherche de partenaires d’envol-UAB.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 mL de sryringeBD  ;
2-&bêta ;-mercaptoéthanolLife Technologies31350-010
Plaque 4 puitsThermo Scientific Nunc176740
Solution acide de Tyrode  ;Voir larecette dans Nagy et al, 2003. Pour un stockage à court terme (jusqu’à 1 mois), conservez-le à 4 °C. Sinon, pour un stockage à long terme, conservez-le à -20 °C. Si l’efficacité de la solution diminue, elle doit être acidifiée par l’addition d’une petite goutte de HCl 1M.
BSASigmaA3311
Poulet anti-Souris IgG, Sondes moléculaires Alexa Fluor 488- InvitrogenA-21200dilution 1:500. Anticorps secondaires contre les anticorps de souris Oct4, Tuj1, &alpha ;SMA et AFP.
CHIR990212Axon Medchem ;1386Reconstituer avec 2,15 ml de DMSO pour chaque mg de poudre, afin d’obtenir une solution mère de 1 mM. Aliquote au volume désiré et entreposer à -20 °C. Évitez les cycles de congélation et de décongélation.
CryoTubeThermo Scientific Nunc3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810Inactivez-le avant utilisation en le chauffant pendant 30 minutes à 56º ;C. Aliquot et stockez-le à -20º ; C
Aiguille de rinçageBD  ;304000Couper l’extrémité de l’aiguille et broyer en une pointe émoussée sur une pierre abrasive
Gélatine de peau de porcFluka48724Diluer à 0,2 % dans de l’eau distillée et autoclaver. Chaque dilution peut être utilisée pendant un mois.
Chèvre anti-Rabbit IgG, sondes moléculaires Alexa Fluor 594- InvitrogenA-11037dilution 1:500. Anticorps secondaire pour l’anticorps de lapin Sox2.  ;
HBSSBioWestL0611
Tamponné contre l’hépes CZB  ;FaitVoir la composition dans Chatot et al, 1989
Gonadotrophine chorionique humaineDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UIDiluer dans NaCl 0,9 % à 50 UI/ml. Aliquote-le dans 1 ml et stocker à -20º ; C pour une période maximale de deux mois. Une fois décongelé, ne congelez pas à nouveau.
Fibroblastes du prépuce humainATCCATCCSCRC-1041Pour un stockage à long terme, il est recommandé de les stocker dans de l’azote liquide.
Technologies de KnockOut Serum ReplacementLife Technologies  ; 10828-028Photosensible. Il est recommandé de l’aliquote dans de petits volumes tels que 10 ml et de le stocker à -20º ; C (vérifiez la date d’expiration). Évitez les cycles de gel et de dégel.   ;   ;
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050Supplément avec 4 mg/ml BSA. Equilibrer à 37º ; C et 5 % de CO2 par jour avant utilisation.
Facteur inhibiteur de la leucémieMerk MilliporeESG1106
sourisCharles River/HarlanIl est recommandé d’utiliser des souris d’une souche permissive en termes de dérivation de mESC (comme 129S2 ou C57BL). Cependant, les souches consanguines produisent moins efficacement des embryons. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser une souche hybride, telle que 129S2 x C57BL ou B6CBAF1 pour profiter de la vigueur hybride.
Huile minéraleSigmaM8410Testé sur les embryons. Photosensible.  ;
Mitomycine CServa2980501Reconstituer la poudre avec de l’eau MilliQ à 0,5 mg/ml. Conserver à 4º ; C à l’abri de la lumière. Attention, il est nocif et suspecté de provoquer le cancer.
Anti-tubuline de souris &beta ; III (Tuj1)BiolegendMMS-435Pdilution 1:500
Souris monoclonale anti-&alpha ;SMASigmaA5228dilution 1:200
Souris monoclonale anti-AFPR& D SystemsMAB1368dilution 1:50
Souris monoclonale anti Oct3/4  ;Santa cruzSc-5279dilution 1:50
Acides aminés non essentiels Life Technologies11140-035
PD0325901Axon Medchem  ;1408Reconstituer avec 2,08 ml de DMSO pour chaque mg de poudre, afin d’obtenir une solution mère de 1 mM. Aliquote au volume désiré et conserver à -20 °C. Évitez les cycles de congélation et de décongélation.
Boîte de Pétri (35mm)Thermo Scientific Nunc153066
Boîte de Pétri (60mm)Thermo Scientific Nunc150288
Sérum de gonadotrophine de jument gestanteFoligonFoligon-1000 UIDiluer dans NaCl 0,9 % à 50 UI/ml. Aliquotez-le dans 1 ml et conserver à -20º ; C pour une période maximale de deux mois. Une fois décongelé, ne congelez pas à nouveau.
Lapin policlonal anti-Sox2Merck MilliporeAB5603dilution 1:200
T75 falconThermo Scientific130190
Trypsine-EDTA 10xBioWestX0930Diluer 1:10 dans HBSS pour obtenir une solution 1x
309628 maison

Références

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