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Article de méthode

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

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DOI :

10.3791/56213

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31 janvier 2018

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1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Résumé

Dommages à l’ADN induit des réponses spécifiques de réparation et de signalisation dans la cellule, ce qui est essentiel pour la protection de l’intégrité du génome. Laser microirradiation est devenu un outil expérimental pour étudier la réponse (DDR) d’endommager ADN d' in vivo. Il permet en temps réel à haute résolution unicellulaire analyse dynamique macromoléculaires en réponse aux dommages causés par le laser limité à une région de SUBMICROMETRIQUES dans le noyau de la cellule. Cependant, diverses conditions de laser ont été utilisées sans appréciation des différences dans les types de lésions induites. En conséquence, la nature du dommage n’est souvent pas bien caractérisé ou contrôlés, causant des incohérences apparentes dans les profils de recrutement ou de la modification. Nous avons démontré que les conditions d’irradiation différentes (c'est-à-dire, différentes longueurs d’onde ainsi que différentes puissances d’entrée (irradiations) d’un laser femtoseconde (fs) (NIR) à proche infrarouge) induisaient assemblées distinctes de protéines DDR et de la réparation. Cela reflète le type de dommages à l’ADN produites. Ce protocole décrit comment titrage de puissance d’entrée du laser permet d’induction de différentes quantités et de la complexité des lésions de l’ADN, qui peut être facilement contrôlée par détection des dommages de base et réticulation, différentiel poly (ADP-ribose) (PAR) de signalisation, et réparation de voie spécifique les assemblys de facteur sur les sites de dommages. Une fois que les conditions de dommages sont déterminées, il est possible d’étudier les effets de la complexité des différents dommages et dégâts différentielle de signalisation ainsi que l’appauvrissement des facteurs en amont sur n’importe quel facteur d’intérêt.

Introduction

In Vivo Signalisation des dommages ADN, c’est pas bien comprise
In vivo, l’ADN est complexé avec des histones et d’autres facteurs à fibres de chromatine forme. Règlement de la structure de la chromatine est d’une importance primordiale pour le métabolisme de l’ADN. Par exemple, la variante de l’histone H2AX est phosphorylée par l’ataxie-télangiectasie muté (ATM) et d’autres kinases bicaténaires suivant rompt l’induction (ORD) et est important pour l’amplification du signal ORD dommages ainsi que fourniture d’un site d’amarrage pour d’autres facteurs. Propagation de choix de voie de signalisation et de réparation des dommages semblent être gravement influencé par la structure de la chromatine local au dommage sites1. Un certain nombre de remodelage des facteurs, des chaperons d’histone et histone enzymes de modification de la chromatine sont en effet recrutés pour endommager les sites et sont important pour la réparation de l’ADN efficace, soulignant l’importance de la régulation de la chromatine dans le DDR et de réparation2 , 3 , 4. en outre, site de dommages de clustering ou de repositionnement a été observé dans la levure et les drosophiles5,6,7,8, réminiscence de relocalisation du locus du gène dans le compartiment subnucléaire associé à gène règlement9,10. Études récentes chez les souris et les cellules humaines a également révèlent la mobilisation des sites de l’ORD, quelles influences réparer fidélité et voie de choix11,12. Cela soulève la possibilité que DDR/réparation peut également être intimement liée à l’architecture nucléaire, organisation d’ordre supérieur la chromatine et chromosome dynamique dans le noyau de la cellule. Ainsi, il est essentiel d’élaborer des méthodes à haute résolution pour étudier les DDR et processus dans le contexte de l’environnement nucléaire endogène dans une cellule direct de réparation afin de comprendre les conséquences à court et à long terme des dommages à l’ADN.

Critical Role of PAR polymérase (PARP) dans jauger l’étendue et le Type de dommage et la régulation des protéines Assemblée sur le Site de dommages
PARP1 est un capteur de nick ADN rapidement activé par des lésions de l’ADN qui joue un rôle essentiel dans la réparation de l’ADN13. PARP1 pensait à l’origine pour fonctionner avec rayons x réparer Cross complément 1 (XRCC1) pour faciliter la réparation d’excision de base (BER), mais des études récentes révèlent son rôle dans d’autres voies de réparation de l’ADN, y compris ORD réparation14. Activés PARP1 utilisations nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) comme substrat pour ADP-ribosylation des protéines cibles multiples, y compris lui-même. Cette enzyme et autres membres de la famille ont attiré beaucoup d’attention ces dernières années comme inhibiteurs de PARP ont émergé des médicaments thérapeutiques aussi prometteurs pour les cancers. Bien que les inhibiteurs de PARP trouvées au départ pour être efficace dans le gène du cancer du sein (BRCA)-mutation des cellules cancéreuses du sein, il y a maintenant une pléthore de preuves de leurs effets dans les thérapies de mono - et combinaison avec ADN, endommageant des agents/irradiation contre un large spectre de cancers présentant des mutations, sans s’y limitées BRCA15,16,17,18,19,20.

Au niveau moléculaire, activation de PARP s’est avérée un rôle essentiel dans l’organisation de la structure de la chromatine locaux sur les sites de dommages. Recrutement PAR dépendant des enzymes de modification de la chromatine facilite la réparation de l’ORD et préceptes réparer choix de voie, ce qui suggère le rôle important d’échafaudages de modification nominale sur les sites de dommages. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 , nous avons récemment démontré que l’exclusion de la protéine p53-1 (53BP1) contre les dommages des sites par 32, fournissant une autre explication pour l’hyperactivation de 53BP1 dépendant d’endjoining non homologue ( NHEJ) de PARP inhibiteur et soulignant l’importance de PARP en ORD réparation voie choix33,34. PARP1 également directement PARylates et affecte l’activité de plusieurs ADN réparation facteurs14.

À l’aide de Laser Microirradiation comme un outil pour étudier la DDR/réparation In Vivo
Microirradiation laser pour produire des altérations de la sub-micronique sur chromosomes individuels a été d’abord décrite en 1969,35 et a examiné en détail en 1981,36. Plusieurs décennies plus tard, microirradiation laser a été montrée pour induire des lésions de l’ADN dans une région définie SUBMICROMETRIQUES dans le noyau de la cellule et il a été prouvée comme une technique précieuse pour l’étude de recrutement ou modifications des différents facteurs de lésions de l’ADN in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. cette méthode permet de détecter les facteurs qui ne font pas les foyers distincts d’induite par l’irradiation (IRIF) dommages sites39,,42. Il est également possible d’examiner la dynamique spatio-temporelle des changements structuraux de la chromatine au sites de dégâts et dans le reste du noyau. Nous avons comparé soigneusement la DDR induite par les systèmes laser différentes et pouvoirs pour évaluer la relation entre le type de dommages à l’ADN et le microirradiation des conditions32,43,44, l’entrée 45. Les patrons de recrutement aberrant de 53BP1 et télomériques répéter facteur obligatoire 2 (TRF2) ont été observés dans les études précédentes de dommages laser, qui constituait la base de la préoccupation récurrente du caractère « non physiologique » de dommages causés par le laser46 ,47,48,49. Nous avons constaté que ces divergences apparentes maintenant s’expliquerait par différentiel PARP signalisation qui évalue la quantité et la complexité des dommages induits32. Nous avons confirmé que : 1) cellules laser-microirradiated (même après l’irradiation haute-puissance d’entrée) sont arrêtés en interphase en dommages checkpoint-fonction de contrôle et demeurer viables (au moins jusqu'à 48 h)32,50; et 2) réparation facteur recrutement/modification récapituler fidèlement ceux observés avec le traitement par des agents nocifs ADN conventionnels et l’induction de l’ORD par endonucléases32,39,,42, 44,50,51,52. Ces résultats appuient fortement la pertinence physiologique d’étudier les réponses cellulaires induites par des dommages de laser.

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Protocole

1. base cellulaire préparation

Remarque : Cette étape est pour détection par immunofluorescence standard du recrutement des protéines endogènes ou modification et l’utilisation d’une lignée de cellules exprimant une protéine recombinante fluorescent étiquetée de manière stable. Par exemple, les cellules épithéliales de rein marsupial de Potorustridactylus (PtK2) exprimant de manière stable EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP ont été utilisés dans notre précédente étudient (Figure 1)32. Dans le premier cas, l’accent formant la région de 53BP1 (acide aminé 1220-1711) qui contient le domaine d’oligomérisation, le domaine de Tudor et le motif de recrutement non-dégradante-dépendante (UDR), a été fondue à GFP améliorée (EGFP-53BP11220-1711). Cette protéine de fusion récapitule le recrutement de site de dommages de la pleine longueur 53BP153,54,,55. Dans les cellules HeLa, fluorescent étiquetées sous-unités de cohesin (par exemple, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52et 51de la GFP-SA2) doivent être stablement exprimées pour assurer l’intégration efficace dans le complexe et récapituler le S/G2 cycle cellulaire des dommages spécifiques phase site recrutement endogène cohesin51.

  1. Graines de n’importe quel type de cellules adhérentes sur un plat de vitroplants de 35 mm avec une lamelle maillé pour permettre l’identification de cellules individuelles. Ajuster le nombre de cellule initiale pour atteindre 60 % confluence en 36 à 48 heures selon le taux de prolifération de la lignée cellulaire particulier. Par exemple :
    1. Pour les cellules épithéliales des reins marsupial PtK2 (type sauvage ou ceux exprimant de manière stable EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP) : plaque 2,0 x 104 cellules dans 2 mL milieu essentiel Minimum avancée (MEM) additionné de 2 mM de L-Glutamine, les foetus bovin 4 % sérum (FBS) et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine) et incuber à 37 ° C, avec 7 % de CO2.
    2. Pour HeLa cellules exprimant de manière stable fluorescent tag protéines recombinantes GFP-SA2 : semences 1,0 x 105 cellules dans 2 mL moyen de (DMEM de l’aigle de la modification de Dulbecco) additionné de 10 % FBS, 2 mM de L-Glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine, et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Autres cellules HeLa peuvent également être utilisés, y compris les cellules non modifiés ou cellules exprimant hSMC1-GFP.
  2. Permettre aux cellules d’adhérer et de proliférer pendant 36 à 48 heures avant l’induction de dommages d’ADN au confluent de 30 à 60 % (pour permettre la visualisation du nombre grille). Passez à la Section 4.

2. transitoire Transfection

Remarque : Parfois bons anticorps ne sont pas disponibles pour détecter les protéines endogènes. Si n’existent pas de lignées de cellules exprimant de manière stable des protéines de marqueur, effectuer des transfections transitoires pour surveiller les protéines fluorescent étiquetés pour les analyses de cellules vivantes.

  1. Pour les cellules HeLa, jour 1, 6-8 x 104 cellules dans 0,5 mL de milieu de culture dans un puits d’une plaque 24 puits de graines et incuber dans un incubateur humidifié à 100 % à 37 ° C et avec 5 % de CO2. Reportez-vous à l’étape 1.1 pour des conditions de milieux de culture.
  2. Jour 2, utilisation réparer un plasmide d’expression mammifère codant un ADN fluorescent étiqueté facteur (par exemple, GFP-NTH1 ou GFP-OGG1 pour dégâts de base32,44,56, GFP-Ku à haute dose DSBs57, GFP-53BP1 32 pour DSBs relativement simples, ou d’autres protéines d’intérêt fusionné au tag fluorescent) pour effectuer la transfection d’ADN induite par le liposome. Diluer à 0,3 µg ADN plasmidique, dans 25 µL de milieux de culture sans sérum dans un tube de 1,5 mL.
  3. Dans un autre tube de 1,5 mL, diluer 1 réactif transfection µL ADN à base de liposomes dans 25 µL de milieux de culture sans sérum et mélanger doucement.
  4. Mélanger l’agent dilué de l’ADN et transfection doucement et incuber pendant 10 min à température ambiante (RT) pour former des complexes ADN-lipides.
  5. Rincer les cellules avec 0,5 mL de milieu de culture une fois, retirez le support et ajouter 0,5 mL frais milieux de culture pour les cellules (comme à l’étape 1.1).
  6. Ajouter les complexes ADN-lipides dans les cellules. Mélanger doucement à la plaque à bascule quelques fois. Remettre les cellules dans l’incubateur comme à l’étape 2.1.
  7. Après 4 à 6 h, retirez le support de culture des cellules et ajouter 300 µL 0.05 % trypsine-EDTA. Supprimer, ajouter 200 µL trypsine-EDTA et incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 3-4 min.
  8. Après avoir vérifié que les cellules sont détachent, ajouter des milieux de culture 800 µL et remettre en suspension les cellules par pipetage doucement pour briser les agrégats de cellules. Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de Petri 35 mm avec une lamelle de maille et ajouter des milieux de culture pour un volume final de 2 mL.
  9. Incuber les cellules dans un incubateur comme à l’étape 2.1 pendant 48 h, puis passez à la Section 4.
    Remarque : Si l’expression de la protéine recombinante est toxique (cellules transfectées Voir la morphologie ronde ou irrégulière après incubation à l’étape 2.8), raccourcir le temps d’expression et effectuer le laser microirradiation (Section 4) à 16-20 h après la transfection, aussi longtemps que la expression de la protéine peut être confirmée (pour la détection de la fluorescence, reportez-vous à l’étape 4.3). Dans ce cas, effectuer la transfection directement dans le plat de 35 mm. Semences 3.0 x 105 HeLa cells dans un plat de 35 mm avec une lamelle maillé pour atteindre environ 50-70 % confluent après plasmides d’ADN à transfecter h. 30 et changer les médias 2 à 6 h après la transfection. Poursuivez le laser microirradiation 12-20 h plus tard si l’expression de la protéine est raisonnable et cellules apparemment en bonne santés.

3. Cycle cellulaire synchronisation

Remarque : Pour la recombinaison de réparation (HR) protéines, telles que Rad51 et cohesin, le recrutement est plus important dans la phase S/G2 du cycle cellulaire, dans laquelle HR réparation prend place51. Ainsi, pour surveiller le recrutement de ces protéines, synchronisation cellulaire à la phase S/G2 est nécessaire.

  1. Synchronisation de phase S/G2
    1. Utiliser le protocole de bloc de thymidine double pour la synchronisation de la cellule à S/G2 phase50,,51. Après l’ensemencement les cellules dans un plat de lamelle maille de 35 mm (Voir l’étape 1.1), incuber les cellules avec la thymidine (pour une concentration finale de 2,5 mM) dans les milieux de culture (comme à l’étape 1.1) pendant 17 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
    2. Rincer les cellules avec 1 mL exempt de thymidine des milieux de culture (comme à l’étape 1.1) deux fois et incuber les cellules dans les milieux de culture exempte de thymidine 2 mL pendant 9 h comme à l’étape 1.1.
    3. Ajouter 200 µL de solution mère de thymidine 27,5 mM (dissoute dans les milieux de culture) dans les milieux de culture avec les cellules à une concentration finale de thymidine 2,5 mM. Incuber les cellules comme au point 3.1.1 pour un autre 15 h. rinçage et incuber les cellules dans des milieux de culture sans thymidine pour 4 à 6 h et induire des lésions de l’ADN (Section 4).
    4. Confirmer l’efficacité de synchronisation à l’aide de marqueurs du cycle cellulaire (cycline A2 et B1 pour S/G2 et G2, respectivement), S/G2 phase ADN dommages réparation des facteurs spécifiques (p. ex., Rad51 ou cohesin), ou par l’UDI/EdU incorporation (pour les cellules en phase S)51.
  2. Synchronisation de phase G1
    1. Graines de 6-8 x 104 les cellules HeLa dans une boîte de Petri 35 mm avec lamelle maillé (étape 2.1).
    2. Après 2 jours, identifier les cellules en métaphase, qui sont légèrement relevée et ronds, sous un microscope inversé en utilisant l’objectif 10 X et 10 X oculaires lentilles. Acquisition d’images pour enregistrer la position des cellules en métaphase sur la lamelle maille.
    3. Après 3-4 h, confirmer la division cellulaire en deux cellules filles (en phase G1) et induire des lésions de l’ADN (Section 4).

4. titrage d’un Laser de puissance absorbée

Remarque : Dans ce protocole, nous induire des lésions de l’ADN à l’aide d’un 780 nm pulsé système de laser NIR fs attaché à un microscope confocal, ou un 800 nm laser NIR de fs couplé à un microscope inversé épifluorescente pulsé. Bien que la puissance d’entrée nécessaire pour induire la DDR comparable (irradiance réelle au point focal laser dans l’échantillon) est différente dans ces systèmes, le principe de base du titrage de puissance d’entrée est applicable pour les deux, ou n’importe quel, NIR systèmes32,57 . L’énergie in situ par l’irradiance laser pulse et pointe au point focal pour les systèmes deux laser étaient de l’ordre de 5,33 × 10-2-4 × 10-1 nJ et 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, respectivement32.

  1. Allumer l’appareil NIR et permettre au système de laser de warm-up pendant 1 h avant utilisation.
  2. Placez un plat de cellules sur une scène de chaud (37 ° C) dans une chambre qui permet de CO2 (5 %) et le contrôle de l’humidité (100 %).
    Remarque : Si une chambre de CO2 n’est pas disponible, utilisez CO2-milieux de culture indépendante jusqu'à 5-6 h. Si une phase de chauffage n’est pas disponible, garder les cellules au microscope pour < 20 min et remplacer immédiatement dans l’incubateur de culture de tissus avec une température adéquate, CO2et contrôle de l’humidité. Ces conditions de culture peuvent varier selon le type de cellule spécifique utilisé ainsi que l’organisme de dérivation (par exemple, les mammifères et les amphibiens).
  3. Pour l’analyse de cellules vivantes des protéines fluorescent étiquetées, sélectionnez un filtre GFP (excitation de 450-490 nm, émission de 515-586 nm) ou Cy3 (540-552 nm excitation, émission de > 590 nm) pour GFP ou fusionnés avec le mCherry protéines, respectivement, à l’aide d’un 100 X ou immersion dans l’huile X 63 objectif.
  4. Recherche de cellules qui contiennent des signaux de fluorescence comparables, reflétant des niveaux comparables d’expression de la protéine. Évitez les cellules qui ont une expression trop faible ou trop forte afin de réduire la variabilité des mesures de fluorescence cellule-cellule.
  5. Titrer la puissance d’entrée du laser.
    1. laser NIR 780 nm attaché à un microscope confocal
      1. Utiliser la fonction logicielle de l’eau de Javel pour cibler les titres linéaires à l’intérieur du noyau de la cellule d’exposition aux scans laser unique (résolution 512 x 512 pixels, zoom X1, blanchi région 50 x 4 pixels, temps de pause pour le pixel 12,8 µs, itération x1) par le biais de l’objectif de l’huile (100 X / 1.3 NA).
      2. Ajustez le pourcentage de transmission de laser (en utilisant le logiciel/matériel intégré dans le système de microscope laser par le fabricant) à 5 % sans changer d’autres paramètres.
      3. Placer une cellule dans le centre du champ. Cliquez sur la zone d’outil d’intérêt (ROI) et dessiner une ligne ou une zone (environ 50 x 4 pixels) dans le noyau à l’aide de la souris et cliquez sur le bouton « Bleach » pour provoquer des dommages à l’ADN.
        Remarque : Dans les étapes ultérieures de l’irradiation, « blanchiment » devrait être augmenté par tranches de 5 % à 40 % ou à 100 % si nécessaire.
      4. laser NIR 800 nm attaché au microscope à fluorescence-epi
      5. Contrôler l’alimentation d’entrée à travers un (63 X / 1.4 NA) objectif à immersion d’huile contraste phase de rotation motorisée d’un filtre de polarisation introduite dans la marche des rayons et monté sur une platine de rotation motorisée commandée par ordinateur32,39 , 58.
      6. Ajustez l’angle de polariseur (°) et mesurer la puissance d’entrée (mW) entrant dans le microscope, à l’aide d’un mesureur de puissance de laser. Déterminer les angles de polariseur qui fournissent des puissances d’entrée qui vont de 20 mW-155 mW par tranches de 5 à 10 mW.
      7. Régler l’angle de polariseur qui correspond à la puissance d’entrée de 20 mW.
        Remarque : Pour notre système de laser, si l’angle de polariseur est 40 °, la puissance d’entrée est de 65 mW. Augmenter la puissance d’entrée avec des incréments de 5 à 10 mW.
  6. Pour l’analyse des cellules vivantes, aller aux étapes 6.1 et 6.3. Pour la détection par immunofluorescence des protéines endogènes ou modifications, passez à la Section 5. Après l’analyse, passez à l’étape 4.7 titrages outre de la puissance du laser. Pour analyser l’exigence de facteur en amont, allez à la Section 7.
    Remarque : Le recrutement des facteurs BER et NHEJ est rapide (en quelques minutes) et transitoires (< ~ 30 min - 1 h selon le poste de facteur et ~ 4 h < endommager induction, respectivement). En revanche, le recrutement des facteurs HR Rad51 et cohesin est détectable à ~ 30 min - 1 h et ils ont tendance à persister plus de 8 h à44,de la lésions de l’ADN non réparé50,51. Ainsi, il est nécessaire d’examiner les différents temps points après irradiation pour réparation de différents facteurs.
  7. Augmenter la puissance d’entrée de désiré (c.-à-d., 5 % pour 780 laser NIR et 5 à 10 mW pour 800 NIR) comme au point 4.4 et répétez les étapes 4.5-4.7 sur une nouvelle série de cellules afin de déterminer le seuil (50 % des cellules endommagées Voir la recrutement) et maximale (100 % des cellules Voir la recrutement) pour chaque protéine.

5. immunofluorescence souillant

Remarque : pour la détection de modification covalente de protéines, tels que nominale (marqueur de dégâts complexes) et de la phosphorylation de H2AX (γH2AX) (marqueur de l’ORD), ainsi que les dimères de pyrimidine de cyclobutane (CPD)/(6-4) photoproduits (6-4PP) et 8-oxoguanine (8-oxoG) (réticulation et base des marqueurs de dégâts, respectivement), les cellules doivent être fixées et colorées avec les anticorps spécifiques. En outre, il est préférable de confirmer les résultats obtenus avec les protéines recombinantes fluorescent étiquetés par détection d’anticorps des protéines endogènes, pour distinguer les artefacts induites par la surexpression de protéines de fusion recombinantes.

  1. Difficulté des cellules à des moments différents après induction de dommages (étape 4.5) selon les facteurs en remplaçant les milieux de culture (voir étape 1.1) avec 1,5 mL de 4 % paraformaldéhyde/1 X PBS pendant 10 min à température ambiante.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde vapeurs sont toxiques et tous les travaux devraient être effectués sous une hotte ventilée.
  2. Retirez les 4 % paraformaldéhyde/PBS et ajouter 1 mL de détergent/PBS de 0,5 % pendant 10 min à température ambiante.
  3. Éliminer les cellules de détergent/PBS et rinçage de 0,5 % avec 2 mL de PBS pendant 5 minutes deux fois et incuber les cellules dans 2 mL de solution de blocage (sérum de veau de 10 %, 1 % BSA/PBS) pendant 1 h à température ambiante.
  4. Enlever la solution de saturation et ajouter 2 mL de PBS aux cellules et remplacer les PBS avec 250 µL de solution de l’anticorps primaire de 3 % BSA/PBS pendant la nuit à 4 ° C ou 1 h à RT. utilisation un 1 : 200-dilution 1/500 (concentration typique environ 1 µg/mL, déterminé empiriquement) pour les anticorps spécifique pour les différents dommages marqueurs (par exemple, γH2AX/53BP1 (ORD) ; Ku (DSB, NHEJ) ; RAD51/cohesin (DSB, HR) ; 6-CPD/4PP (dégâts de réticulation) ; 8-oxoG/DNA glycosylases (p. ex., NTH1) (dommages de base) ; PAR (dégâts complexe haute dose)).
  5. Supprimer la solution d’anticorps et rincez avec 2 mL de PBS pendant 5 minutes deux fois, enlever PBS et incuber avec 250 anticorps secondaire de µL 0,1 % à 3 % BSA/PBS pendant 1 h dans l’obscurité à température ambiante.
  6. Enlever la solution de l’anticorps secondaire et ajouter 2 mL de PBS pendant 5 minutes deux fois et maintenir les cellules en 1,5 à 2 mL de PBS à 4 ° C pour l’imagerie en étapes 6.1 et 6.2.

6. quantitative Fluorescence analyse d’immunomarquage ou des cellules vivantes

  1. Capturer des images de cellules colorées ou en direct (n > 10) à l’aide de microscope utilisé pour l’irradiation. Pour le système de microscopie épifluorescente, utilisez la résolution de 1 344 x 1 024 pixels et enregistrer les images sous forme de fichiers TIFF 16 bits. Pour un microscope confocal, utiliser 1 X grossissement ; Laser à argon pour GFP/FITC, laser HeNe 594 pour Cy3/mCherry ; 512 x 512 ou 1 024 x 1 024 pixels pour la résolution de l’image ; vitesse 5, nombre de numérisation : 1 pour un balayage rapide ou 2 + pour une moyenne de plus de scans multiples pour améliorer le rapport signal sur bruit.
  2. Utiliser une analyse de l’image les programmes conçus pour mesurer l’intensité du pixel.
    1. Utilisez l’outil Rectangle de Volume pour dessiner un ROI autour du site de dommages à l’image de la cellule individuelle. Utilisez la même taille ROI pour mesurer le signal de fluorescence de fond dans le nucléoplasme adjacent à, mais ne pas de chevauchement avec les sites de dommages. C’est important pour la normalisation de photoblanchiment associé au système de microscope confocal-non.
    2. Pour mesurer des signaux de fluorescence à l’aide du programme d’analyse de l’image, cliquez sur « Rapport d’analyse Volume » dans la boîte à outils. Une nouvelle fenêtre apparaîtra. Dans la section « Données à l’écran », ne vérifiez que les cases « Nom » et la « Densité ». Puis cliquez sur « Done » pour visualiser les mesures.
    3. Exporter les valeurs vers un tableur en cliquant sur l’icône du tableau au bas de la fenêtre rapport de Volume et sélectionnez « onglets (format excel) » pour les séparateurs de champs et « File » à Destination de l’exportation.
    4. Pour obtenir les signaux relatifs, utiliser le tableur pour diviser l’intensité de la fluorescence sur le site de dommages (colonne 1) par qui, dans le contrôle arrière-plan région (colonne 2) dans le nucléoplasme et soustraire 1 à la normalisation.
  3. Analyse temporelle de fluorescence quantitative en temps réel à l’aide de la microscopie confocale
    1. Identifier des cellules positives à protéines fluorescent étiquetés en utilisant le microscope comme au point 4.3.
    2. Effectuer imagerie de fluorescence Time-lapse avant dommage et à des moments différents après induction de dommages à la Section 4. Commencez par dessiner le ROI de l’eau de Javel (pour l’induction de dommages), puis sélectionnez le « Acquire > séries chronologiques » sous-menu, définir « Numéro » comme 20 et le « retard de cycle » comme 30 s, choisissez « eau de Javel une fois après la première analyse » et puis en cliquant sur « start B ». Dans ce cas, la première image est acquis immédiatement avant induction de dommages, suivie de 19 acquisitions d’image à un intervalle de s 30. Intervalles (« retard de cycle ») peuvent être changés selon le but de l’étude.
    3. Une fois que l’acquisition d’image est terminée, cliquez sur « Signifie » et dessiner le ROI à la région de dommages. Cliquez sur « Afficher la Table » pour obtenir un tableau énumérant l’intensité dans la ROIs sélectionnée. Normaliser les données en divisant l’intensité de la fluorescence de l’emplacement des dommages à différents moments par l’intensité de la même région avant de dommages et soustraire 1.

7. small Interfering RNA (siRNA) Transfection

Remarque : L’appauvrissement de la protéine cible est un moyen efficace pour délimiter l’exigence de facteur en amont pour le recrutement de protéines observées à endommager les sites (Section 4). En outre, la stratégie est la meilleure façon d’aborder la spécificité d’un anticorps de détection par immunofluorescence (voir la Section 5).

  1. Jour 1 : Préparer 2 puits de cellules HeLa dans une plaque 24 puits par ensemencement 6-8 x 104 les cellules HeLa dans 0,5 mL de milieu de culture dans chaque puits, un pour la transfection de siARN contrôle et l’autre pour PARP1 siARN (5'-GCC AGA AAT CCT TTA TDC CAA-3').
  2. Jour 2 : Confirment que les cellules sont environ 40-50 % anastomosé. Effectuer le premier tour de la transfection des siARN : diluer 5 pmol siRNA dans 25 µL de milieux de culture sans sérum, ajouter 3 lipides µL réactif de transfection, basées dans le tube, mélanger doucement et incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
  3. Rincer les cellules avec les milieux de culture fraîche 0,5 mL une fois et de garder les cellules dans 0,5 mL de milieu de culture fraîche (voir étape 1.1).
  4. Ajouter les complexes de RNA-lipides dans les cellules et mélanger doucement en inclinant le plat en arrière. Remettre les cellules dans l’incubateur comme à l’étape 2.1.
  5. Aspirer le mélange de transfection et ajouter des milieux de culture fraîche 0,5 mL (étape 1.1) après 6 h.
  6. Jour 3 : Effectuer le second tour des siARN transfections (voir étape 7.2). Ensuite, les semences 60-100 % des cellules dans un plat de lamelle maille 35 mm comme indiqué au point 2.3.
  7. Jour 5 : Aller de l’avant avec laser microirradiation à l’aide de l’état de puissance laser optimale pour un recrutement maximum du facteur d’intérêt, tel que déterminé par l’article 4. En règle générale, l’appauvrissement efficace s’observe chez environ 60-90 % des cellules HeLa.
    Remarque : Comme alternative et complémentaire approche, inhibiteurs, si disponible, permet d’inhiber la fonction du facteur d’intérêt32,44. Pour analyser l’effet d’inhibition de la signalisation de DDR, ajouter 20 inhibiteur PARP µM 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) inhibiteur ou 10 µM ADN-dépendante protéine kinase avec inhibiteur de la sous-unité catalytique (ADN-PKcs) et inhibiteur de ATM 10 µM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à la plats 1 h avant l’induction de dommages. Ajouter DMSO uniquement aux cellules de contrôle.

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Résultats

À l’aide de PtK2 cellules exprimant de manière stable EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP, titrage de puissance d’entrée de laser a été réalisée afin de déterminer les conditions optimales pour leur recrutement (Figure 1)32.

Sites de laser de haute puissance d’entrée de dommages, le regroupement significatif des CPD (réticulation dommages typiquement généré par des dommages ultraviolet (UV)) ainsi que de la GFP-NTH1 DNA glycosylase q...

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Discussion

Les avantages de l’utilisation de laser microirradiation pour recherche DDR sont :

1. il est possible d’induire différents types et quantités d’ADN dommages causés par les cassures simple brin pour dommages à l’ADN complexes, et pour détecter les réparation différents facteurs à l’ADN endommagent sites en ajustant les paramètres de l’irradiation laser. Il est également possible d’infliger des dommages à plusieurs reprises dans un même noyau de cellule afin d’évaluer les effets de trans

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Akira Yasui à l’Université de Tohoku, Japon pour le plasmide d’expression de GFP-NTH1 et Dr. Eros Lazzerini Denchi au Scripps Research Institute, La Jolla, en Californie, pour la TRF2-YFP et EGFP-53BP11220-1711 plasmides d’expression. Ce travail a été soutenu par l’Air Force Office of Scientific Research (FA9550-04-1-0101) et la Fondation Beckman Laser Institut Inc. (pour M.W.B), la Ford Foundation Fellowship de la National Academy of Sciences (d’après) et NSF MCB-1615701 et CRCC CRR-17-426665 (de K. Y.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ti :Sapphire NIR laser femtoseconde pulsé Mira-900Coherent Inc.Mira 900
  ;Carl ZeissAxiovert 200M
63X/1.4 Objectif NAZeissAPOCHROMAT Ph3  ;
Platine de rotation compacteNewport CorpPR50PP
Régulateur de températureWarnerTC-344B
Système de chauffageIbidi  ;10918
Système d’incubation de gazIbidi  ;11920
Compteur de puissance et d’énergie laser (RoHS)ChampcohérentMaxII-TOP  ;
ORCA-R2 Caméra CCD numériqueHamamatsuC10600
LSM 510 META Microscopes à balayage laserCarl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APOCarl Zeiss
35mm Quadrillé Plats  ;MatTekP35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 cellules épithéliales rénalesATCCCCL 56  ;
Cellules HeLaATCCCCL-2
DMEMLife Technologies11885-092
Milieu indépendant du CO2  ;Life Technologies18045-088
MEM avancé  ;Life Technologies12492-013complété par de la L-Glutamine, 4 % FBS
pénicilline/streptomycineFisher Scientific15140122
L-GlutamineFisher Scientific25030081
FBSOmega ScientificFB-02
Thymidine  ;  ; SIGMAT9250
sérum sans media  ;   ;   ;   ; (Milieu sérique réduit Opti-MEM I)Fisher Scientific11058021
Dimère de pyrimidine anti-cycolbutance (CPD) (souris)Kamiya Biomedical CompanyMC-062
Anti-XRCC1 (souris)Gene Tex IncGTX72311
Anti-53BP1 (lapin)Santa Cruz Biotechsc-22760
Anti-CtIP (lapin)Abcamab70163
Polymères anti-PAR (souris)Enzo Life SciencesBML-SA216-0100
Anti-PAR (lapin)Trevigen4336-BPC-100
Anti-TRF2 (souris)Novus Biological  ;NB100-56506
Anti 6-4PP (souris)Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Lapin)  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; (pour la détection de la cohésine)généré dans le laboratoire
Anti-Rad51 (Lapin)Santa Cruz BiotechnologySC-8349
Anti-Ku70 (souris)  ; Novus BiologicalsNB100-102
8-oxiguanine  ;Trévigen, Inc.
Anti-PARP1  ; (Lapin)  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;généré dans le laboratoireref 43
  ; Anti-hCAPG (Lapin)  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; (pour la détection de condensine)généré en laboratoireref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  ; Jackson ImmunoResearch Inc711-165-152
Âne Anti-Souris Alexa Fluor 488 IgGThermo Fisher ScientificA-21202
HiPerFect siRNA Réactif de transfectionQiagen301705
Lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668019
GFP-SMC1 lignée cellulaire stable   ;   ;   ;généré dans le laboratoireref 49  ;
Lignée cellulaire stable GFP-NEIL2générée dans le laboratoireref 54
Lignée cellulaire stable GFP-NTH1générée dans le laboratoireref 32
Plasmide GFP-SMC1généré dans le laboratoire
Plasmide GFP-Kugénéré dans le laboratoire
Anti-MDC1 (lapin)  ; Novus BiologicalsNB100&ndash ; 395
Anti-gH2AX (lapin)  ; Millipore07&ndash ; 164
EGFP-53BP1(1220-1711) Lignée cellulaire stable PtK2générée dans le laboratoireref 32
TRF2-YFP Lignée cellulaire stable PtK2générée dans le laboratoireref 32
DMSOSigmaD2650-100ML
Inhibiteur de PARGTrevigen4680-096-03
ADN&ndash ; Inhibiteur de PKcs  ; NU7026  ;Inhibiteur de l’ATM SigmaN1537
KU55933  ; Calbiochem118500
Olaparib  ;Apexbio TechnologyA4154
Paraformaldéhyde  ;MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE SCIENC MS100503-916 (EA)
Quantité Un Logiciel d’analyse 1-D Version 4.6.9Bio-RadSOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  ;Programme d’analyse d’images
Tableur ExcelMicrosoft
Triton X100Fisher ScientificBP151-500détergent
Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco 10X sans calcium ni magnésiumFisher Scientific14200166diluer à 1X  ;
Microscope inversé de Yokomori (KY) KY KY KY KY KY KYKY de Berns de Berns

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R ponse aux dommages de l ADNcassure double brindommage aux basespoly ADP ribosylationmicroscopie confocalemarquage par prot ine fluorescentesynchronisation du cycle cellulaireinhibition des PARPimagerie sur cellules vivantes
Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes
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