Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’oeil congénitales et des anomalies cranio-faciales reflètent les perturbations dans la crête neurale, une population nomade de cellules souches migratrices qui donnent lieu à nombreux types de cellules dans tout le corps. Comprendre la biologie de la crête neurale a été limité, ce qui reflète un manque de modèles génétiquement tractable pouvant être étudié in vivo et en temps réel. Poisson zèbre est un modèle de développement particulièrement important pour l’étude des populations de cellules migratrices, comme la crête neurale. Afin d’examiner la migration de la crête neurale dans le œil en voie de développement, une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons de grande longueur d’onde de laser a été mis en place pour capturer des vidéos de haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de le œil en développement chez les embryons de poisson-zèbre transgéniques, nommément Tg (sox10:EGFP) et Tg (foxd3:GFP), comme sox10 et foxd3 ont été présentés dans plusieurs modèles animaux de réglementer une différenciation précoce crête neurale et représentent probablement des marqueurs de cellules neurales de crête. Les Time-lapse imagerie multiphotonique servait à discerner le comportement et les habitudes migratoires des deux populations de cellules neurales de crête contribuant au développement d’oeil au début. Ce protocole fournit des informations pour générer des vidéos time-lapse pendant la migration de poisson-zèbre de crête neurale, à titre d’exemple et peut être davantage appliqué pour visualiser le début du développement de nombreuses structures dans le poisson-zèbre et autres organismes modèles.
Introduction
Les maladies oculaires congénitales peuvent causer la cécité chez l’enfant et sont souvent dues à des anomalies de la crête neurale crânienne. Les cellules de la crête neurale sont des cellules souches transitoires qui proviennent du tube neural et forment de nombreux tissus dans tout le corps. 1,2,3,4,5 Les cellules de la crête neurale, dérivées du prosencéphale et du mésencéphale, donnent naissance à l’os et au cartilage des régions médiane du visage et du front, ainsi qu’à l’iris, à la cornée, au réseau ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Le protocole décrit ici a été réalisé conformément aux directives pour le traitement sans cruauté des animaux de laboratoire établies par le Comité de l’Université du Michigan sur l’utilisation et le soin des animaux (UCUCA).
1. Collection d’embryons pour l’imagerie en accéléré
- Entre 15 et 21 heures, installez le poisson zèbre transgénique adulte mâle et femelle Tg (sox10 :EGFP) ou Tg (foxd3 :GFP) dans un bassin d’élevage divisé pour un accouplement par paires.
REMARQUE : Les poissons Tg(sox10 :EGFP) et Tg(foxd3 :GFP), aimables cadeaux de Thomas Schilling et Mary Halloran, respectivemen....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
L’imagerie de fluorescence multi-photons Time-lapse a généré une série de vidéos qui a révélé les patrons de migration des cellules de la crête neurale crânienne qui donnent lieu à des structures cranio-faciales et les segment antérieur de le œil dans le Tg (sox10:EGFP) et Tg (foxd3:GFP) lignes de poisson-zèbre. À titre d’exemple, sox10 -cellules neurales de crête positive entre 12 et 30 hpf migrent du bord du tube neural dans la région cranio-faciale (V.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Les Time-lapse imagerie multiphotonique permet le suivi in vivo des populations de cellules migratrices et transitoire. Cette technique puissante permet d’étudier les processus embryonnaires en temps réel, et dans la présente étude, les résultats de cette méthode a amélioré les connaissances actuelles de la migration des cellules neurales de crête et le développement. Les études d’imagerie Time-lapse antérieures utilisent généralement laser confocal, microscopie à balayage. 29 ,
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Ce travail a été soutenu financièrement par le biais de subventions accordées par le National Eye Institute du National Institutes of Health (K08EY022912-01) et Vision Research Core (P30 EY007003).
Remerciements
Les auteurs remercient Thomas Schilling pour gifting gentiment le poisson Tg (sox10:eGFP) et Mary Halloran pour gentiment gifting le poisson(foxd3:GFP) de Tg.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réservoirs d’élevage avec séparateurs, | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1,0 litre), Polycarbonate transparent avec couvercle et insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems, CMS GmbH | Microscope à stéréofluorescence - FusionOptics et TripleBeam | |
| Sodium | Chloride Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double sac en PE. N° CAS 7647-14-5, n° CE 231-598-3 |
| Chlorure de potassium | Millipore (EMD) | 1049380500 | Chlorure de potassium 99.999 Suprapur. N° CAS 7447-40-7, numéro CE 231-211-8. |
| Chlorure de calcium dihydraté | Fisher Scientific | C79-500 | ; 500 g. N° CAS 10035-04-8 |
| Sulfate de magnésium (anhydre) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Flacon en polyéthylène ; 500 g. N° CAS 7487-88-9, numéro CE 231-298-2 |
| Bleu de méthylène | Millipore (EMD) | 284-12 | Flacon en verre ; 25 g. Poudre, colorant biologique certifié |
| bicarbonate de sodium | millipore (EMD) | SX0320-1 | Flacon en polyéthylène ; 500 g. Poudre, GR ACS. N° CAS 144-55-8, numéro CE 205-633-8 |
| N-Phénylthiourée | Sigma | P7629-25G | >98 %. Numéro CAS 103-85-5, Numéro CE 203-151-2 |
| Diméthylsulfoxyde | Sigma | D8418-500ML | Qualité Biologie moléculaire. Numéro CAS 67-68-5, numéro CE 200-664-3 |
| Méthanesulfonate de tricaïne | Western Chemical Inc. | MS222 | |
| Agarose à faible point de fusion | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Agarose à faible point de fusion, 25 g |
| Chambre de bain ouverte | Warner Instruments | RC-40HP | Couvre-couvercle en verre à profil élevé |
| Fisher Scientific | 12-545-102 | Verre de couverture circulaire. Graisse sous vide poussé de 25 mm de diamètre | |
| Fisher Scientific | 14-635-5C | Tube de 2,0 lb. DOW CORNING CORPORATION 1658832 Plateforme d’échange | |
| rapide | Warner Instruments | QE-1 | |
| Adaptateur de platine | 35 mm Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16,5 x 10 cm |
| Leica Microsystems CMS GmbH | |||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) ; Logiciel | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Logiciel | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Logiciel | Apple |
Références
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
