Article de méthode

Une méthode pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à Transmission

DOI :

10.3791/56235

⸱

17 janvier 2018

 , 
1Medical Mycology Research Center, Chiba University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude présente des procédures fiables et faciles pour obtenir des coupes sériées ultraminces d’un micro-organisme sans matériel coûteux en microscopie électronique à transmission.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Observer les cellules et les composants de la cellule en trois dimensions à fort grossissement en microscopie électronique à transmission nécessite préparation ultraminces sériées du spécimen. Bien que la préparation des coupes sériées ultraminces est considéré comme très difficile, il est assez facile si on utilise la méthode appropriée. Dans cet article, nous montrons une procédure étape par étape pour obtenir en toute sécurité séries ultraminces de micro-organismes. Les points essentiels de cette méthode sont : 1) d’utiliser une partie importante de l’échantillon et ajuster les bords de surface et couteau de spécimen afin qu’ils soient parallèles entre eux ; 2) de la coupe des coupes sériées dans les groupes et éviter des difficultés à séparer les sections à l’aide d’une paire de mèches de cheveux lors de la récupération d’un groupe de coupes sériées sur les grilles de la fente ; 3) à utiliser une « boucle de Section-holding » et éviter de mélanger l’ordre des groupes de section ; 4) à utiliser une « boucle de l’eau de surface-sensibilisation » et s’assurer que les sections sont positionnées sur l’apex de l’eau et qu’ils touchent la grille en premier lieu, afin de les mettre dans la position désirée sur les grilles ; 5) d’utiliser le film support sur un rack en aluminium et rendre plus facile de récupérer les sections sur les grilles et pour éviter les plis du film soutien ; et 6) à utiliser un tube de coloration et d’éviter de casser accidentellement les films de soutien avec des pincettes. Cette nouvelle méthode permet d’obtenir des coupes sériées ultraminces sans difficulté. La méthode permet d’analyser les structures cellulaires des microorganismes à haute résolution en 3D, qui ne peut être atteint en utilisant la méthode d’ultramicrotome collecte ruban automatique et la série îlot ou le faisceau ionique focalisé, microscopie électronique à balayage.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technique de sectionnement ultramince série appropriée est indispensable pour étudier les cellules et les composants de la cellule en trois dimensions à l’échelle microscopique de l’électron. Nous avons étudié la dynamique du corps polaire du fuseau dans le cycle cellulaire des cellules de levure et révèle des changements morphologiques de leur ultrastructure au cours du cycle cellulaire et l’heure de répétition1,2,3, 4,,5. En 2006, nous avons inventé un nouveau mot « structome » en combinant la « structure » et '-ome' et défini comme le « informations structurelles quantitatives et en trois dimensions d’une cellule entière à l’échelle microscopique de l’électron » 6,7.

Par l’analyse structome, qui requiert la technique sérielle de sectionnement ultramince, il a été constaté qu’une cellule de levure de Saccharomyces cerevisiae et Exophiala dermatitidis avait environ 200 000 ribosomes7,8, un Escherichia coli cellule avait 26 000 ribosomes9, une cellule de Mycobacterium tuberculosis a 1 700 ribosomes10 et Myojin spirale bactéries avaient seulement 300 ribosomes11. Cette information est utile pour évaluer non seulement le taux de croissance dans chaque organisme, mais aussi dans l’identification des espèces9.

En outre, structome analyse conduit à la découverte d’un nouvel organisme ; Parakaryon myojinensis a été trouvé dans l’eaux profondes au large des côtes du Japon, dont la structure cellulaire étaient intermédiaires entre ceux des procaryotes et des eucaryotes12,13,14,15. À l’heure actuelle, série technique sectionnement ultramince est considérée comme si difficile qu’il faudrait beaucoup de temps à maîtriser. Dans cette étude, nous avons développé une méthode fiable dans lequel n’importe qui peut effectuer des coupes ultraminces série sans difficulté.

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Protocole

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Remarque : Les spécimens utilisés dans cette étude étaient des microorganismes, congelés rapidement de propane dans l’azote liquide, gel substitués dans l’acétone contenant 2 % le tétroxyde d’osmium et incorporé à l’époxy résine1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.

1. préparation du support film (Figure 1-3)

NOTE : Le film support argenté Formvar est établi à l’aide de la méthode cast sur verre19.

  1. Ajouter 100 mL de 1,5 % Formvar de dichlorure d’éthylène à un appareil de fabrication de Formvar (Figure 1). Tremper la moitié d’une lame de verre (76 x 26 x 1,3 mm) en solution de Formvar dans la colonne supérieure de l’appareil en appuyant sur la solution avec de l’air par le biais de « a » en utilisant un ballon de caoutchouc19.
    1. La solution de la colonne de vidange en ouvrant le robinet à trois voies et libérant air par « b » pour réduire la pression. Retirez la lame de verre de l’appareil et sec dans l’air pour former une pellicule à la surface de la lame de verre. Utiliser une lampe à incandescence pour accélérer le séchage du film Formvar.
  2. Après racler les quatre bords du film sur la lame de verre avec une lame de rasoir (Figure 2 a) et la respiration sur le toboggan pour faciliter la séparation du film de la diapo20, flottent hors du film sur l’eau en plongeant la lame de verre dans le l’eau lentement à un angle horizontal faible (environ 10°, Figure 2 b).
  3. Ramasser le film Formvar de l’eau à l’aide d’une grille en aluminium (30 x 25 x 3 mm) avec des trous (4 mm de diamètre) (Figure 3 a). Empêchent la grille avec le film de Formvar dans un dessicateur jusqu'à utilisation (Figure 3 b).

2. tailler le bloc de spécimen avec une lame de tondeuse par ultrasons et une lame de rasoir 21 sous un stéréomicroscope (Figure 4)

  1. Assurez-vous qu’il y a des cellules à la surface du bloc en observant l’extrémité du bloc avec un microscope optique (Figure 4 a).
  2. Montez le bloc du spécimen dans le mandrin (titulaire de bloc) et monter le mandrin sur une coupe étape21 (Figure 4 b). Cette étape de la coupe dispose d’un mécanisme d’éclairage à l’arrière de l’échantillon.
  3. Couper le bloc à une taille de 0,7 x 1,0 mm (Figures 4 c, 5d). Étant donné que la résine époxy est très dure, tailler les blocs tout d’abord à l’aide d’une lame de tondeuse à ultrasons. Le couteau ultrasonique est une machine nouvellement introduite, et les blocs sont facilement taillés. Couper ensuite le bloc plus loin avec une lame de rasoir. Couper une épaule pour marquer la direction de coupe (voir Figure 5 d, Figure 8).

3. tailler le bloc de spécimen avec couteau diamant utilisant le microtome (Figure 5)

  1. Définir le bloc de spécimen chuck dans le porte-échantillon de l’ultramicrotome. Placer le spécimen 90° vers la gauche contre la position effective quand des coupes ultraminces série est effectuée (voir Figure 5 d).
  2. Couper la surface du bloc avec un couteau de coupe de diamant (voir la Figure 5 d). Mettre la lame de couteau diamant parallèle à la face du bloc spécimen et découper le montant minimum de surface de l’échantillon pour ne pas perdre tout spécimen (Figure 5 d).
    Remarque : Cette étape est faite pour lisser la surface de l’échantillon. La partie de la surface de l’échantillon de la partie mince est laissée intacte (c’est pourquoi cette partie ne brille pas comme un miroir, Figure 5 d), pour ne pas perdre une partie de l’échantillon pour le sectionnement serial. C’est parce que le spécimen est exposé à la surface du bloc.
  3. Placez un miroir (coupe de Mesa, M) sur la scène du couteau pour suivre la Coupe du bloc spécimen (Figure 5C).
  4. Couper le bord gauche (cela devient la face supérieure, Figure 5 d, de l’échantillon en sectionnant série) du bloc à l’aide de couteau de coupe en faisant tourner la scène couteau 30 ° vers la gauche (Figure 5 a).
  5. Couper la face du bloc à environ 100 µm entre le bord gauche de l’échantillon (cela devient la face inférieure de l’échantillon en sectionnant serial, Figure 5 d) en tournant la scène couteau 30 ° vers la droite (Figure 5 b).
    Remarque : Les coupes sériées seront coupés de la partie mince de l’échantillon d’environ 90 nm x taille d’environ 1 mm. La grande partie servira à ajuster la surface de l’échantillon et le bord de couteau, tels qu’ils sont parallèles. Après avoir ajusté la surface de l’échantillon pour être parallèle à la lame de couteau, la grande partie est enlevée avec une lame de rasoir. En coupant les côtés supérieures et inférieures de l’échantillon à l’aide du microtome, les deux côtés de l’échantillon devient lisse et parfaitement parallèles les uns aux autres (Figure 5 d), qui est nécessaire pour obtenir des sections droites et ininterrompue de ruban.

4. réglage du bord de surface et couteau de spécimen afin qu’ils doivent faire face parallèle à l’autre : 21

  1. Retirer le couteau de parage et font tourner le spécimen dans le sens horaire de 90°.
  2. Réglé un couteau coupe ultra-mince au niveau du couteau.
  3. Ajuster la surface de l’échantillon et la lame de couteau pour qu’ils doivent faire face parallèlement les uns aux autres à l’aide d’une partie importante de la surface de l’échantillon.
    Remarque : Une partie importante de l’échantillon est utilisée pour l’ajustement parce que le visage de découpage de sectionnement série est si petit, rendant difficile d’ajuster le bord à l’aide de cette partie seulement, en particulier dans le sens vertical de la surface et couteau spécimen. Ainsi, à l’aide de la grande partie de l’échantillon, réglage facile.

5. matelassage en néoprène sur le bloc de l’échantillon (Figure 6)

  1. Pour placer le mandrin de spécimen à exactement la même position que la position d’origine, appliquer du ruban adhésif sur le mandrin et le détenteur de mandrin du microtome et coupées à la limite (Figure 6 a).
  2. Retirez le spécimen mandrin du microtome et placez-le sous le stéréomicroscope (Figure 6 b). Couper une partie importante de l’échantillon avec une lame de rasoir, laissant la partie mince, d'où proviendra coupes sériées.
  3. À l’aide d’une pipette Pasteur, déposer environ 1 µL 0,5 % de solution de néoprène (Figure 6 b) sur le spécimen à être utilisée pour le sectionnement de série, pour faire l’adhésif de côtés de section. Couvrir le spécimen entier avec solution de néoprène. Absorber la solution néoprène excès immédiatement avec un morceau de papier filtre placé près de l’échantillon. Obtenir un ruban de sections est essentiel pour prendre des photos des sections de la série de cellules, et la colle néoprène est très utile pour coller les sections.
  4. Préparer la fente 3 grilles (tailles des fentes : milieu, 0,4 mm x 2,2 mm, les deux côtés de 0,2 mm x 2,2 mm) (Figure 6C) pour ramasser les coupes sériées par la poignée des grilles de flexion à 60 °, traiter les grilles solution à 0.5 % néoprène et rendant les grilles hydrophile par lueur décharge22.

6. faire des coupes sériées (Figure 7-9)

  1. Place le bloc de spécimen chuck dans le microtome à la même position que le 5.1 (Figure 6 a) en alignant les pièces collées. Ceci maintient la face du bloc et la lame de couteau parfaitement parallèles les uns aux autres. Puis mettre le couteau à proximité de l’échantillon.
  2. Le bateau de couteau remplissez-le d’eau.
  3. Couvrir le microtome avec un couvercle en plastique pour empêcher la circulation de l’air (Figure 7).
    NOTE : Débit d’air pendant les coupes ultraminces et de récupération des articles souvent causer des problèmes. Le couvercle en plastique a trois trous : un trou est pour les lentilles binoculaires, et les deux autres trous sont pour les bras permettre un fonctionnement lorsque le couvercle est en marche. L’accoudoir en bois est utilisée pour placer les bras tout en faisant un travail délicat, tels que des coupes sériées avec grilles de récupération. L’accoudoir en bois est placé sur une table différente de la table microtome (Figure 7, flèches), donc de ne pas transmettre la vibration des mains de l’utilisateur pour le microtome.
  4. Commencer à couper l’échantillon à l’épaisseur de coupe 200 nm (Figure 8). Réglage à 200 épaisseur nm gagnerez du temps en apportant le couteau sur la surface de l’échantillon.
  5. Après la première section est coupée, définissez l’épaisseur de coupe à 70 nm (Figure 8).
  6. Lorsque le nombre de coupes sériées atteint 20 (précisément parlant, après les tronçons de ruban environ 1,8 mm ; le nombre de sections varie en fonction de la largeur des sections), définissez l’épaisseur de coupe à 10 nm (Figure 8) tout en continuant à couper.
    NOTE : Puisque le microtome ne coupes 10 nm d’épaisseur, aucun nouvel article n’apparaît, et les sections précédemment coupées sont séparent de la lame de couteau. Il est important d’obtenir des groupes de sections séparées (Figure 9) pour ramasser les coupes sériées afin d’éviter des difficultés à séparer les sections manuellement à l’aide d’une paire de mèches de cheveux. Étant donné que le champ de vision dans le microscope électronique en transmission est à 2,0 mm, sections doivent être au maximum 1,8 mm de long.
  7. Définir l’épaisseur de coupe à 60 nm (Figure 8). Cela produira 70 sections nm (Figure 8) parce que la machine va ajouter l’épaisseur des nm 10 du précédent.
  8. Définir l’épaisseur de la section retour à 70 nm (Figure 8) et continuer la coupe jusqu'à obtient des sections de 1,8 mm-long.
  9. Répétez de 6,6 à 6,8 jusqu'à obtient des cinq sections de long de 1,8 mm (Figure 9). Nous faisons généralement cinq groupes de sections puisqu’il y a cinq porte-spécimens dans le microscope électronique à transmission disponible dans notre laboratoire, mais cinq n’est pas la limite.

7. ramasser les coupes sériées (Figure 10-12)

  1. Placer la « boucle de la porte-Section »23 (diamètre intérieur de la boucle : 5,0 mm) (Figure 10 a) sur le troisième groupe de sections (Figure 10 b).
    Remarque : Il faut récupérer les sections de l’ordre de leur coupe pour prendre des photos dans l’ordre approprié. Cependant, puisqu’il y a cinq groupes de sections sur le bateau de couteau, il souvent obtient déroutant quels groupes sont qui. En plaçant la boucle sur le troisième groupe, il devient évident que les deux groupes près de l’opérateur sont le premier et deuxième et les deux éloignés de l’opérateur sont les quatrième et cinquième groupes (Figure 10 b). Cela évitera de mélanger vers le haut de l’ordre.
  2. Placer « boucle d’eau de surface-sensibilisation »23 (WSRL, diamètre intérieur de la boucle : 4,0 mm) (Figure 11 a) sur la scène de couteau (Figure 11 b). La WSRL tiendrai fermement sur la scène de couteau parce qu’il est équipé d’un aimant au fond.
    1. Placer la boucle de la WSRL juste au-dessus des coupes sériées en déplaçant son arbre et la poignée. Abaissez la boucle de la WSRL sur la surface de l’eau pour que la boucle entoure les sections.
    2. Poussez la boucle vers le bas en tournant la vis vers le bas afin que la surface de l’eau augmentera de tension superficielle (Figures 11c-d). Déplacer la section vers le centre de la boucle, positionnez-le sur l’apex de l’eau et ajuster la direction de la section en utilisant une mèche de cheveux21.
    3. Ramasser les groupes de sections par le toucher avec une fente nue-grid, qui est tenu par une pince à épiler et reste parallèle à la surface de l’eau (Figure 11d). Il est important pour les sections de toucher la grille tout d’abord, pas l’eau, pour déposer les éléments avec précision sur le centre de la grille (Figure 11d).
  3. Placez les grilles avec des sections ainsi qu’une petite goutte d’eau sur la Formvar support film16 (Figure 12) et enlever l’excès d’eau à l’aide de papier filtre.
    Remarque : Le froissement du support film est souvent un problème lorsque les sections sont captées à l’aide d’une grille avec film support car membrane (sections) touche la membrane (film support) directement. Le problème d’avoir des rides sur le film support est considérablement réduit en plaçant une grille section portant ainsi qu’une petite goutte d’eau sur la Formvar support film16.

8. coloration des sections16,24 (Figure 13)

  1. Après que les sections sont complètement séchées, déchirer le film de Formvar de près les grilles et enlevez les grilles portant les sections.
  2. Définir les grilles dans la gorge de la coloration de tube16 dans l’ordre approprié (Figure 13) et tacher les sections avec uranyle acétate et plomb citrate24.
    Remarque : Il y a une rainure de 0,6 mm de profondeur le long de l’axe longitudinal du tube coupé avec une lame de rasoir. Le tube est utile pour empêcher un bris accidentel des films de prise en charge lorsque vous utilisez la pince à épiler, car la manipulation directe des grilles n’est pas nécessaire pendant le processus de coloration et lavage16.

9. l’observation de coupes sériées (Figure 14)

  1. Définissez les 5 grilles dans le porte-échantillon multiples dans l’ordre approprié (Figure 14 a), orientant l’axe long de la fente de grille perpendiculaire à l’axe de support du spécimen. Les poignées (flèches) des grilles n’ont pas à être coupé, parce que les « grille-fixateurs » ne touchent pas les poignées.
  2. Fixer les grilles avec « grille-fixateurs » (Figure 14 b) et insérez le porte-échantillon dans le microscope électronique à transmission.
    Remarque : Il est souvent utile de prendre des images de faible grossissement de toutes les sections de la cellule (Figure 15) pour trouver intéressant de micro-organismes ou de cellules en bon état sans la contamination et à la bonne fixation, avant de prendre des photos de la cellule cible.
  3. Photographier les cellules cibles dans toutes les sections de la cellule à fort grossissement.

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Résultats

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Dans le présent protocole, les grilles de trois-fente ont été utilisés pour ramasser les coupes sériées. Les grilles sont en nickel ou cuivre. Les coupes sériées sont placés sur la fente centrale. Les fentes des deux côtés sont nécessaires pour afficher les sections en les ramassant avec la grille. Pour garder les grilles en parallèle avec les coupes sériées en les ramassant avec des pincettes (Figure 11d), la poignée est courbée (Figure ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode présentée ici ne nécessite aucun équipement coûteux. Il nécessite seulement un rack en aluminium (Figure 3), trois-fente grilles (Figure 6C), section porte-boucles (Figure 10 a), eau de surface-sensibilisation boucle (Figure 11 a) et un tube de coloration (Figure 13). Il y a plusieurs caractéristiques de la méthode actuelle. La grande partie de l’échantillon est ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions sincèrement Shigeo Kita pour ses précieuses suggestions et discussion. Nous remercions également John et Sumire Eckstein pour leur lecture critique du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Appareil de fabrication FormvarNisshin EM Co. Ltd., Tokyo652W 180 x P 180 x H 300 mm
Lame en verreMatsunami Co. Ltd., Osaka-76x 26 x 1,3 mm
Rack en aluminium avec trous de 4 mmNisshin EM Co. Ltd., Tokyo658W 30 x P 25 x H 3 mm, Reportez-vous à cet article
StereomicroscopeNikon Co. Ltd., Tokyo-SMZ 645
Eclairage LED pour stéréomicroscopeNikon Co. Ltd.,Tokyo-SM-LW 61 Ji
Platine de coupeSunmag Co.Ltd.,Tokyo-Mécanismed’inclinaison équipé, Référez-vous à cet article
Eclairage LED pour platine de coupeSunmag Co.Ltd.,Tokyo-Référez-vousà cet article
Lame de coupe à ultrasonsNisshin EM Co. Ltd., Tokyo5240EM-240, Reportez-vous à ce papier
Couteau diamanté pour la tailleDiatome Co. Ltd.,Suisse-45° ;
Couteau diamanté pour le sectionnement ultraminceDiatome Co. Ltd.,Suisse-45° ;
UltramicrotomeLeica Microsystems,Vienne-UltracutS
Mesa cutLeica Microsystems, Vienna-Mirror
0,5 % néoprène W solutionNisshin EM Co. Ltd., Tokyo605
Grille spéciale en nickel à 3 fentesNisshin EM Co. Ltd., Tokyo2458Reportez-vous à ce document
Grille spéciale en cuivre à 3 fentesNisshin EM Co. Ltd., Tokyo2459Reportez-vous à cet article
Boucle de maintien de sectionNisshin EM Co. Ltd., Tokyo526Reportez-vous à cet article
Boucle d’élévation de la surface de l’eauNisshin EM Co. Ltd., Tokyo527Reportez-vous à cet article
Tube de colorationNisshin EM Co. Ltd., Tokyo463Reportez-vous à cet article
Porte-échantillon multipleJEOL Co. Ltd.,Tokyo-EM-11170
JEM-1400JEOL Co. Ltd.,Tokyo-Microscopeélectronique à transmission

Références

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Mots-clés

Microorganism SpecimenSection Holding LoopWater Surface Raising LoopFormvar Support FilmUltramicrotome TechniqueDiamond Knife TrimmingNeoprene Solution ApplicationGrid Section Retrieval

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