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Article de méthode

Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale

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⸱

DOI :

10.3791/56237

⸱

23 octobre 2017

 , 
1Division of Anatomy, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, 2Department of Microbiology, Oslo University Hospital

Dans cet article

Résumé

Oligodendrocytes myélinisantes favorisent la propagation du potentiel d’action rapide et la survie des neurones. Décrit ici est un protocole pour l’expression des protéines fluorescentes dans organotypique oligodendrocyte spécifique des tranches de cerveau avec l’imagerie Time-lapse ultérieur. En outre, une procédure simple pour la visualisation de la myéline non-colorées est présentée.

Résumé

Les neurones dépendent de l’isolation électrique et le soutien trophique des oligodendrocytes myélinisantes. Malgré l’importance des oligodendrocytes, les outils avancés actuellement utilisés pour étudier les neurones, en partie seulement ont été prises par des chercheurs de l’oligodendrocyte. Cellule spécifique au type de coloration par transduction virale est une approche utile pour étudier la dynamique de l’organite direct. Cet article décrit un protocole pour la visualisation des mitochondries des oligodendrocytes dans des tranches de cerveau organotypique de transduction avec adeno-associated virus (AAV) transportant des gènes mitochondries protéines fluorescentes ciblés sous le contrôle transcriptionnel de le promoteur de la protéine basique de la myéline. Il inclut le protocole pour faire des coupes de cerveau de souris coronale organotypique. Une procédure de Time-lapse imagerie des mitochondries puis suit. Ces méthodes peuvent être transférées vers les autres organites et peuvent être particulièrement utiles pour l’étude des organites dans la gaine de myéline. Enfin, nous décrivons une technique facilement accessible pour la visualisation de la myéline non colorée dans des tranches de vie par microscopie confocale réflectance (CoRe). Noyau a besoin d’aucun équipement supplémentaire et peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live.

Introduction

La substance blanche du cerveau se compose des axones des cellules nerveuses enveloppés dans la myéline, une plasmalemme étendu spécialisé formé par les oligodendrocytes. La myéline est nécessaire pour la propagation du potentiel d’action rapide et fiable et une survie à long terme des axones myélinisés, et une perte de la myéline peut provoquer des dysfonctionnements neurologiques. Malgré leur importance, les propriétés des oligodendrocytes sont moins connues comparées avec les neurones et les astrocytes. Par conséquent, moins d’outils ont été développés pour l’étude des oligodendrocytes.

Vivre l’imagerie des organites cellulaires tels que les mitochondries, le réticulum endoplasmatic (ER) ou différentes structures vésiculaires peuvent être utiles d’étudier les changements dynamiques dans les organites au fil du temps. Traditionnellement, l’imagerie des oligodendrocytes vivant a été réalisée en monocultures1,2. Cependant, oligodendrocytes en monoculture n’affichent pas de myéline compacte et organotypique ou tranches de cerveau aiguë peuvent, par conséquent, être une meilleure option lorsque l'on étudie le mouvement des organites et localisation. Localisation de petits organites et de protéines de la gaine de myéline peut être difficile en raison de la courte distance entre les axones myélinisés et la gaine de myéline environnante. Ainsi, lumière immunostaining microscopiques procédures seul n’ont pas la résolution spatiale d’établir une distinction entre les organites dans la gaine de myéline et ceux dans les axones myélinisés. Cela peut être résolu par transduction virale avec des gènes codant pour des protéines fluorescentes organelle ciblées grâce aux promoteurs spécifiques à un type de cellule. Les avantages sont une expression spécifique des cellules et éparse, qui permet une évaluation précise de la localisation de l’organite et dynamique. Animaux transgéniques permet également d’atteindre telle une ciblées organite spécifique des cellules expression3. Cependant, la production et l’entretien des animaux transgéniques est coûteux et habituellement n’offre pas l’expression rare qui peut être obtenue par des méthodes virales.

La méthode décrite ici utilise la transduction virale des oligodendrocytes avec mitochondrial ciblée des protéines fluorescentes (dsred ou vert fluorescent protéine GFP) conduit par le promoteur de la protéine basique de la myéline (MBP-mito-dsred ou MBP-mito-GFP) pour visualiser mitochondries dans des tranches de cerveau organotypique oligodendrocyte. En outre, l’expression d’une protéine fluorescente dans le cytoplasme (GFP utilisé conjointement avec mito-dsred ou tdtomato utilisé avec mito-GFP) est utilisée pour permettre la visualisation de la morphologie cellulaire, y compris les compartiments cytoplasmiques de la gaine de myéline. Le protocole prévoit la procédure pour faire des coupes de cerveau d’organotypique (une version modifiée du protocole décrit par De Simoni et Yu, 20064,,5). Nous décrivons ensuite la procédure d’imagerie Time-lapse pour étudier le mouvement mitochondriale. Cette procédure utilise un microscope confocal vertical avec un échange continu d’imagerie moyen, une installation qui permet une application facile de drogues ou d’autres modifications moyennes pendant la formation image. La procédure d’imagerie Time-lapse peut être effectuée sur n’importe quel microscope confocal, avec certains équipements supplémentaires pour le maintien des tranches de vie tel que décrit ci-dessous. Le protocole contient également plusieurs conseils pour optimiser l’imagerie et de réduire de phototoxicité.

Enfin, un moyen simple et rapide de visualiser la myéline non-colorées par microscopie confocale réflectance (CoRe) est décrite. Cela peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live. Ces dernières années, plusieurs techniques ont été développées à la myéline image sans aucune coloration requise, mais la plupart d'entre eux nécessite des équipements et l’expertise6,7,8. La procédure décrite ici utilise les propriétés réfléchissantes de la gaine de myéline et est une version simplifiée unique-excitation d’onde de la microscopie confocale facteur de réflexion spectrale (SCoRe, dans lequel plusieurs laser des longueurs d’onde est combinés afin de visualiser la myéline) 9. coRe peut être fait sur n’importe quel microscope confocal disposant d’un laser à 488 nm et un filtre d’émission de 470-500 nm passe-bande ou un filtre accordable d’émission.

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Protocole

les procédures décrites ici ont été approuvés par l’autorité norvégienne de recherche des animaux. Fournisseurs et les numéros de catalogue pour les consommables et autres requis matériel n’existe pas dans la liste du matériel à la fin du document.

1. préparation de tranches organotypique

Remarque : cette recette utilise deux souriceaux à jour après la naissance, 7-9 (7-9), qui donne 24 tranches organotypique divisés sur deux Pétri de six puits. Sauf indication contraire, toutes les procédures doivent être faites dans une hotte stérile et Gants nitril ou latex doivent être utilisés. Devraient servir uniquement cell culture des ingrédients de qualité.

  1. Bouteilles autoclave, outils de dissection (1 gros ciseaux, 1 petit ciseaux, 1 grande spatule plate, 1 petite spatule arrondie et aiguisée et 1 pince, voir matériaux liste pour plus de détails), verre pipettes, pointes de pipette et lingettes de tissu utilisés pour la préparation de tranches.
  2. Est la moitié des pipettes en verre doivent être utilisée avec la grande ouverture, se détachent l’extrémité étroite.
    1. Score avec une pointe à tracer diamant plume (si disponible) autour de la pipette juste au-dessous du point où le verre commence à rétrécir. Placez ensuite l’extrémité pointue de la pipette dans un gant de nitrile ou similaire. Soigneusement se détachent la pointe en pliant la pipette tout en le poussant contre un banc de travail.
    2. Puis émousser l’extrémité cassée en frottant sur un morceau de papier sablé ou fondre légèrement sur un bec Bunsen. Les pipettes brisés sont utilisés pour transférer des tranches de cerveau coupé avec le bout cassé transformé en la poire en caoutchouc et le grand ouvert fin toucher les solution/tranches.
      NOTE : Ceci n’est pas faire sous une hotte stérile et peut être fait plusieurs jours à l’avance.
  3. Préparer Pétri.
    Remarque : Ceci peut être fait le jour avant de le trancher ou au moins 2 heures avant de le trancher.
    1. Membranes de stériliser le polytétrafluoroéthylène (PTFE) (" confettis "). Utiliser deux pinces stériles pour supprimer confetti unique de pièces plastiques bleus environnantes et stériliser en plongeant deux fois dans une boîte de Pétri contenant 96 % d’éthanol (EtOH). Puis poser confetti plat dans une grande boîte de Petri stérile sécher.
      Remarque : Les confettis sont des membranes PTFE hydrophiles similaires aux membranes dans les inserts de culture. L’utilisation de confettis facilite l’imagerie live car seul tranches peuvent être facilement transférées de l’insert à la configuration de microscope en soulevant les confettis avec une pince (voir 4.8. pour plus de détails). Par ailleurs, les tranches de cerveau peuvent être cultivées sans les confettis (dans lequel les tranches seront fixe directement sur la membrane de l’insert de culture). Dans ce cas, l’insertion de la membrane doit être coupée avec un scalpel pour transférer la tranche au bain microscope.
    2. Ajouter 1 mL de milieu de culture (recette en réactifs ' table) dans chaque puits de la six puits Pétri.
    3. Lieu une culture insérer dans chaque puits à l’aide d’une pince stérile. Éviter les bulles d’air entre le foyer et le milieu de culture.
      Remarque : Pour économiser de l’argent et l’environnement, il est possible de réutiliser les inserts de culture. Cela peut être fait par un rinçage complet à le distillée H 2 O (dH 2 O) suivie d’une incubation dans 70 % EtOH pendant au moins 24h avant réutilisation. Lors de la préparation pour la nouvelle culture, sécher les inserts dans une plaque de culture cellulaire sous ultraviolets (UV) pour 15-30 min.
    4. Placer deux confettis (stérilisé et sec) sur chacun des inserts de culture. Placer les confettis vers les bords des inserts pour obtenir un chevauchement minimal.
    5. Mettre les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO 2.
  4. Moyen de dissection froide de bulle (recette en réactifs ' table) avec bioxide gaz (95 % O 2 /5%CO 2). Pour conserver la solution stérile, raccorder le tube de la bouteille de gaz pour un filtre de seringue stérile (0,22 µm taille de pore). Filtre
    1. couple l’autre extrémité de la seringue dans un tube stérile relié à une pipette de verre stériles. Placez la pipette de verre dans la solution, couvrir avec du parafilm et allumez le gaz. Garder le milieu de la dissection sur glace
  5. Préparer la zone de dissection/tranchage.
    NOTE : Idéalement, cette procédure devrait se faire sous une hotte stérile. Si ce n’est pas possible, le vibratome peut rester sur un banc de travail. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser un masque capillaire de net et le visage.
    1. à l’aide d’un grattoir à lame unique, découper un morceau rectangulaire (environ 2 cm x 0,5 cm) du gel d’agarose (recette en réactifs ' table) puis collez ceci sur la scène de vibratome tel que le côté le plus long fait face à la lame vibratome.
    2. Nettoyer toutes les surfaces et les pièces vibratome avec 70 % EtOH et essuyer avec des lingettes tissu autoclavés.
      Remarque : Il est important que toutes les pièces qui seront en contact avec le tissu cérébral soient complètement secs depuis EtOH peut endommager les cellules.
    3. Fixer une lame de rasoir stérile sur le vibratome et contrôler la vibration si le vibratome possède cette fonction.
    4. Place des outils de dissection stérilisés à l’autoclave dans la hotte avec tissu autoclavé lingettes, quatre petites boîtes de Pétri, un scalpel arrondi, 2 pipettes en verre avec poires en caoutchouc, deux pipettes de verre plate (voir PT. 1.1) et super colle (pulvérisée avec EtOH).
    5. Verser moyen de dissection propagés dans le bateau vibratome et dans les quatre petites boîtes de Pétri.
      Remarque : Cette étape ne devrait être faite immédiatement avant la dissection comme moyen à partir de ce moment n’est pas propagé ou gardé sur glace
  6. Cerveaux disséquer et Mont.
    Remarque : Pour obtenir des tranches en bonne santé, cette étape doit être faite rapidement et précisément. Certaine pratique est nécessaire.
    1. Euthanasier l’animal #1 par la dislocation de la neckor conformément aux directives locales et décapiter ensuite avec les gros ciseaux.
    2. Using small, sharp ciseaux, rapidement enlever la peau en faisant une incision sagittale du cou pour le nez et la tirer de côté pour révéler le crâne.
      1. Couper le long de la suture sagittale, suivie d’incisions latérales sur la partie intérieure des os frontaux et la suture lamboid (la frontière entre le cerveau et le cervelet).
      2. Utiliser pince à plier ouvert le crâne de chaque côté. Les nerfs crâniens sont coupés par le cerveau en insérant une spatule arrondie, forte sous la face ventrale du cerveau et doucement passer la spatule latéralement.
    3. Utiliser un grattoir à lame unique pour faire un coronale de coupure rostral au cervelet.
      Remarque : Cette coupe déterminera l’angle auquel les tranches sont coupées. Il convient, donc, de prévoir à un angle de droites.
    4. Retourner le cerveau, le crâne et dans une petite boîte de Pétri contenant le support de dissection.
    5. Répéter les étapes 1.6.1.-1.6.4. pour animal #2 et place ce cerveau dans un deuxième Petri dish.
      NOTE : Les animaux ne sont pas stériles. Réaliser la dissection d’un côté de la hotte et passer ensuite à l’autre, côté propre après avoir enlevé le cerveau du crâne.
    6. Changer de gants.
    7. Attach cerveau vibratome étape : ajouter une fine couche de colle super à l’étape juste devant le gel d’agarose monté. Maintenez le cerveau #1 avec une spatule plate grande avec le fraîchement coupées (caudale) côté touchant la spatule et la face ventrale (et d’être aussi proche que possible de) le gel d’agarose.
      1. Puis placer délicatement le cerveau sur la colle en le poussant hors de la spatule avec un jeu de pinces. Veillez à laisser suffisamment d’espace pour cerveau #2.
        Remarque : Il est important que les cerveaux sont bien attachés à la scène, mais sans colle excessive, car cela peut gêner la coupe.
    8. Immédiatement après le montage du cerveau #1, utilisez la spatule large pour ajouter quelques gouttes de médium de dissection sur le dessus du cerveau. Cela va garder le cerveau humide, durcir la colle et empêchez-le de se coller aux parois des cerveaux.
    9. Répéter les étapes 1.6.7 et 1.6.8. cerveau #2.
    10. Fixer la scène sur le bateau vibratome.
  7. Coupe 230 µm coronale tranches épaisses avec une amplitude de 1 à 1,5 mm, une fréquence de 85 Hz et une vitesse de 0,2 mm/s. tranches frais virés entre environ 1,4 mm rostrale et 2,1 mm de caudale à Bregma.
    1. Tranches frais virés après que chaque tranche a été coupé à l’aide de pipettes de verre plate (PT. 1.1). Transfert en tranches à une boîte de Pétri contenant le milieu de la dissection. Utiliser un scalpel arrondi pour couper les tranches en deux morceaux, divisant les deux hémisphères.
  8. Lorsque toutes les tranches sont coupées, déposer les tranches dans le Pétri.
    1. Sortir de la boîte de Petri (un à la fois) de l’incubateur.
    2. Utiliser les pipettes de verre plate, transvaser avec soin une tranche à chacun du confetti.
      NOTE : Les tranches doivent reposer à plat au milieu des confettis. Cela nécessite des compétences. Toutefois, si certaines tranches ne sont pas parfaits, il est préférable de les laisser qu’afin de passer de temps à essayer de les déplacer, car il est important d’entrer toutes les tranches dans l’incubateur aussi vite que possible.
    3. Utiliser une pipette de verre (bout pointu) pour retirer délicatement les excès du milieu sans toucher la tranche de.
      NOTE : Tranches ne doivent pas être plongés dans un liquide pendant l’incubation. Ainsi, les excès du milieu doit être aspiré telle que les tranches sont exposés à l’air (une fine pellicule de moyen couvre encore les tranches). Tranches de restent immergés dans un liquide seront habituellement malsain ou mourir (4 et nos observations).
    4. Déplacer le plat dans l’incubateur, une fois que tous les confettis ont une tranche.
    5. Répéter les étapes 1.7.8.-1.8.4. plat #2.
  9. Changer le milieu de culture.
    Remarque : Cela devrait être fait le lendemain de tranchage (jour 1 in vitro, DIV1) et ensuite tous les 2-3 jours.
    1. Préchauffer le milieu de culture dans un bain d’eau ou de l’incubateur.
    2. Sous une hotte stérile, utilisez aspiration sous vide ou une pipette ordinaire d’un embout stérile pour aspirer le milieu de culture de chaque puits. Cela se fait doucement basculer le plat (d’environ 30 degrés) et en plaçant l’embout de la pipette au bord de l’insert de culture.
    3. Supprimer environ 800 µL de chaque puits (en laissant juste assez moyen pour garder le fond de l’insert couvert en moyenne). Puis, à l’aide d’une pipette propre, ajoutez 800 µL de milieu préchauffé dans chaque puits. Puis replacez la vaisselle dans l’incubateur de culture cellulaire.

2. Transduction virale

AAVs
  1. achat ou faites avec un plasmide d’intérêt, comme décrit plus haut 10 , 11.
    Remarque : Ce protocole décrit l’utilisation de sérotype AAV 2/8 (AAV 2/8) transportant mitochondrial ciblé dsred ou GFP comme un gène rapporteur sous le contrôle transcriptionnel de la myéline protéine basique promoteur 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred ou AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) pour visualiser les mitochondries de l’oligodendrocyte. AAV 2/8 transportant des GFP ou tdtomato comme gène rapporteur pilotée par le promoteur général de CAG (AAV 2/8 CAG_GFP ou AAV 2/8 CAG_tdtomato) est utilisé pour visualiser le cytoplasme de l’oligodendrocyte. Ainsi, la combinaison d’AAV2/8 MBP_mito_dsred avec CAG_GFP AAV 2/8 donne mitochondries rouges et vert cytoplasme dans les oligodendrocytes, tandis que la combinaison AAV2/8 MBP_mito_GFP et AAV 2/8 CAG_tdtomato donne des mitochondries verts et rouge cytoplasme. Les constructions sont décrites en plus en détail ailleurs 13.
  2. Jour 7 in vitro (DIV7), transduce oligodendrocytes avec les AAVs.
    ATTENTION : Suivre les consignes de sécurité pour travailler avec AAVs. Assurez vous d’avoir la formation adéquate et l’approbation de niveau de sécurité requis. Tous les points suivants devraient être réalisées dans une enceinte de biosécurité de classe II à l’aide de gants et blouse de laboratoire. Ici, application de VAA à la zone du cortex des tranches est décrite, comme il s’agit de la zone qui affiche la meilleure récupération. Milieu de culture
    1. diluer l’AAV dans préchauffé (37 ° C). Les dilutions autour de 2 × 10 9 génome copies/mL (GC/mL) sont recommandées pour obtenir une transduction clairsemée des oligodendrocytes qui permet l’imagerie de cellules individuelles au sein de la tranche. Toutefois, un pilote à l’aide de différents titres devrait faire pour assurer une densité des oligodendrocytes transduits qui est appropriée pour les expériences spécifiques. Si deux AAVs différents sont utilisés, ils doivent être mélangés dans la même solution et ajoutés à la tranche en même temps.
    2. Ajouter environ 1,3 µL dilué AAV pour chaque tranche : Assurez-vous que l’extérieur de l’embout de la pipette est sec. Pipetter : 1,3 l dilué AAV et tenir la pipette au-dessus du cortex, aussi près que possible sans toucher la tranche avec l’embout de la pipette (environ 1 mm).
    3. Pousser ensuite lentement la solution hors de la pipette. Lorsque la solution touche la tranche, placez l’embout de la pipette sur le cortex pour étaler la solution sur la zone du cortex entier.
      Remarque : Cette procédure doit être fait aussi vite que possible pour éviter de les conserver les tranches sur le capot pour plus longtemps que nécessaire. Cela dans un plat en temps et remettre le premier plat dans l’incubateur avant de commencer sur plat #2. Pour obtenir une répartition satisfaisante des AAV sans endommager les tissus nécessite peu de pratique et d’une main ferme.
  3. Si un microscope à fluorescence debout est disponible dans le laboratoire de la cellule, expression de la protéine peut être vérifiée durant le temps dans la culture en plaçant le plat sous le microscope.
    Remarque : Le plat ne doit pas être conservé hors de l’incubateur pendant plus de 2-5 minutes.

3. Time-lapse imagerie

Remarque : l’imagerie peut être effectuée chaque fois que les niveaux d’expression des marqueurs fluorescents sont suffisantes et les tranches apparence saines (généralement DIV11-14).

  1. Veiller à ce que le microscope, la perfusion et le chauffage sont correctement configurés pour que la solution d’imagerie propagée est chauffée et peut entrer et sortir de la baignoire.
    NOTE : Différentes solutions existent pour les chambres de bain. Une version simple est présentée ici.
    1. Fais en - et points de vente de la baignoire par des aiguilles de seringue atténuée (bent à ~ 45°) qui sont attachés aux côtés de la baignoire par blu-amure/fun tack.
    2. Veiller à ce que les tubes va partir d’un flacon de solution d’imagerie continuellement propagé, par l’intermédiaire de la pompe péristaltique, à travers le tube de chauffage de la chaudière, puis à l’aiguille de seringue d’entrée dans le bain.
    3. Connecter un autre tube à la sortie de l’aiguille de seringue. Ce tube passe ensuite par l’intermédiaire de la pompe péristaltique et retour à la bouteille de solution d’imagerie (ou une bouteille pour eaux usées).
  2. Solution d’imagerie de la bulle (recette en réactifs ' table) avec gaz bioxide.
    Remarque : Cela devrait être started au moins 15 minutes avant l’imagerie et continuer tout au long de l’expérience.
  3. Tourner sur la pompe péristaltique et chauffage et exécution de solution dans le bain pour obtenir la température du bain optimale (37 ° c ± 0,5 ° C). Veiller à ce que le capteur thermomètre relié à l’unité de température est immergé dans la solution bain.
  4. Allumez le microscope, la lampe à fluorescence et le laser approprié.
    5. Chemin de
  5. ensemble vers le haut une lumière appropriée pour l’échantillon.
    Remarque : Cela variera selon la sonde et la configuration de microscope. Connaissances générales de l’utilisation du microscope confocal est nécessaire et ne seront pas abordés ici.
  6. Utiliser un objectif à immersion d’eau avec le grossissement approprié et l’ouverture numérique (n.a.). Nous utilisons un objectif plan-apochromat à immersion d’eau 40 x (n.a. 1.0).
  7. Open sténopé pour réaliser une coupe optique d’environ 2 à 2,5 µm pour la vidéo Time-lapse. Cela réduit la présence de mitochondries se déplaçant hors de discussion pendant le Time-lapse.
  8. Transfert organotypique tranche à la baignoire :
    1. Ajouter une goutte de solution d’imagerie ou de milieu de culture à un petit plastique Pétri.
    2. Dans une hotte stérile, utiliser une pince stérile pour transférer une tranche organotypique de la membrane insérer à la baisse. La pince doit toucher seulement les confettis et pas la tranche de.
    3. Mettez le couvercle sur la boîte de Pétri.
    4. Tout de suite mis la boîte de Petri contenant le reste des tranches dans l’incubateur.
    5. Apporter boîte de Pétri contenant tranche le microscope.
    6. Désactiver la pompe péristaltique tout en transférant la tranche à bain de microscope. Tout d’abord, utilisez pince pour soulever des confettis avec la tranche de la boîte de Pétri à au-dessus de la baignoire (les confettis flottera). Puis placez les deux pointes de la pince de chaque côté de la confetti afin qu’ils touchent les confettis sans toucher la tranche et pousser les confettis par le biais de la solution au fond de la baignoire. Centrer les confettis dans le milieu de la salle de bain.
      7. Pinces à usage de placer l’ancre de fixation (harpe) sur le dessus les confettis sans toucher la tranche de
    7. .
      Remarque : Une harpe est une ancre platine en forme de fer à cheval qui est utilisé pour prévenir la tranche du flottant ou à la dérive dans le bain. Pour pointes aiguës, cordes fines courent d’un côté de la harpe à l’autre (ressemblant à une harpe de musique). Pour obtenir des tranches organotypique, la harpe devrait être sans fil et ajuster à la taille de la confettis de telle sorte qu’elle peut pondre sur le dessus les confettis sans toucher la tranche.
    8. Ré-allumer la pompe péristaltique.
  9. Abaisser l’objectif vers le bas pour l’échantillon.
  10. Sélectionnez la cellule et la région à image.
    NOTE : Éviter une exposition excessive des cellules à lumière laser car cela risquerait de toxicité cellulaire (voir les conseils dans les points ci-dessous).
    1. Utiliser les oculaires et la lampe fluorescente pour trouver un oligodendrocyte saine avec l’expression correcte. En règle générale, les oligodendrocytes qui ont une forte surexpression de la protéine fluorescente apparaissent malsaines. Oligodendrocytes malsaines aura des processus avec une apparence de Borel et les mitochondries apparaîtra fragmentés. Dans les oligodendrocytes sains, le soma et les processus apparaissent lisses et les mitochondries ont différentes longueurs (bien que généralement plus court que dans les neurones et les astrocytes 13 , 14 , 15).
    2. Placer la cellule d’intérêt au milieu du champ de vision.
    3. Utilisation du " vivre " fonctionner dans le logiciel (pour microscopes Leica et Zeiss) pour identifier la cellule sur l’écran et choisissez un domaine d’intérêt, par exemple, une partie de la cellule qui contient plusieurs processus primaires ou des gaines de myéline ou un processus unique ou gaine de myéline.
      Remarque : Pour être en mesure de représenter aussi bien des processus/gaines que possible, choisir les zones contenant les processus qui pondent relativement plate sur l’axe x-y.
    4. Zoom sur le champ d’intérêt (en général de produire une image avec une taille de pixel de 0,14 - 0,30 µm).
    5. Aide les " régions " outil, dessinez un rectangle autour de la zone et choisissez l’option numériser uniquement la zone sélectionnée. Balayage de temps et donc l’exposition de laser, est réduite en analysant uniquement la zone sélectionnée.
      NOTE : Les régions rectangulaires horizontale seront analysées plus rapidement que les régions verticales en raison du nombre plus courte des lignes numérisées nécessaires. Si une région de rectangle vertical est analysée, le temps de balayage peut être réduit en faisant tourner le champ de balayage de 90 degrés (à l’aide de l’outil de rotation).
  11. Puissance de laser de réglage et de gain pour obtenir une bonne vue sur les mitochondries.
    Remarque : Utilisez la puissance de laser minimale nécessaire. Si possible, augmentez de gain et non montée en puissance laser. En plus de causer de toxicité cellulaire, laser trop haute puissance va blanchir les objets imagés au fil du temps, ce qui nécessite une nouvelle augmentation de la puissance du laser ou gain lors de la numérisation. La puissance du laser nécessaire et gain dépendra le niveau d’expression et le microscope. Avec un microscope confocal de LSM700, nous utilisons un laser à 555 nm à une puissance de 20-40 µW à image dsred ou tdtomato et un laser à 488 nm sert à 20-30 µW à image GFP (puissance du laser mesuré à l’ouverture arrière de l’objectif). Gain est implanté pour l’imagerie direct, habituellement de l’ordre de 700 à 800 pour GFP et 850-980 pour dsred et tdtomato. Le gain élevé peut causer certains bruit de fond plus, qui est supprimé en augmentant le numérique offset (offset valeurs pondent entre 0 et 15). Dans notre expérience, à l’aide de MBP_mito_GFP donne un meilleur signal-bruit de MBP_mito_dsred.
    12. Vitesse de numérisation de
  12. select.
    NOTE : Minimiser la durée de l’analyse en utilisant une vitesse de numérisation rapide et en traçant une petite région de balayage (voir point 4.10.5 ci-dessous). Il est également possible d’enregistrer les temps de numérisation en effectuant une analyse bidirectionnelle. Cependant, ce n’est pas recommandé à cause de moins bonne qualité d’image.
  13. Jeu de fréquence et durée d’enregistrement Time-lapse, par exemple de capture d’images toutes les 2 secondes pour un total de 20 minutes pour l’imagerie mitochondriale en oligodendrocytes.
    Remarque : La fréquence et la durée doivent être réglés selon la mobilité des objets d’intérêt. Une fréquence plus élevée va exposer l’échantillon à la lumière du laser plus, mais se déplaçant plus rapidement les objets nécessitent également une plus courte durée totale de vidéos time-lapse (p. ex. les mitochondries dans les neurones, qui se déplacent plus fréquemment et à une vitesse beaucoup plus élevée que les mitochondries dans oligodendrocytes, sont généralement imagés par seconde pour un total de 2 minutes 16).
  14. Commencer l’enregistrement Time-lapse.
    Remarque : Les mitochondries peuvent se déplacer hors de discussion et/ou dérive hors de la région de représentation lors de l’enregistrement. Pour minimiser les vibrations et le mouvement, ajuster en - et points de vente de la baignoire et réduire la vitesse de la pompe si nécessaire. Petits changements en bref généralement encore se produire. Ainsi, un monitorage continu de l’écran en imagerie est nécessaire, avec de petits ajustements de la mise au point lors de l’enregistrement.
  15. Capturer une z-pile de la cellule entière pour l’identification future de cellule et imagés processus.
    Remarque : Pour une meilleure résolution, le sténopé devrait être remis à 1 unité aérée pour la pile de z.
  16. Facultatif : visualiser la myéline non-colorées.
    Remarque : Dans les oligodendrocytes transduites avec GFP (cytoplasmique), les gaines de myéline peut habituellement être identifiés comme des lignes droites du cytoplasme (les crêtes cytoplasmiques) reliés à un processus primaire (voir Figure 2 A et B). Toutefois, si l’expression de la GFP est trop faible ou un marqueur cytoplasmique n’est pas utilisé, il est possible de visualiser la gaine de myéline par microscopie confocale réflectance (CoRe) comme expliqué ici.
    1. Mis en place un nouveau chemin de lumière dans le logiciel avec excitation de laser à 488 nm et capture émis la lumière autour de la même longueur d’onde, par exemple 470-500 nm.
    2. Réglage puissance du laser et gagner jusqu'à ce que la myéline est visible (voir exemple dans < forte classe = »xfig "> Figure 3). En utilisant un microscope de LSM 510 Meta, nous utilisons généralement une puissance de laser de 7-12 µW (mesuré à l’ouverture arrière de l’objectif).
  17. En option : préparation de tranches pour immunostaining.
    1. Si la cellule image doit être identifiée après immunomarquage, capturez une image de faible grossissement (10 x) de la cellule et indiquer son emplacement dans l’image en dessinant une flèche ou similaire. Pour faciliter la détection de la cellule, il est recommandé aussi dessiner une carte manuelle de la tranche entière, ce qui indique l’emplacement de la cellule :.
    2. Fix tranche dans 4 % de paraformaldéhyde (PFA) sur agitateur pendant 1 heure à température ambiante.
      ATTENTION : PFA est nocif. Utiliser des vêtements de protection et de n’utiliser que sous une hotte ventilée.
    3. Diluer fixateur 01:10 dans du PBS et laisser à 4 ° C jusqu’au départ d’immunohistochimie dénommés ailleurs 17.
      Remarque : Bien que les tranches peuvent être laissés dans le fixateur dilué pendant plusieurs semaines, fluorescence peut s’estomper. Exécution d’immunohistochimie dans les 10 jours de fixation est recommandé.

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Résultats

Organotypique des tranches de cerveau qui ont été cultivées et transduites tel que décrit ci-dessus montrent une distribution clairsemée des oligodendrocytes corticales exprimant mito_dsred et GFP. Immunohistochimie avec des anticorps contre Olig2 et MBP a confirmé que l’expression spécifique d’oligodendrocytes (Figure 1).

Pour l’imagerie live, oligodendrocytes transduits ont été reconnus par leur m...

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Discussion

Le protocole permettant la culture organotypique décrite ici est une version modifiée de18 du protocole décrit par De Simoni et Yu (2006)5. Les changements les plus importants ont été décrites ci-dessous. Tampon Tris est ajouté au milieu de culture, ce qui améliore la survie des tranches en dehors de l’incubateur au cours de la transduction virale et la modification du milieu cellulaire. La procédure de stérilisation de confettis est également modifiée. Alors que les autres...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Remerciements

Nous remercions Linda Hildegard Bergersen et Magnar Bjørås pour accéder à la cellule de laboratoire et équipement, personnel Janelia biologie moléculaire ressource partagée pour la production de virus et de plasmide et Koen Vervaeke pour assistance avec mesures de puissance de laser. Ce travail a été financé par l’Association norvégienne de la santé, le Conseil norvégien de la recherche et de l’équipement de microscopie a été financée par Norbrain.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Agarose  ;Sigma  ;A9539
BD Microlance 19GBD301500Aiguilles pour l’entrée et la sortie du bain
Gaz biohydroxyde Ampoules de marqueAGA105701
Ampoules pipetteSigma-AldrichZ615927
Bec Bunsen (Brûleur au propane liquide)VWR89038-530
Ensemble de câbles pour contrôleurs de chauffage WarnerInstruments64-0106  ;Régulateur de température - pièce thermomètre
CaCl2Fluka21100
CO2  ;AGA100309CO2 pour incubateur
Verre de protection, carré CorningThermo  ; Fischer Scientific13206778À fixer sous le bain pour l’imagerie en direct. Sceller avec de la colle ou de la gelée de pétrole.
D-(+)-GlucoseSigmaG7021
Pince délicateFinescience11063-07Pour dissection
Diamant scriberpen Ted Pella Inc.54463
Pipettes jetables en verre Pasteur 230 mmVWR612-1702Pipettes en verre
Lame de rasoir en acier inoxydable à double tranchantMicroscopie électronique Sciences#7200Lame de rasoir pour vibratome
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
Cercles de papier filtreSchleicher & Schuell300,220Papier filtre utilisé pour la filtration de PFA
Funtack Loctite1270884Utiliser pour connecter/ajuster la position des entrées et sorties dans la baignoire
Serviette de bain C-Fold 2Katrin344388
Harp, Plat pour chambre RC-41,Warner Instruments  ; 64-1418Harpe pour retenir les confettis dans le bain. Coupez les ficelles avant de les utiliser avec des tranches organotypiques. 1,5 mm, 13 mm, SHD-41/15
HEPES, FW : 260.3SigmaH-7006
Holten LaminAir, modèle 1.2Heto-Holten96004000MHotte à flux laminaire
Sérum de cheval, inactivé thermiquementGibco-Invitrogen26050-088
KClSigmaP9541
Membrane LCR, PTFE,  ;ConfettisMilliporeFHLC0130
Leica VT1200Leica14048142065Vibratome
MEM-Glutamax avec HEPESThermo  ; Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
Micro cuillère Heyman Type BMicroscopie électronique Sciences62411-BPetite spatule arrondie avec extrémité affûtée pour la dissection
Unité de filtration Millex-GP UnitéMilliporeSLGPM33RAUnité de filtration à seringue
Insert de culture cellulaire Millicell, 30 mmMilliporePICM03050Inserts de culture cellulaire
Minipuls 3 vitesses Module de contrôleGILSONF155001Pompe péristaltique pour l’imagerie en direct - Pièce du module de contrôle (connexion à deux têtes cannel)
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka71628
Nunclon DeltaSurface Thermo  ; Fischer Scientific140675Plaque de culture
Nystatin SuspensionSigma-AldrichN1638
Objectif W « Plan-Apochromat » 40x/1.0 DIC  ;Zeiss441452-9900-000  ;Objectif à immersion dans l’eau utilisé pour l’imagerie en direct. (WD=2.5mm), VIS-IR
ParafilmVWR291-1211
Paraformaldéhyde,Microscopie électronique#19208
Chambre de perfusion PC-RSiSkiYou  ; 15280000EBain pour l’imagerie en direct
Pénicilline-Streptomycine, liquideInvitrogen15070-063
Boîte de Pétri 140 mm  ;Heger1075Grande boîte de Pétri
Boîte de Pétri 92x16 mm  ;Sarstedt  ;82.1473Boîte de Pétri moyenne  ;
Pétridure 55x14,2 mmVWR391-0868Petite boîte de Pétri
Saline tamponnée au phosphate (PBS)SigmaP4417Comprimés PBS
R2 Tête à deux canaux  ;GILSONF117800Pompe péristaltique pour l’imagerie en direct - Tête à deux canaux (nécessite module de commande)
Spatules rondes/plates, acier inoxydableVWR82027-528Grande spatule pour la dissection
Papier de verreVWRMMMA63119En option, pour lisser les pipettes en verre brisé
Ciseaux,  ; 17,5 cmFinescience14130-17Grands ciseaux pour la dissection
Ciseaux, 8,5  ;Finescience14084-08Petits ciseaux tranchants pour la dissection
Lame à un seul tranchant, gemmeMicroscopie électronique Sciences#71972Lame de rasoir à un seul tranchant
Chauffage de solution en ligne unique SH-27BWarner Instruments64-0102Régulateur de température - pièce chauffante
Steritop-GP Unité de filtration, 500 ml , 45mmMilliporeSCGPT05REFiltre à stériliser solutions
Super colle de précisionLoctite1577386
Lame de scalpel chirurgical n° 22Swann Morton Ltd.209Lame de scalpel arrondie
Régulateur de température TC324BWarner Instruments64-0100Régulateur de température pour l’imagerie en direct (nécessite un réchauffeur de solution et un ensemble de câble)
Base TrizmaSigma  ;T1503
Trizma HClSigmaT3253
Incubateur à chemise d’eau série IIForma Scientific78653-2882Incubateur
de filtration granulaire Sciences

Références

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