Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Xiangduo Kong; Gladys M.S. Cruz; Bárbara A. Silva; Nicole M. Wakida; Nima Khatibzadeh; Michael W. Berns; Kyoko Yokomori

doi:10.3791/56213

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Article de méthode

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

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DOI :

10.3791/56213

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31 janvier 2018

Xiangduo Kong^*¹ , Gladys M.S. Cruz^*² , Bárbara A. Silva² , Nicole M. Wakida² , Nima Khatibzadeh² , Michael W. Berns²^,³^,⁴ , Kyoko Yokomori¹

¹Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, ²Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, ³Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, ⁴Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Résumé

Dommages à l’ADN induit des réponses spécifiques de réparation et de signalisation dans la cellule, ce qui est essentiel pour la protection de l’intégrité du génome. Laser microirradiation est devenu un outil expérimental pour étudier la réponse (DDR) d’endommager ADN d' in vivo. Il permet en temps réel à haute résolution unicellulaire analyse dynamique macromoléculaires en réponse aux dommages causés par le laser limité à une région de SUBMICROMETRIQUES dans le noyau de la cellule. Cependant, diverses conditions de laser ont été utilisées sans appréciation des différences dans les types de lésions induites. En conséquence, la nature du dommage n’est souvent pas bien caractérisé ou contrôlés, causant des incohérences apparentes dans les profils de recrutement ou de la modification. Nous avons démontré que les conditions d’irradiation différentes (c'est-à-dire, différentes longueurs d’onde ainsi que différentes puissances d’entrée (irradiations) d’un laser femtoseconde (fs) (NIR) à proche infrarouge) induisaient assemblées distinctes de protéines DDR et de la réparation. Cela reflète le type de dommages à l’ADN produites. Ce protocole décrit comment titrage de puissance d’entrée du laser permet d’induction de différentes quantités et de la complexité des lésions de l’ADN, qui peut être facilement contrôlée par détection des dommages de base et réticulation, différentiel poly (ADP-ribose) (PAR) de signalisation, et réparation de voie spécifique les assemblys de facteur sur les sites de dommages. Une fois que les conditions de dommages sont déterminées, il est possible d’étudier les effets de la complexité des différents dommages et dégâts différentielle de signalisation ainsi que l’appauvrissement des facteurs en amont sur n’importe quel facteur d’intérêt.

Introduction

In Vivo Signalisation des dommages ADN, c’est pas bien comprise
In vivo, l’ADN est complexé avec des histones et d’autres facteurs à fibres de chromatine forme. Règlement de la structure de la chromatine est d’une importance primordiale pour le métabolisme de l’ADN. Par exemple, la variante de l’histone H2AX est phosphorylée par l’ataxie-télangiectasie muté (ATM) et d’autres kinases bicaténaires suivant rompt l’induction (ORD) et est important pour l’amplification du signal ORD dommages ainsi que fourniture d’un site d’amarrage pour d’autres facteurs. Propagation de choix de voie de signalisation et de réparation des dommages semb....