On présente une méthode d’analyse par spectrométrie de masse de peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien (LCR) humain. En utilisant la filtration de limite de poids moléculaire, fractionnement chromatographique de pré, analyse par spectrométrie de masse et une combinaison subséquente des stratégies d’identification de peptide, il était possible d’étendre la peptidome CSF connu presque décuplé par rapport à des études antérieures.
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Article de méthode
Préparation des échantillons pour l’analyse de Endopeptidomic dans le liquide céphalorachidien humaine
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole décrit une méthode mise au point pour identifier les peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien (LCR) humain. Pour ce faire, une méthode déjà élaborée basée sur la filtration de coupure (MWCO) de poids moléculaire et analyse par spectrométrie de masse a été combinée avec une étape de pré fractionnement HPLC hors ligne pH élevé en phase inverse.
Sécrétion dans le CSF est la principale voie d’élimination des molécules répandu par les cellules du système nerveux central. Ainsi, de nombreux processus dans le système nerveux central sont consignées dans le LCR, en rendant un précieux fluide diagnostique. CSF a une composition complexe, contenant des protéines qui couvrent une gamme de concentrations de 8-9 ordres de grandeur. En plus des protéines, des études antérieures ont également démontré la présence d’un grand nombre de peptides endogènes. Tandis que les moins étudiés que les protéines, elles conserveront également susceptibles d’intéresser comme biomarqueurs.
Les peptides endogènes ont été séparés de la teneur en protéines par le biais de filtration MWCO CSF. En supprimant la majorité de la teneur en protéines de l’échantillon, il est possible d’augmenter le volume de l’échantillon étudié et ainsi le montant total des peptides endogènes. La complexité du mélange peptide filtrée a été adressée en incluant une phase inverse étape avant fractionnement (CLHP) à pH alcalin avant l’analyse de LC-MS. Le fractionnement a été combiné avec un schéma simple concaténation où 60 fractions ont été regroupées en 12, consommation de temps d’analyse pourrait ainsi être réduite en évitant encore largement élution Co.
Peptide automatisé identification a été réalisée à l’aide de trois programmes de logiciel d’identification différents peptides/protéines et ensuite combiner les résultats. Les différents programmes sont complémentaires et non comparable avec moins de 15 % des identifications avec chevauchement entre les trois.
Introduction
Biomarqueurs dans le liquide céphalorachidien (LCR) transforment actuellement recherche dans les maladies neurodégénératives. Dans la maladie d’Alzheimer, la maladie neurodégénérative plus commune, affectant plus 60 millions de personnes dans le monde1,2, un triplet de biomarqueurs de la bêta-amyloïde de peptide, stabilisation des microtubules protéine tau et un phosphorylée forme tau, capable de détecter la maladie avec une spécificité et une sensibilité élevée et a été inclus dans les critères de recherche diagnostique3. Dans d’autres maladies neurodégénératives, telles que la maladie....
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Protocole
Le protocole décrit ci-dessous est une version améliorée de celle utilisée dans une étude antérieure où une grande quantité de peptides endogènes ont été identifiés en humain CSF15. Mises à jour de l’original du protocole impliquent des modifications mineures au prétraitement chimique du FSC ainsi qu’optimisation du dégradé utilisé à être fractionné avant RP HPLC pH élevé en mode hors connexion.
Considérations éthiques
Toutes les études du suédois patient et contrôle des matériaux ont été approuvés par les comités d’éthique : Göran St. (Réf. 2005-554-31/3). Échantillons de....
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Résultats
La méthode décrite ici a été appliquée et évaluée dans trois études avant l’instauration du fractionnement de l’échantillon (tableau 1). La première étude utilisé hors connexion LC pour repérer des fractions de CSF sur une plaque de mire MALDI et abouti à 730 peptides endogènes identifié11. Dans les deux études, étiquetage isobare travaillait. Surtout dans une étude cas/témoins étudier simultanément pour l’identification et la caractérisation des biomarqueurs potentiels dans le CSF endopeptidome e.......
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Discussion
L’introduction d’un pH élevé RP HPLC avant fractionnement pas un protocole développé antérieurement pour la récupération de peptides endogènes de poids moléculaire ultrafiltration11 échantillon relative complexité réduite et ainsi autorisé pour un 5 fois plus grand volume de l’échantillon à étudier. Ceci, à son tour, augmente la concentration du sous-ensemble des peptides présents dans chacune des fractions et ainsi amélioré les chances de détecter les faibles peptides abondantes.
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Déclarations de divulgation
Aucun des intérêts concurrents, financières ou autres, entre les auteurs n’ont été signalés.
Remerciements
Un grand Merci Tanveer Batth et ses collègues pour obtenir des conseils à mettre en place la méthode de fractionnement préalable.
Ce travail a été financé par le Conseil de recherche suédois, le Wallström et Sjöblom Foundation, le pistolet et Bertil Stohne Fondation Stiftelse, la Fondation de Bergwall Magnus, la Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut et Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen et FoU-Västra Götalandsregionen.
Les principaux bénéficiaires du financement de ce projet ont été Kaj Blennow, Henrik Zetterberg et Johan Gobom.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ; 1 M Bicarbonate de triéthylammonium | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| ; 8 M Chlorhydrate de guanidinium | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacétamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50 % (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acétonitrile, UV lointain, gradient HPLC grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | N |
| Acide formique | Fluka, Sigma-Aldrich ; | 56302-1mL-F | FA |
| Acide trifluoroacétique | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Solution d’hydroxyde d’ammonium | Sigma-Aldrich ; | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-15 avec membrane Ultracel-30 | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filtre |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold ; | Restek | 26077 | Collecteur à vide |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Séparation d’échantillons en ligne |
| Ultimate 3000 RPLC Separation Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Fractionnement hors ligne à pH élevé |
| Orbitrap Fusion Tribrid spectromètre de masse | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Spectromètre de masse pour l’analyse d’échantillons |
| Proteome Discoverer 2.0 ; | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Plateforme de recherche de protéomique |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | ;- ; | Moteur de recherche en protéomique |
| Sequest HT | Thermo | ;- ; | Moteur de recherche en protéomique |
| PICS v7.5 ; | Bioinformatic Solutions Inc.) | ;- ; | Moteur de recherche en protéomique |
| Acclaim PepMap 100, 75 & micro ; m x 2 cm, C18, 100 Å ; taille des pores, 3 & micro ; m granulométrie | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Colonne de piège (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µ ; m x 500 mm, 100Å ; taille des pores, ; 2 et micro ; m granulométrie | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Colonne de séparation (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac Concentrateurs haute capacité | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum |
| Concentrateur XBridge Peptide BEH C18 Colonne, 130Å ;, 3.5 µ ; m, 2,1 mm x 250 mm | Eau | 186003566 | colonne de séparation (micro HPLC) |
Références
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al.
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Réimpressions et autorisations
