Article de méthode

RVB et l’imagerie spectrale racine pour le phénotypage de l’usine et la recherche en physiologie : montage expérimental et des protocoles d’imagerie

17.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/56251

⸱

8 août 2017

 ,  ,  ,  , 
1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

Dans cet article

Résumé

Un protocole expérimental est présenté pour évaluation des sols cultivés des systèmes racinaires plante avec RVB et imagerie hyperspectrale. Combinaison du temps d’image RVB scanne de série avec les informations de Chimiométrie de hyperspectral optimise les aperçus de la dynamique des racines végétales.

Résumé

Meilleure compréhension des dynamiques de racine de plante est indispensable pour améliorer l’utilisation efficace des ressources des systèmes agricoles et augmenter la résistance des cultivars de contre les stress environnementaux. Un protocole expérimental est présenté pour RVB et imagerie hyperspectrale des systèmes racinaires. L’approche utilise rhizoboxes où les plantes poussent dans les sols naturels au cours de plus de temps pour observer des systèmes racinaires entièrement développées. Les paramètres expérimentaux sont illustrées pour évaluer rhizobox des plantes sous stress hydrique et d’étudier le rôle des racines. Une installation d’imagerie RVB est décrite pour la quantification rapide et bon marchée du développement racinaire au fil du temps. Imagerie hyperspectrale améliore la segmentation de la racine de l’arrière-plan du sol par rapport au Seuillage couleur RVB. La force particulière de l’imagerie hyperspectrale est l’acquisition d’informations chimiométriques sur le système de racine-sol pour compréhension fonctionnelle. Cela est démontré avec cartographie contenu eau de haute résolution. Imagerie spectrale est toutefois plus complexe dans l’acquisition d’images, de traitement et d’analyse par rapport à l’approche de RVB. Une combinaison des deux méthodes peut optimiser une évaluation détaillée du système racinaire. Exemples d’applications intégrant les traits au-dessus du sol et racine sont donnés dans le contexte de la recherche en physiologie végétale phénotypage et plante. Amélioration de l’imagerie de la racine peut être obtenue en optimisant la qualité de l’image RVB avec le meilleur éclairage à l’aide de différentes sources de lumière et par extension des méthodes d’analyse image à déduire sur les propriétés de la zone racine de données spectrales.

Introduction

Racines offrent plusieurs fonctions essentielles pour les plantes telles que le stockage des assimilats, ancrage des plantes terrestres dans le sol et l’absorption et le transport de l’eau et les nutriments1. Du point de vue évolutif, la formation des axes racine est considérée comme une condition préalable fondamentale à l’origine des plantes de terre2. Malgré ce rôle important, historiquement les racines ont occupé seulement une position marginale dans la recherche biologique. Plus ces derniers temps, cependant, il est scientifique un intérêt croissant dans des systèmes de racine de plante comme en témoigne la Figure 1.

figure-introduction-1
Figure 1 : Importance des racines plant sciences.
Nombre de racines des études en pourcentage de toutes les études de plantes publiés dans des revues SCI connexes au cours des dernières décennies. Résultat de Scopus en utilisant les mots-clés « plante » et « des plantes et racines » de recherche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Deux raisons principales peuvent être hypothétiquement sous-tendent les récentes avancées dans la recherche de la racine. Première végétation terrestre est exposée à des stress environnementaux plus fréquents à la suite de changements mondiaux3. Dans le contexte de la production agricole végétale, on estime que dans le monde environ 30 % de la surface agricole sont limitées par l’eau et phosphore4,5. Réduction du stress du rendement des cultures sont des raisons principales pour les écarts de rendement importantes qui sont estimés dans le monde au moins 50 % de la productivité potentielle pour les cultures pluviales agro-écosystèmes6. En plus de la disponibilité des ressources faibles, cela est également liée à l’efficacité d’utilisation de ressources pauvres, c'est-à-dire insuffisante capacité d’une usine d’exploiter les ressources disponibles7. Cela se traduit par des pertes de ressources mobiles tels que le nitrate qui peut affecter négativement les autres écosystèmes. L’efficacité d’utilisation globale d’azote actuel par exemple est estimée à 47 %8. Meilleure ressource efficience grâce à des méthodes de gestion améliorée de l’utilisation et des cultivars est donc d’une grande importance pour les deux une croissance de la production agricole aussi bien en ce qui concerne la durabilité de l’environnement. Dans cette usine de contexte racines sont considérés comme un objectif clé pour l’amélioration des cultures et culture systèmes9,10.

Un deuxième fond important pour l’intérêt récent pour les racines des plantes est une avancée technologique dans les méthodes de mesure. Méthodes de racine ont longtemps été limités par deux grands défis : pour la mesure des racines de plantes qui poussent dans le sol, ils devaient être isolés pour la quantification, pour la plupart en lavant11, ainsi déranger la disposition architecturale des axes de racine. Observation de racine in situ à l’aide d’excavation méthodes, conservant ainsi la situation naturelle des racines dans le sol, ont été utilisés pour la description botanique12. Encore, ils sont très coûteuses en temps et donc ne répondent pas aux exigences de débit d’analyse comparative système structural-fonctionnelle de la racine. D’autre part haut débit des méthodes pour la mesure d’architecture de racine ont été faites principalement sur des milieux artificiels et pour des semis de plantes13 où l’extrapolation à l’environnement naturel de croissance des plantes est discutable14.

Le boom récent de recherche de la racine est intimement lié à l’avance en imagerie méthodes15. Imagerie des approches en études de racine peut être grossièrement regroupé en trois types. Tout d’abord il y a des méthodes 3D haute résolution tels que CT et IRM16. Ces méthodes sont plus aptes à étudier les processus d’interaction des racines avec le sol, tels que la sécheresse provoquée par le xylème embolie17. En général, ils sont appliqués aux échantillons relativement petits où ils permettent des observations détaillées. Une comparaison de CT et MRI pour pots de tailles différente et l’imagerie de radicelles est fournie en18. Deuxièmement, il y a de19,des méthodes d’imagerie haut débit20. Ces méthodes sont pour la plupart sur la base commune 2D RGB imagerie des racines qui poussent sur des milieux artificiels (gel, papier de germination) où contraste élevé permettant une dissection relativement simple entre racines et l’arrière-plan. Elles sont appropriées pour la comparaison à haut débit entre traits racine des plantules de génotypes de cultures différentes en vertu de conditions artificielles normalisés croissant13. Entre ces deux approches sont rhizobox méthodes : ils utilisent l’imagerie 2D des racines qui poussent dans le sol sur longue période et ont un débit moyen de21,22. Un défi récent à l’imagerie de la racine (2D) consiste à capturer également indicateurs de fonctionnalité de racine en plus de la description de la structure23.

Dans le présent document, nous présentons les protocoles expérimentaux d’imagerie rhizobox cultivé le système racinaire à l’aide de (i) une simple et peu coûteuse sur mesure RVB d’imagerie configuration et (ii) une installation d’imagerie de NIR plus complexe. Exemple résultats obtenus de ces deux configurations sont montrés et discutés dans le contexte de phénotypage de plante et de la recherche en physiologie végétale.

Protocole

1. Rhizoboîtes pour la culture de plantes

REMARQUE : Le système expérimental utilise des rhizoboxes pour cultiver des plantes en vue de l'imagerie racinaire. Dans un premier temps, le design des boîtes et le substrat utilisé sont décrits, puis des détails sur la procédure de remplissage sont fournis.

  1. Conception des rhizoboxes
    1. Concevoir des rhizoboxes (Figure 2) avec une plaque arrière et des cadres latéraux en PVC gris d'une épaisseur de 15 mm. Utiliser une dimension de boîte de 300 mm x 1000 mm. Pour la fenêtre frontale, utiliser du verre minéral de 6 mm, fixé au cadre en PVC par des rails métalliques vissés dans les parois latérales.
    2. Pratiquer trois trous dans le cadre inférieur afin de permettre l'évacuation de l'eau excédentaire. Ces trous peuvent être éventuellement fermés par des vis en plastique.
    3. Avant le remplissage, adapter le diamètre intérieur de la rhizoboxe (entre 10 mm et 30 mm) en insérant des feuilles de polycarbonate alvéolé. Un espace intérieur de 10 mm est recommandé pour la plupart des cultures afin de réduire le poids (le poids de la rhizoboxe sans sol est de 13,2 kg) de l'ensemble du système.

Schéma de la structure du mur avec PVC, verre, plaques alvéolées ; conception du drainage ; dimensions indiquées.
Figure 2 : Système expérimental de rhizobox et ses composants.
L'illustration de gauche montre les dimensions d'une rhizobox et celle de droite ses composants individuels, à savoir une plaque arrière en PVC gris avec un cadre latéral, un verre minéral frontal, des plaques alvéolées permettant un diamètre intérieur variable, et des profilés métalliques servant à fixer le verre frontal au compartiment arrière. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

  1. Substrat
    1. Remplir les rhizoboxes avec du sol de champ (pour cette expérience : sol limoneux de surface provenant d'un chernozem calcaire) tamisé à une taille de particule de 2 mm.
    2. Ouvrir les rhizoboxes pour remplir le compartiment intérieur (plaque arrière avec cadres latéraux) en position horizontale, en utilisant un substrat pré-humidifié. Remplir horizontalement afin d'éviter la stratification et la ségrégation entre particules fines et grossières, phénomènes qui se produisent lors d'un remplissage vertical par versement du substrat par l'ouverture supérieure.
    3. Pré-humidifier le substrat avant le remplissage. Selon le type de substrat (notamment sa teneur en limon et en argile), ne pas dépasser une teneur en eau de 0,12-0,18 cm3*cm-3 afin d'éviter l'aplanissage et la dégradation de la structure. Ajouter la différence entre la teneur en eau initiale et la teneur cible après avoir rempli les rhizoboxes.
      NOTE : Le remplissage avec un substrat (séché à l'étuve) sec, suivi de l'ajout de toute l'eau nécessaire, n'est pas recommandé, car cela peut entraîner un tassement important du substrat et la formation de grandes fissures.
  2. Exemple de remplissage étape par étape
    1. Définir la teneur cible en eau. Ici, elle est initialement fixée à 80 % de l'eau disponible pour la plante (PAW), condition dans laquelle les plantes ne subissent aucune pénurie hydrique.
    2. Déterminer la capacité au champ (FC) et le point de flétrissement permanent (PWP) du substrat. Ici, obtenir la FC à l'aide d'un tube en PVC de hauteur équivalente (100 cm) à celle des rhizoboxes.
      1. Fermer le tube à la base avec un bouchon percé de petits trous de drainage, ajouter 1 cm de gravier pour éviter que les trous ne soient obstrués par les particules fines du substrat, puis remplir le substrat à la même densité apparente que celle utilisée pour les rhizoboxes (1,3 g cm-3).
      2. Saturer le tube avec de l'eau jusqu'à l'apparition du drainage, puis le laisser reposer deux jours pour atteindre l'équilibre (la teneur en eau résultante est, par définition, équivalente à la capacité au champ), tout en recouvrant l'ouverture supérieure d'un film plastique afin d'éviter l'évaporation. La valeur de capacité au champ obtenue pour le sol dans cette expérience était de 0,357 cm3 cm-3.
        NOTE : La teneur en eau au PWP doit être connue à l'avance par des méthodes physiques standard du sol (par exemple, mesures par plaque de pression24) ou par des fonctions pédotransfères basées sur la texture25). Ici, elle est égale à 0,12 cm3 cm-3 pour le sol utilisé.
      3. Lors de la mesure de la FC par extraction sous pression, prendre la teneur en eau à un potentiel matriciel de h = -100 hPa et non h = -330 hPa, afin de correspondre à la géométrie des rhizoboxes (hauteur de 100 cm = 100 hPa).
      4. Calculer la teneur en eau (WC) à 80 % PAW : WC (cm3 cm-3) = 0,80 (FC - PWP) + PWP. Pour les limites hydrauliques du sol utilisé ici, cela donne une teneur en eau volumétrique à 80 % PAW de 0,31 cm3 cm-3.
      5. Calculer la quantité d'eau nécessaire pour un volume de rhizobox de 2850 cm3 (30 cm de largeur, 1 cm d'espace intérieur, 95 cm de hauteur, avec les 5 cm supérieurs laissés libres pour l'arrosage). Cela donne un volume d'eau de 883,5 cm3, soit 883,5 g, la densité de l'eau étant de 1,0 g cm-3 à 20 °C.
    3. Définir la densité apparente (db) pour le remplissage des rhizoboxes. Ici, fixée à 1,3 g cm-3, valeur typique des sols agricoles de champ. La quantité de substrat sec nécessaire pour remplir un volume de rhizobox de 2850 cm3 à cette db est de 3705 g de sol sec.
    4. Pré-humidifier le sol sec à une teneur en eau gravimétrique de 0,108 g g-1 (équivalente à une teneur en eau volumétrique de 0,14 cm3 cm-3) en ajoutant 400 g d'eau à 3705 g de sol sec, puis mélanger délicatement pour obtenir une distribution homogène de l'eau. Casser manuellement les agrégats plus gros pour maintenir la taille des particules ≤ 2 mm.
    5. Remplir les rhizoboxes ouvertes avec le sol pré-humidifié et tasser légèrement à l'aide d'une feuille de polystyrène (30 x 10 x 1,5 cm) recouvrant le volume intérieur de la boîte, afin d'obtenir une db homogène de 1,3 g cm-3.
    6. Ajouter la quantité restante d'eau (483,2 g) pour atteindre la teneur cible en eau de 0,31 cm3 cm-3 en pulvérisant la surface avec un flacon pulvérisateur. Veiller à ce que les gouttelettes soient fines afin d'éviter la dégradation de la structure de surface et assurer un mouillage homogène. Maintenir la boîte sur une balance pendant la pulvérisation pour surveiller la quantité d'eau effectivement ajoutée au substrat.
    7. Laisser l'eau se redistribuer pendant 10 minutes, puis apposer la vitre sur la surface et la fixer avec les rails métalliques latéraux. Le poids final moyen des rhizoboxes avec substrat humidifié était de 17818 ± 68 g (13230 g pour la rhizoboxe + 3705 g de sol sec + 883 g d'eau).
      NOTE : La teneur homogène en eau introduite dans les boîtes horizontales va se redistribuer lorsque les boîtes seront placées en position finale, selon le gradient de potentiel résultant. Ce phénomène physique se produit dans tous les pots de croissance végétale en fonction de leur géométrie (hauteur), et les expérimentateurs doivent être conscients de l'hydraulique de leurs contenants26.

2. Installation de la chambre climatique

  1. Équiper la chambre climatique (Figure 3) avec 8 lampes LED fournissant une illumination homogène de 450 μmol m-2 s-1 avec des pics spectraux à 440 (bleu) et 660 (rouge) nm pour une croissance végétale optimale.

Schéma de l'expérience sur le stress végétal : dispositif à LED, station météorologique, conductance stomatique, graphique du déficit de vapeur.
Figure 3 : Chambre climatique avec rhizoboxes pour l'expérience de stress.
(A) Vue gauche de l'ensemble de la chambre avec éclairage LED, station météorologique et ordinateur (utilisé ici pour enregistrer les données des hygromètres foliaires) ; vue droite avec un agrandissement du bâti métallique supportant les rhizoboxes inclinées à 45 ° et des plaques en bois utilisées pour protéger la fenêtre en verre des rhizoboxes de la lumière. (B) Expérience de stress sur la betterave sucrière combinant quatre stades avec un stress dû à une demande atmosphérique différente (élevée/faible) et à une disponibilité en eau du sol variable (élevée/faible). Les barres vertes représentant la conductance stomatique moyenne indiquent la réponse des plantes au stress. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

  1. Régler les paramètres ambiants selon les besoins de la plante ou de l'expérience. Ici, utiliser 14 heures de lumière et 10 heures d'obscurité pour l'illumination. Pendant l'établissement des plantes et avant le début des traitements de stress, régler la température à 20 °C pendant la journée et à 15 °C pendant la nuit, et maintenir l'humidité relative à 50 ± 8 %.
  2. Placer les rhizoboxes en inclinaison à 45 ° à l’aide d’un cadre métallique adéquat. Cela maximise la croissance racinaire vers la surface en verre grâce au gravitropisme.
  3. Couvrir la fenêtre en verre avec une plaque en bois afin de maintenir la zone racinaire à l’obscurité et d’éviter la croissance d’algues due à la pénétration de la lumière à travers la surface vitrée.

3. Configuration et traitements appliqués à l'exemple de la betterave sucrière

  1. Prégermer les graines de betterave à sucre sur du papier filtre humide pendant trois jours à 20 °C dans un incubateur, jusqu'à l'émergence du radicule. Cela garantit la plantation avec des plantes viables.
    NOTE : La prégermination n'est pas nécessaire pour les plantes présentant une vigueur de germination élevée, évitant ainsi le risque d'endommager le radicule lors du semis. Pour les graines de betterave à sucre dotées d'un péricarpe épais, toutefois, le risque de graines non viables est élevé et la prégermination accélère considérablement l'émergence du radicule par rapport au semis direct en sol.
  2. Perforer un petit trou d'environ 1,5 cm de profondeur au centre du rhizobox à l’aide d’un tournevis, placer une graine à l’aide de pincettes en orientant le radicule vers le bas et à proximité de la fenêtre en verre (ceci améliore la visibilité initiale), puis recouvrir délicatement avec du sol.
  3. Ajouter une couche de 0,5 cm de gravier fin (2-4 mm) au-dessus du sol afin de protéger les agrégats contre la dispersion lors de l’irrigation et de réduire les pertes par évaporation. Pour faciliter l’émergence, maintenir la surface du sol exempte de gravier à l’endroit où la graine a été placée.
  4. Ajouter 10 g d’eau pour favoriser l’établissement.
  5. Pendant la phase d’établissement et de croissance initiale, avant le début des traitements expérimentaux de stress, irriguer les rhizobox tous les 2 à 4 jours afin de maintenir la teneur en humidité initiale de 80 % PAW.
    1. Déterminer la quantité d’eau d’irrigation nécessaire en pesant les rhizobox et en ajoutant de l’eau jusqu’à atteindre le poids initial de chaque boîte individuelle. Pour l’irrigation manuelle, utiliser une pipette afin d’éviter la dégradation de la structure superficielle lors de l’arrosage.
  6. Disposer les rhizobox selon le plan expérimental établi dans la chambre climatique. Le protocole décrit ici repose sur une expérience comprenant six cultivars de betterave à sucre répartis en cinq répétitions selon un dispositif complètement aléatoire (CRD).
    1. Repositionner les rhizobox à chaque fois qu’ils sont retirés du support métallique pour la pesée et l’arrosage. Cela permet d’éviter tout effet lié à une inhomogénéité résiduelle (lumineuse) à l’intérieur de la chambre climatique.
  7. Définir le moment de début des traitements de stress et le type de stress. Les paramètres suivants (Figure 4) sont utilisés ici.
    1. Commencer les mesures au stade BBCH 15 (cinq feuilles déployées), lorsque les racines couvrent environ 75 % de la profondeur du rhizobox et que le feuillage est suffisamment développé pour permettre des mesures sur les feuilles. Maintenir chaque stade pendant au moins trois jours afin d’assurer l’adaptation aux nouveaux paramètres avant d’effectuer les mesures.
    2. Pour les observations sans stress, conserver les conditions initiales avec une humidité optimale du sol (80 % PAW) et des conditions ambiantes (20 °C/15 °C, 50 ± 8 % HR), ce qui correspond à un déficit de pression de vapeur (DPV) diurne de 1,28 ± 0,1 kPa (cf. Figure 3 C).
    3. Augmenter la demande atmosphérique jusqu’à un DPV diurne de 2,45 ± 0,4 kPa en élevant la température à 27 °C/20 °C et en réduisant l’HR à 35 %, tout en maintenant l’humidité du sol à 80 % PAW.
    4. Assécher ensuite progressivement les rhizobox jusqu’à 40 % PAW, équivalent à une teneur en eau de 0,215 cm3 cm-3, en supprimant l’irrigation. Rétablir les conditions ambiantes initiales avec une faible demande atmosphérique (DPV de 1,28 kPa).
    5. Combiner les stress en augmentant la demande atmosphérique jusqu’à un DPV de 2,45 kPa et en maintenant l’humidité du sol à 40 % PAW.

4. Méthodes d'imagerie racinaire

  1. Associer différentes méthodes d'imagerie afin de tirer parti de leurs avantages respectifs, en fonction des informations recherchées.
    1. Appliquer l'imagerie RVB dans le domaine du visible (VIS) pour suivre la croissance, l'architecture et la morphologie des racines au fil du temps, ce qui implique implicitement des mesures fréquentes. Les avantages de l'imagerie RVB sont : (i) un faible coût, (ii) une acquisition rapide des images, (iii) des besoins limités en espace disque (taille de l'image : 48 Mo) et (iv) une haute résolution (3648 x 5472 pixels).
    2. Utiliser l'imagerie hyperspectrale (HSI) dans le domaine du proche infrarouge (NIR) lorsque des caractéristiques chimiométriques des racines et du sol sont requises. Les avantages sont : (i) des caractéristiques spectrales permettant la segmentation entre racines et fond du sol, et (ii) un accès aux propriétés physico-chimiques du système (par exemple, teneur en eau du sol, âge des racines). Les inconvénients sont : (i) un temps de numérisation plus long (environ 16 minutes par rhizobox), (ii) une taille importante des jeux de données (13,7 Go par image de rhizobox), (iii) une résolution plus faible de la caméra NIR (320 x 256 pixels) et (iv) une complexité accrue de l'analyse des données.
  2. Imagerie RVB des racines
    1. Utiliser une boîte d'imagerie (Figure 4) qui protège de la lumière ambiante et fixe la position de la caméra, composée d'un cadre métallique de 1 m de largeur et 1 m de hauteur, avec des parois latérales recouvertes de panneaux de fibres. À l'avant, fixer la caméra à deux positions situées à 80 cm du rhizobox.
      1. Fixer une bande graduée sur le cadre du rhizobox à l'aide de ruban adhésif transparent, puis positionner le rhizobox dans le support de la boîte d'imagerie.
      2. Éclairer le rhizobox à l'aide de quatre tubes fluorescents de 24 W placés à 80 cm du rhizobox. Monter également quatre tubes UV de 15 W à 20 cm du rhizobox comme éclairage alternatif, exploitant la fluorescence naturelle des racines en cas de faible contraste entre celles-ci et le fond du substrat (de couleur claire).
      3. Prendre deux images (position haute et basse) afin de couvrir la moitié supérieure et inférieure d'un rhizobox, avec un recouvrement d'environ 3 cm.
    2. Acquérir les images RVB à l’aide d’un appareil photo numérique reflex à objectif unique fixé par des plaques de démontage rapide aux positions respectives de la boîte d’imagerie.
      1. Appliquer les réglages suivants lors de l’utilisation des tubes fluorescents. Adapter ces réglages exemples en cas de modification des dimensions, de l’éclairage ou du modèle de caméra.
        1. Désactiver la mise au point automatique et le stabilisateur sur l’objectif de la caméra. Mettre la caméra en mode manuel.
        2. Régler la sensibilité ISO à 500. Régler le temps d’exposition à 13. Régler l’ouverture à 5,6.
        3. Désactiver le verrouillage du miroir. Régler la balance des blancs sur « Balance des blancs automatique ».
      2. Utiliser les réglages suivants pour l’éclairage avec les tubes UV :
        1. Désactiver la mise au point automatique et le stabilisateur sur l’objectif de la caméra. Mettre la caméra en mode manuel.
        2. Régler la sensibilité ISO à 1000. Régler le temps d’exposition à 13. Régler l’ouverture à 5,6.
        3. Désactiver le verrouillage du miroir. Régler la balance des blancs sur « Fluorescence ».
    3. Assembler les images RVB prises en position haute et basse du rhizobox en une seule image à l’aide d’un logiciel de retouche photo (par exemple, Adobe Photoshop). Utiliser la bande graduée située sur le cadre latéral des rhizoboxs et vérifier les objets de recouvrement (racines et éléments du sol).
      1. Copier les deux images séparées, chacune de taille 3648 x 5472 pixels, dans un nouveau fichier de taille 3648 x 10944 pixels et au fond blanc.
      2. Réduire l’opacité de la couche d’une image à 60 % et aligner les parties superposées des images (bande graduée, objets). Restaurer ensuite l’opacité de la couche à 100 %.
      3. Ajouter, à l’aide de la règle figurant sur l’image, deux lignes rouges de 1 cm exactement en haut de l’image, dans une zone dépourvue de racines. Ces lignes serviront ultérieurement lors de l’analyse d’image à calibrer correctement les dimensions de longueur.
      4. Fusionner toutes les couches et supprimer les parties de l’image situées en dehors de la fenêtre remplie de sol à l’aide de l’outil de recadrage.
      5. Enregistrer l’image au format tiff pour une analyse ultérieure.
      6. Dans le cas d’images prises sous éclairage UV, réduire les couleurs en niveaux de gris avant l’enregistrement, en utilisant la barre d’outils Ajustements-Noir & Blanc, puis en sélectionnant le filtre prédéfini Haute contraste bleu.
    4. Pour la segmentation entre racines et fond du sol, ainsi que pour la quantification des traits racinaires d’intérêt (par exemple, longueur, surface, diamètre, ramification), utiliser un logiciel d’analyse racinaire (voir www.plant-image-analysis.org pour les outils disponibles). Ici, WinRhizo est utilisé.
      1. Ouvrir l’image tiff du rhizobox dans le logiciel.
      2. Étalonner l’échelle de longueur de l’image à l’aide des barres de calibration ajoutées à l’image.
      3. Sélectionner Basé sur la couleur dans le menu Analyse, puis choisir Distinction racine et fond.
      4. Définir un fichier d’étalonnage avec des classes de couleur correspondant aux racines et au sol (fond). Pour les images exemples utilisées ici (cf. Figure 8), trois classes de couleur pour les racines (latérales anciennes, latérales jeunes, racine pivot) et trois classes de couleur pour le sol sont définies.
      5. Pour les images en niveaux de gris (éclairage UV), sélectionner (i) Basé sur les niveaux de gris, et (ii) Racine pâle sur fond noir dans le menu Distinction racine et fond, puis utiliser un seuil d’intensité Lagarde local pour la segmentation.
      6. Ouvrir un fichier de données où les résultats seront enregistrés.
      7. Lancer l’analyse, puis vérifier s’il existe des zones mal classées (par exemple, aux bords). Dans ce cas, définir une zone d’exclusion et relancer l’analyse. Pour les racines non classées, ajouter des classes de couleur supplémentaires et relancer l’analyse. Pour les éléments incorrectement classés comme racines, activer ou renforcer les options de filtrage Débris et bords rugueux.

Installation d'acquisition d'images de plantes avec lampes UV et halogènes ; support de rhizobox, montures pour caméras destinées à l'analyse des racines et du feuillage.
Figure 4 : Boîte d'acquisition d'images pour photographier les rhizoboxes en couleurs RVB.
Vue gauche du côté avant où les rhizoboxes sont fixées pour l'acquisition d'images avec des sources lumineuses à l'intérieur ; vue droite du côté arrière où la caméra est montée. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

  1. Imagerie hyperspectrale des racines
    1. Configuration du matériel
      1. Utiliser un système d'imagerie hyperspectrale des racines (Figure 5) composé de (i) une caméra monochrome NIR refroidie thermoélectriquement, de 14 bits, avec une plage spectrale allant de 900 nm à 1700 nm, de 320 par 256 pixels et d'une fréquence d'images de 100 Hz, et (ii) un spectrographe d'imagerie avec une plage spectrale de 900 nm à 2500 nm et une résolution spectrale de 3,6 nm. Disposer une source d'éclairage linéaire à halogène (quatre spots halogènes de 50 W) en géométrie 45°/-45°. Monter le capteur d'imagerie sur un système de positionnement à deux axes. La fenêtre de balayage mesure 240 x 1000 mm, c'est-à-dire que 30 mm de chaque bord du rhizobox ne sont pas couverts par l'image.
      2. Commander le système à l'aide d'un script Matlab pour (i) l'acquisition des standards blanc et noir, (ii) le réglage du temps d'intégration de la caméra, (iii) la sélection de la résolution spatiale (taille du pixel 0,1 mm ; taille du pixel 1,0 mm) et spectrale (toutes les 222 bandes spectrales avec une résolution de 3,6 nm ; spectre lissé avec 54 bandes et une résolution de 14,8 nm), et (iv) la définition de la zone de balayage sur le rhizobox.
      3. Enregistrer les images au format SIF. Pour éviter des problèmes lors de l'enregistrement de fichiers volumineux, subdiviser chaque pas de balayage (9 pas par rhizobox) en quatre segments (trois de 300 mm de longueur, un de 100 mm de longueur) et les enregistrer séparément avec un nom de fichier unique composé du numéro du pas (1 à 9) et de la partie (1 à 4), ainsi que de la date et de l'heure (AAAA.MM.JJ HH:MM:SS). Un balayage complet d'un rhizobox nécessite un espace disque dur de 13,7 Go.
    2. Acquisition et analyse des images.
      NOTE : Figure 6 illustre les étapes d'acquisition, de segmentation et d'analyse des images.
      1. L'acquisition d'images comprend la sélection des paramètres de la caméra pour une qualité d'image optimale et la définition des paramètres de balayage.
        1. Déterminer les temps d'intégration de la caméra pour le balayage du rhizobox et le standard blanc dans le logiciel de la caméra.
          1. Ouvrir l'interface graphique d'imagerie et déplacer la caméra à une position du rhizobox où des racines sont présentes.
          2. Régler le temps d'intégration de la caméra en ciblant un objet clair (c'est-à-dire une racine) de manière à utiliser environ 85 % de la plage dynamique totale de la caméra sur l'histogramme affiché par le logiciel. Répéter cette opération pour le standard blanc en déplaçant le système de positionnement de la caméra pour viser le standard blanc. Fermer ensuite le logiciel de la caméra.
        2. Ouvrir l'interface graphique d'imagerie Matlab et effectuer tous les réglages pour le balayage actuel du rhizobox. Pour les données rapportées ici, utiliser les réglages suivants :
          Temps d'intégration standard blanc : 1000
          Temps d'intégration rhizobox : 4000
          Résolution spectrale : Résolution complète (c'est-à-dire 222 bandes spectrales à courte portée)
          Résolution spatiale complète (taille du pixel de 0,1 mm)
          1. Acquérir les standards noir et blanc avant chaque session d'imagerie, par exemple une fois par jour. Le standard noir représente le bruit de la caméra, tandis que le standard blanc fournit la réflectivité maximale. Ces données sont nécessaires pour la normalisation des images lors du prétraitement.
          2. Définir si l'intégralité du rhizobox ou seulement une partie est balayée. Dans le cas présent, des rhizobox entiers sont imagés. Démarrer ensuite le balayage.
      2. Traiter l'image à l'aide d'un script Matlab. Les opérations effectuées par le script sont décrites.
        NOTE : Les scripts sont actuellement dans une version non documentée et peuvent être obtenus auprès de l'auteur correspondant. Après une documentation appropriée, ils seront disponibles au téléchargement sur le site web de l'institution de l'auteur correspondant (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
        1. Assembler un pas d'image complet à partir du centre du rhizobox (contenant des racines) en fusionnant les quatre parties du pas.
          NOTE : À ce stade, il n'est ni nécessaire ni recommandé d'utiliser une image spectrale d'un rhizobox entier (c'est-à-dire les 9 pas) car la taille du fichier rendrait chaque étape de calcul dans Matlab très longue. L'information contenue dans un seul pas central suffit pour les premières étapes de l'analyse d'image.
        2. Normaliser l'image à l'aide des standards noir et blanc acquis, en tenant compte des différents temps d'intégration des balayages du standard blanc et du rhizobox, qui sont enregistrés automatiquement lors du balayage dans un fichier.
        3. Appliquer éventuellement un filtre de lissage pour supprimer le bruit de l'image. Le script propose actuellement un filtrage médian à noyau 3x3 et une correction multiple de la diffusion. Pour l'évaluation d'image présentée ici, aucun filtre n'est appliqué.
        4. Afficher l'image à toutes les bandes spectrales enregistrées pour obtenir un premier aperçu et choisir une longueur d'onde permettant de sélectionner des régions d'intérêt (cf. segmentation d'image).
      3. Effectuer la segmentation entre les racines et le fond du sol à l'aide d'un script distinct selon les étapes suivantes.
        1. Sélectionner des régions d'intérêt (ROI) pour les racines et le sol afin d'identifier des caractéristiques spectrales pour la segmentation. Utiliser l'outil de sélection libre pour marquer une ROI sur l'image affichée à une longueur d'onde précédemment identifiée comme offrant un bon contraste entre racines et sol. Ici, utiliser trois ROI sur la racine (latérales anciennes et jeunes, racine principale) et deux ROI dans le sol (zone sèche, zone humide).
        2. Afficher un rectangle avec les ROI sélectionnées et le reste comme masque noir, puis visualiser l'image des ROI sélectionnées à toutes les longueurs d'onde.
        3. Supprimer toutes les lignes de la matrice d'image contenant des pixels d'intensité spectrale = 0 (pixels noirs).
        4. Fusionner les ROI racine et sol en une matrice unique de premier plan (racine) et une matrice unique d'arrière-plan (sol) pour la segmentation.
        5. Rechercher des bandes spectrales (intensité de spectres individuels ou rapports spectraux) offrant la meilleure séparation entre le premier plan racine et l'arrière-plan sol27. Quantifier la distinction entre les histogrammes de pixels résultants pour la racine et le sol à l'aide de la distance de Bhattacharyya28.
        6. Sélectionner une valeur seuil d'intensité séparant les histogrammes.
        7. Créer une image binaire en appliquant le seuil sélectionné à l'image originale. Cela fixe à zéro tous les pixels dont l'intensité est inférieure au seuil et à un ceux dont l'intensité est supérieure (effectué automatiquement par le script).
        8. Enregistrer l'image binaire au format tiff.
      4. Ouvrir l'image binaire et analyser les caractéristiques racinaires. Sélectionner (i) Sur la base des niveaux de gris et (ii) Racine pâle sur fond noir dans le menu Distinction racine et arrière-plan et utiliser le seuil d'intensité global (l'image est déjà binarisée).
      5. Pour cartographier la teneur en eau à partir des données hyperspectrales, acquérir un jeu de données de calibration et appliquer une équation de calibration à une image de rhizobox.
        1. Diviser un rhizobox en compartiments de 5 cm à l'aide de feuilles de polystyrène pour les remplir avec du sol (même substrat et db que celui utilisé pour l'expérience) à différentes teneurs en eau (Figure 8).
        2. Calculer les quantités respectives d'eau à mélanger avec le sol et remplir les compartiments (même procédure que décrite en 1.3. pour le rhizobox entier).
        3. Balayer le rhizobox de calibration avec les mêmes réglages que ceux utilisés pour les rhizobox plantés.
        4. Effectuer les étapes suivantes à l'aide d'un script.
          1. Fusionner les quatre parties d'un pas de la boîte de calibration en eau en un seul pas et le normaliser avec les standards noir et blanc.
          2. Sélectionner des boîtes rectangulaires dans chaque compartiment à teneur en eau différente et les enregistrer dans un tableau de structure.
          3. Déterminer la caractéristique spectrale qui sépare le mieux les compartiments de teneur en eau. Cela est réalisé à l'aide d'un algorithme de recherche du maximum global des différences d'intensité entre les spectres moyens de teneurs en eau adjacentes.
          4. Calculer la valeur moyenne d'intensité spectrale pour cette caractéristique pour chaque compartiment de teneur en eau du rhizobox de calibration.
          5. Ajuster une équation de régression à partir de la teneur en eau mesurée directement et du quantificateur spectral respectif.
          6. Appliquer l'équation de régression à chaque pixel non classé comme racine sur une image de rhizobox et pour la caractéristique spectrale (bande) déterminée ci-dessus, qui est la plus corrélée à la teneur en eau.

Disposition du spectrographe pour l'analyse optique ; illumination halogène, rhizobox, unité de contrôle d'alimentation et de mouvement.
Figure 5 : Scanner racinaire hyperspectral.
Les composants principaux du scanner sont indiqués. L'insert montre la caméra pendant l'acquisition d'une image d'une rhizobox. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Schéma d'analyse d'imagerie hyperspectrale : configuration d'acquisition, segmentation, cartographie de l'eau, analyse chimiométrique.
Figure 6 : Étapes de l'imagerie racinaire hyperspectrale.
L'imagerie racinaire hyperspectrale comprend trois étapes principales : (i) l'acquisition d'images, (ii) la segmentation d'images et (iii) l'analyse des données spectrales. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Expérience de germination de graines ; gradients d'humidité sur du polystyrène et du papier de germination.
Figure 7 : Rhizobox pour l'étalonnage en eau.
Le rhizobox contient des compartiments avec un substrat à différentes teneurs en eau, subdivisés par des feuilles de polystyrène. Un papier de germination placé dans les compartiments secs empêche les particules de sol de s'écouler vers les compartiments voisins. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

5. Exemples d'application

REMARQUE : Les données quantitatives sur les racines sont utilisées dans le cadre du phénotypage végétal (comparaison de cultivars) et de la recherche en physiologie végétale. Les données aériennes suivantes sont rapportées afin d'illustrer ces cas.

  1. Surface foliaire : Mesurer la surface foliaire de manière non destructive aux stades choisis au cours de l'expérience, en utilisant la longueur et la largeur des feuilles comme proxy. Alternativement, des images de la canopée peuvent être utilisées29.
    1. À la fin de l'expérience, mesurer la longueur et la largeur des feuilles ainsi que la surface des feuilles prélevées à l’aide d’un mesureur de surface foliaire. Calibrer la méthode non destructive en appliquant une équation de régression aux paires de données.
  2. Matière sèche : À la fin de l'expérience, mesurer la matière sèche aérienne en coupant les plantes avec des ciseaux, puis en les séchant pendant 24 heures à 105 °C dans une étuve.
  3. Conductance stomatique : Mesurer la conductance stomatique à l’aide d’un poromètre foliaire. Avant la mesure, laisser l’appareil au moins une heure dans la chambre climatique afin que les capteurs s’équilibrent avec les conditions ambiantes, et étalonner l’appareil à chaque changement des conditions ambiantes dans la chambre climatique. Effectuer les mesures sur au moins trois feuilles par plante.

Résultats

Des résultats d'exemple sont présentés pour la segmentation des racines basée sur l'imagerie RVB et HS. Pour l'imagerie spectrale, un exemple de cartographie de l'eau à haute résolution est fourni. Enfin, des résultats sont montrés afin de démontrer le contexte scientifique dans lequel les données racinaires issues de l'imagerie sont appliquées.

Mesure racinaire basée sur RGB

Figure 8 montre une série temporelle d'images racinaires RVB du cultivar de betterave sucrière Ferrara. Les images révèlent certains artefacts dus à une illumination hétérogène des rhizoboxes, avec des zones plus lumineuses le long du côté gauche et des différences de luminosité dans la zone de recouvrement entre les images supérieures et inférieures.

Étude de la croissance des racines en RVB, betterave sucrière 'Ferrara', jours 20 à 35, analyse en accéléré, diagramme de croissance.
Figure 8 : Série chronologique de la croissance racinaire issue de l'imagerie RVB.
Les images montrent le cultivar de betterave sucrière Ferrara à différents jours après le semis (JAS). On observe certains artefacts dus à un éclairage non homogène du côté gauche de l'image ainsi qu'entre les images du haut et du bas. Les échelles correspondent à 2 cm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 9 fournit des détails sur la segmentation des racines basée sur le seuil de couleur pour le cultivar Ferrara au 35e jour après semis (JAS). À titre de référence (Figure 9A), une image binaire est utilisée où toutes les racines ont été suivies manuellement à l’aide d’une tablette graphique. Le temps nécessaire pour le suivi manuel de l’ensemble du système racinaire dense de betterave sucrière, complètement développé, était d’environ quatre heures. Figure 9B donne une vue détaillée d'une zone sélectionnée en haut de l'image où sont présentes d'anciennes racines latérales. Ici, plusieurs axes racinaires ne sont pas classifiés par le seuil de couleur. En bas (Figure 9C) au contraire, lorsque les jeunes racines blanches sont prédominantes, la segmentation fondée sur la couleur classe correctement tous les axes racinaires. Le système racinaire binarisé (Figure 9D) montre une zone noire sur le côté gauche due à un artefact d'illumination, définie comme région d'exclusion avant l'analyse quantitative. Figure 9E montre les histogrammes de pixels correspondants des caractéristiques sélectionnées (racines vs. sol) pour le canal rouge de l'image RVB de Ferrare à 35 JDS. Les pixels racinaires (en bleu) présentent clairement trois pics correspondant aux jeunes latérales claires, aux anciennes latérales foncées et à la racine pivot. Le recouvrement entre les anciennes latérales et le fond du sol est très important, conduisant à des axes racinaires non classifiéscf. Figure 9B).

Schéma de segmentation des racines basé sur la couleur RVB avec analyse histogrammique des types de racines et différenciation du sol.
Figure 9 : Segmentation des racines à l'aide d'un seuil de couleur.
(A) Système racinaire segmenté manuellement à l’aide d’une tablette graphique, (B) zone présentant une mauvaise segmentation des axes racinaires anciens en haut de l’image et (C) axes jeunes correctement segmentés en bas de l’image, et (D) image binaire obtenue par seuillage basé sur la couleur. (E) Histogrammes des pixels pour les caractéristiques sélectionnées de l’image RVB. Les racines sont représentées par les barres bleues, avec différents types de racines indiqués ; le sol est représenté par les barres rouges. Les barres d’échelle dans A et D, 2 cm ; les barres d’échelle dans B et C, 1 cm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

La longueur totale des racines visibles obtenue pour l'image de référence segmentée manuellement est de 1534,1 cm, tandis que la segmentation automatisée basée sur la couleur donne une longueur totale des racines de 1427,6 cm.

Les images en niveaux de gris provenant de l'illumination UV n'offrent pas d'avantage dans le cas présenté ici et se sont révélées moins performantes par rapport au seuillage en couleur (longueur des racines : 1679,7 cm). Les vieilles racines n'ont pas pu être segmentées, et l'image comportait davantage de bruit, probablement en raison de l'intensité lumineuse plus faible des lampes UV. Toutefois, dans le cas de jeunes racines présentant une forte auto-fluorescence et un substrat d'arrière-plan lumineux, l'illumination UV peut néanmoins constituer une option, comme le montre une image obtenue lors d'une autre expérience utilisant du sable comme substrat d'arrière-plan (Figure 10).

Microscopie en fluorescence ; structure racinaire ; à gauche : image confocale aux tons bleus, à droite : image en champ clair.
Figure 10 : Éclairage UV pour visualiser les racines sur un fond clair.
Exemple d'un système racinaire de blé dur en cours de croissance dans une rhizoboîte remplie de sable de quartz. La rhizoboîte est imagée avec un éclairage en lumière (A) UV et (B) fluorescente (lumière du jour). Les barres d'échelle représentent 2 cm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Mesures racinaires basées sur l'HSI

Figure 11 présente les spectres moyens pour trois régions d'intérêt racinaires (latérale ancienne et jeune, racine pivotante) et deux régions d'intérêt du sol (partie supérieure et inférieure du rhizobox).

Graphique d'analyse spectrale des racines, réflectance normalisée en fonction de la longueur d'onde, comparaisons entre sol et racines.
Figure 11 : Spectres moyens des racines et du sol.
Spectres provenant de régions d'intérêt (ROIs) sur les racines (trois types de racines) et dans le sol (partie supérieure et inférieure de la rhizoboîte). Les ROIs sont sélectionnées afin de déterminer un critère optimal de segmentation entre racine et sol. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Il est évident que les racines pivotantes et latérales jeunes diffèrent sensiblement du fond par l'intensité de la plupart des bandes spectrales. Pour les latérales anciennes, les différences d'intensité sont beaucoup plus faibles. Une caractéristique pouvant être déduite visuellement est la pente différente du spectre autour de la région d'absorption de l'eau (1450 nm). Ici, la pente des spectres racinaires est plus élevée par rapport aux spectres du sol. De plus, on peut identifier une modification des spectres de la racine pivotante et des latérales jeunes dans la région autour de 1100 nm, qui ne se produit pas chez les latérales anciennes.

Figure 12A montre le résultat de l'algorithme de recherche identifiant un rapport spectral présentant le meilleur contraste entre premier plan et arrière-plan. Le rapport des spectres à 1476 nm et 1076 nm assure la meilleure séparation entre les racines et le sol. L'histogramme résultant des pixels correspondant aux racines (premier plan) et au sol (arrière-plan) est présenté dans Figure 12B. Bien qu'il existe un certain recouvrement, la majorité des pixels sont clairement distincts du fond correspondant au sol. En ajustant une courbe gaussienne bimodale à l'histogramme et en utilisant la distance de Bhattacharyya pour la quantification, une valeur de 7,80 est obtenue. Une valeur supérieure à 3,0 indique un fort contraste d'image permettant une séparation fiable28.

Carte thermique spectrale et histogramme pour l'analyse de l'intensité en fonction de la longueur d'onde ; analyse des données d'émission optique.
Figure 12 : Différence de réflectance entre le premier plan racinaire et le fond de sol pour différents rapports de bandes spectrales et histogramme des pixels au rapport spectral utilisé pour la segmentation.
(A) Les couleurs vives (jaune) indiquent un fort contraste entre le premier plan et l'arrière-plan, tandis que les couleurs sombres (bleu) indiquent un faible contraste. Les 15 premières bandes ont été supprimées en raison du bruit. Les lignes rouges indiquent le rapport de bande présentant le contraste le plus élevé. (B) Histogramme des pixels des racines (bleu) et du sol (rouge) au rapport spectral de segmentation. Les barres bleues représentent les racines et les barres rouges représentent le sol. La valeur d'intensité correspond au rapport entre la bande spectrale 160 et la bande spectrale 49. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

L'image binaire (Figure 13) est créée en appliquant un seuil d'intensité global du rapport spectral identifié à une valeur de 1,008 calculée à partir de la distance de l'histogramme27. L'analyse de la longueur des racines de cette image donne une longueur totale de 1557,3 cm, ce qui représente une erreur de seulement 1,5 % par rapport à l'image de référence tracée manuellement.

Schéma de la structure du réseau neuronal ; arbre dendritique ; image de microscopie ; visualisation des connexions neuronales.
Figure 13 : Image binaire du système racinaire du cultivar de betterave sucrière Ferrara.
L'image est obtenue en appliquant un seuil spectral global. Échelle (coin inférieur gauche), 2 cm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Bien que la segmentation des racines se soit améliorée grâce aux informations spectrales par rapport aux informations basées sur la couleur, l'objectif principal de l'imagerie hyperspectrale est l'analyse des propriétés chimiométriques de l'image. Cela est illustré par la cartographie de la teneur en eau d'une image de rhizobox.

Figure 14A montre les spectres moyens des compartiments dans la rhizobox de calibration (cf. Figure 7) remplie avec un sol présentant différentes teneurs en eau. La forme des spectres est similaire entre les compartiments, c’est-à-dire qu’un rapport spectral ne fournit pas nécessairement un critère de classification plus stable. Ainsi, l’intensité à une seule bande spectrale (1680 nm), où la différence moyenne entre des teneurs en eau adjacentes est maximisée, est identifiée comme le meilleur critère de séparation. Les histogrammes de pixels résultants pour cette longueur d’onde spectrale sont présentés dans Figure 14B.

Graphes d'analyse spectrale ; (A) spectres d'absorption, (B) distribution d'intensité pour les états humide et sec.
Figure 14 : Caractéristiques spectrales pour l'étalonnage de la teneur en eau.
(A) Spectres moyens de neuf compartiments d'eau du rhizobox d'étalonnage, ayant différentes teneurs en eau ; (B) Histogrammes des pixels pour les compartiments d'eau à la bande 216, où la distance moyenne entre les compartiments adjacents est maximale. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

La relation entre l'intensité moyenne des pixels à 1680 nm et la teneur en eau mesurée est illustrée dans la Figure 15.

Graphique d'humidité du sol ; ajustement exponentiel et linéaire. Teneur en eau contre réflectance ; capacité au champ, point de flétrissement.
Figure 15 : Relation entre la réflectance spectrale et la teneur en eau volumétrique.
La figure présente des paires de données de teneur en eau mesurée et de réflectance spectrale, avec des courbes empiriques (linéaire et exponentielle) ajustées aux données, à l'exception des teneurs en eau les plus élevées (triangles rouges). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

La différenciation de teneurs en eau élevées à partir de l'intensité spectrale devient difficile. Une régression significative (linéaire ou exponentielle) avec un R2 élevé peut être ajustée aux teneurs en eau jusqu'à environ 0,30 cm3 cm-3. Les conditions de sol plus humides ne peuvent pas être prédites de façon fiable par la valeur d'intensité. Un comportement similaire, avec une relation exponentielle entre la réflectivité et la teneur en eau et une réponse décroissante pour des teneurs en eau supérieures à 0,30 cm3 cm-3, a également été observé dans d'autres études30.

Une image de rhizobox avec une cartographie fine de la teneur en eau est présentée dans la Figure 16. Quatre aspects doivent être soulignés. Premièrement, une zone de teneur en eau plus faible est visible dans les parties racinées de la rhizobox. Deuxièmement, la déplétion la plus marquée est concentrée à proximité des axes racinaires individuels. Troisièmement, des zones de déplétion apparaissent également là où aucun axe racinaire n'est visible en surface, indiquant des régions où les racines sont enfouies dans le sol. Quatrièmement, la cartographie de l'eau sans traitement d'image supplémentaire donne une apparence tachetée en raison de l'agrégation du sol. Cela peut refléter une distribution hétérogène de la teneur en eau à l'échelle de l'agrégat, mais aussi l'effet de la morphologie de surface sur la qualité de l'image. Des techniques de traitement d'image chimiométriques permettent de surmonter de tels effets morphologiques dans les images spectrales31, mais n'ont pas encore été intégrées aux scripts Matlab utilisés ici.

Schéma de la structure d'un neurone ; détail des branches dendritiques dans l'analyse d'un réseau neuronal.
Figure 16 : Cartographie de la teneur en eau dans une rhizobox.
Les couleurs bleu foncé représentent les régions à forte teneur en eau, tandis que les zones allant du vert au rouge indiquent une faible teneur en eau. La racine de la plante est superposée en noir sur l'image. Échelle (en bas à gauche), 2 cm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Exemples d'application

Figure 17 met en relation les caractéristiques racinaires quantitatives issues de l'analyse d'image avec les mesures aériennes.

Analyse des données de croissance des plantes ; graphiques de la longueur des racines, du rapport de la surface racinaire, de la matière sèche, de la conductance stomatique.
Figure 17 : Exemples d'applications typiques pour les données racinaires.
(A) et (B) montrent des informations racinaires utilisées pour la caractérisation des parties aériennes et souterraines de la plante dans un contexte de phénotypage. (A) représente la croissance racinaire du cultivar de betterave sucrière Ferrara, (B) compare six cultivars de betterave sucrière cultivés en rhizobox à l’aide du rapport entre la surface foliaire et la surface racinaire (données provenant d’un seul réplicat). (C) et (D) illustrent des relations fonctionnelles entre des caractères telles qu’observées en recherche physiologique végétale. (C) montre l’influence du rapport entre la surface foliaire et la surface racinaire sur la production de matière sèche et (D) la relation entre la surface racinaire et la conductance stomatique. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 17A et 17B sont pertinentes pour le phénotypage axé sur une caractérisation complète des parties aériennes et souterraines de la plante. Figure 17A montre la croissance racinaire du cultivar de betterave sucrière Ferrara (cf. Figure 8 pour les images). L'expansion du système racinaire indique la capacité d'un cultivar à explorer le volume du sol sur une période donnée du cycle végétatif. Figure 17B montre le rapport entre la surface foliaire et la surface racinaire de six cultivars de betterave sucrière, fournissant un descripteur de l'équilibre entre l'approvisionnement (racine) et la demande (feuille) de la plante.

Figures 17C et 17D présentent des exemples de relations fonctionnelles d'intérêt en recherche physiologique. Dans la figure 17C, le rapport entre la surface foliaire et la surface racinaire est mis en relation avec la matière sèche formée au cours de l'expérience, indiquant le rôle prédominant de la surface d'assimilation comme facteur limitant l'accumulation de matière sèche. L'absence de significativité, malgré un coefficient de détermination R2 relativement élevé, est liée au faible nombre de données appariées (n=6) utilisé ici. La figure 17D révèle que les cultivars ayant une surface racinaire plus importante (absorption améliorée) présentent en moyenne une conductance stomatique plus élevée tout au long de l'expérience. La surface racinaire plus étendue permet apparemment une extraction d'eau accrue, prolongeant ainsi l'ouverture des stomates.

Discussion

Les protocoles prévoient deux approches complémentaires des sols cultivés imagerie du système racinaire. Une étape cruciale pour des résultats expérimentaux fiables se remplit de la rhizoboxes qui doit s’assurer d’une couche de substrat homogène et même à la vitre avant d’offrir un contact serré racine-sol à la fenêtre d’observation et éviter les trous d’air. C’est la principale raison d’utiliser la terre tamisée relativement fine de < 2 mm : agrégats plus gros aboutir à la morphologie de surface supérieure à la fenêtre d’observation avec des vides entre les agrégats. Outre un risque plus élevé de déshydratation de bout de racine, cela exige également des techniques de traitement des images plus complexes pour la cartographie de l’eau31.

Modifications du protocole est donc surtout au remplissage rapide et amélioré de rhizoboxes. Actuellement les temps de remplissage est environ 30 minutes par zone. En outre, utilisation de rhizoboxes avec deux fenêtres en verre pour l’imagerie des deux côtés et modifications pour optimiser l’homogénéité d’éclairage pour les meilleures images RVB sont testés. Prolongation de matériel peut-être aussi envisager d’intégration des optodes planaire32 mais aussi capacité d’imagerie33 dans le système de rhizobox. Cependant, c’est au-delà des activités actuelles de mise à niveau.

Modifications de logiciels se concentrent sur l’enregistrement automatique des images à fusionner le haut et en bas RBG photos34. Pour hyperspectral extraction de caractéristique sans supervision avancée d’imagerie approches28 ainsi que des méthodes de détection de cible supervisée plus sensibles tels que SVMs35 sont testés. Les données hyperspectrales potentiellement permettant ainsi que pour l’évaluation de multiples du sol, la rhizosphère et racine propriétés36. En outre, il vise à développer un (semi) automatisée de logiciels pour les images de racine rhizobox basé sur une version modifiée du système racinaire Analyzer37 à quantifier morphologiques (longueur, diamètre, surface) ainsi que des caractères architecturaux (fréquence de ramification, ramification des angles).

La principale limitation du protocole par rapport aux approches d’imagerie 3D est la restriction à la surface visible racine et les propriétés de la rhizosphère. Toutefois, il a été démontré que les traits de racines visibles sont un proxy fiable pour l' ensemble du système racinaire21. La technique de rhizobox peut se combiner aisément avec un échantillonnage destructeur traditionnel (lavage) à la fin de croissance dynamique d’imagerie afin de valider la relation entre le visible vs total système racinaire des traits. Comme cette relation pourrait varier entre espèces21, échantillonnage destructeur est recommandé pour garantir inférence fiable des caractéristiques visibles pour toute nouvelle série de phénotypage avec une espèce de cultures différentes.

Le principal avantage du protocole présenté ici est la combinaison de conditions de croissance réalistes (sol), le débit potentiel relativement élevé pour l’imagerie RVB et l’inférence sur la fonctionnalité de racine (par exemple l’absorption d’eau) via les données de racine et de la rhizosphère chimiométriques d’imagerie hyperspectrale résolues dans le temps. Ainsi les méthodes surmonte les restrictions d’inférence dans des semis à haut débit et racine de non-sol imagerie méthodes14, tandis que cela permet partiellement aperçus de phénotypage profonde des processus fonctionnels avec complexité moins expérimentale et des débits plus élevés par rapport aux méthodes 3D avancées15.

Dans les expériences à venir le protocole servira à étudier l’effet des mycorhizes sur le développement du système racinaire et la fonctionnalité des légumineuses ainsi en ce qui concerne les caractéristiques de racine de phénotypage d’espèces de cultures de couverture en ce qui concerne la structure du sol, l’azote et carbone vélo.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent le financement de l’Austrian Science fonds FWF via le projet numéro P 25190-B16 (les racines de la résistance à la sécheresse). Mise en place de l’infrastructure d’imagerie hyperspectrale a été soutenu financièrement par le gouvernement fédéral de Basse Autriche (Land Niederösterreich) via le projet K3-F-282/001-2012. Un financement supplémentaire pour l’expérience de la betterave à sucre a été reçue de recherche AGRANA & Innovation Center GmbH (ARIC). Les auteurs remercient Craig Jackson pour le support technique au cours de l’expérience et anglaise correction du manuscrit. Nous remercions également Markus Freudhofmaier qui ont contribué à la mise en place le programme d’installation d’imagerie de RVB et Josef Schodl pour la construction de l’installation de rhizobox.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RhizoboxTechnisches Bü ; ro fü ; r BodenkulturConstructeur
Lampes LED ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
Tube fluorescent HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
Tube lumineux UV Eurolite 45cm slim 15 WConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro c. 2013Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 Caméra SWIRXenicsXEN-000105
Spectrographe Imspector N25ESpecim
Scanner d’imagerie hyperspectraleCarinthian Tech Research AGConstructeur expérimentalConception et assemblage de scanner d’imagerie hyperspectrale et de logiciel
Matlab R2106aMathworksY compris les boîtes à outils pour le traitement d’images, le traitement du signal et les statistiques et l’apprentissage automatique
AP4 PoromoeterDelta-T-Devices
LI-3100C Compteur de surfaceLI-COR
BASF Feuilles de polystyrène StyradurObi Baumarkt9706318Différents types de feuilles de polystyrène ou d’autres matériaux séparant différemment le sol humidifié peuvent être utilisés
expérimental

Références

  1. Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. , DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).
  2. Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. The origin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).
  3. Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. Global change and terrestrial plant community dynamics. PNAS. 113, 3725-3734 (2016).
  4. MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands. PNAS. 108, 3086-3091 (2011).
  5. Vörösmarty, C. J., Green, P., Salisbury, J., Lammers, R. B. Global water resources: vulnerability from climate change and population growth. Science. 289, 284(2000).
  6. Lobell, D. B., Cassman, K. G., Field, C. B. Crop yield gaps: their importance, magnitudes, and causes. Annu. Rev. Environ. Resour. 34, 179-204 (2009).
  7. Angus, J. F., Van Herwaarden, A. F. Increasing water use and water use efficiency in dryland wheat. Agron. J. 93, 290-298 (2001).
  8. Lassaletta, L., Billen, G., Grizzetti, B., Anglade, J., Garnier, J. 50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems: the relationship between yield and nitrogen input to cropland. Environ. Res. Lett. 9 (10), 105011(2014).
  9. Lynch, J. P. Roots of the second green revolution. Aust. J Bot. 55, 493-512 (2007).
  10. Comas, L. H., Becker, S. R., Von Mark, V. C., Byrne, P. F., Dierig, D. A. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front. Plant Sci. 4, 442(2013).
  11. Metcalfe, D. B., et al. A method for extracting plant roots from soil which facilitates rapid sample processing without compromising measurement accuracy. New Phytol. 174, 697-703 (2007).
  12. Kutschera, L., Lichtenegger, E., Sobotik, M. Wurzelatlas der Kulturpflanzen gemäßigter Gebiete mit Arten des Feldgemüsebaues. , DLG-Verlag, Frankfurt am Main. (2009).
  13. Gioia, T., et al. GrowScreen-PaGe, a non-invasive, high-throughput phenotyping system based on germination paper to quantify crop phenotypic diversity and plasticity of root traits under varying nutrient supply. Funct. Plant Biol. 44, 76-93 (2017).
  14. Watt, M., et al. A rapid, controlled-environment seedling root screen for wheat correlates well with rooting depths at vegetative, but not reproductive, stages at two field sites. Ann. Bot. 112, 447-455 (2013).
  15. Fiorani, F., Schurr, U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu. Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).
  16. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
  17. Choat, B., Badel, E., Burlett, R., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Non-invasive measurement of vulnerability to drought induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiol. 170, 273-282 (2015).
  18. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
  19. Le Marié, C., Kirchgessner, N., Marschall, D., Walter, A., Hund, A. Rhizoslides: paper-based growth system for non-destructive, high throughput phenotyping of root development by means of image analysis. Plant Methods. 10, 1(2014).
  20. Bengough, A. G., et al. Gel observation chamber for rapid screening of root traits in cereal seedlings. Plant Soil. 262, 63-70 (2004).
  21. Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct. Plant Biol. 39, 891-904 (2012).
  22. Price, A. H., et al. Upland rice grown in soil-filled chambers and exposed to contrasting water-deficit regimes: I. Root distribution, water use and plant water status. Field Crops Res. 76, 11-24 (2002).
  23. Vadez, V. Root hydraulics: the forgotten side of roots in drought adaptation. Field Crops Res. 165, 15-24 (2014).
  24. Dane, J. H., Hopmans, J. W. Pressure plate extractor. Methods of soil analysis. Part 4. Physical methods. Dane, J. H., Topp, G. C. , SSSA Inc. Madison, Wisconsin, USA. 688-690 (2002).
  25. Wösten, J. H. M., Pachepsky, Y. A., Rawls, W. J. Pedotransfer functions: bridging the gap between available basic soil data and missing soil hydraulic characteristics. J. Hydrol. 251, 123-150 (2001).
  26. Passioura, J. B. The perils of pot experiments. Funct. Plant Biol. 33, 1075-1079 (2006).
  27. Dorrepaal, R., Malegori, C., Gowen, A. Tutorial: Time series hyperspectral image analysis. J. Near Infrared Spec. 24, 89-107 (2016).
  28. Kim, D. M., et al. Highly sensitive image-derived indices of water-stressed plants using hyperspectral imaging in SWIR and histogram analysis. Scie rep. 5, (2015).
  29. Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses-a review. Plant Methods. 11, 29(2015).
  30. Lobell, D. B., Asner, G. P. Moisture effects on soil reflectance. Soil Sci. Soc. Am. J. 66, 722-727 (2002).
  31. Esquerre, C., Gowen, A. A., Burger, J., Downey, G., O'Donnell, C. P. Suppressing sample morphology effects in near infrared spectral imaging using chemometric data pre-treatments. Chemometr. Intell. Lab. 117, 129-137 (2012).
  32. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environ Sci. Technol. 48, 8498-8506 (2014).
  33. Cseresnyés, I., Takács, T., Végh, K. R., Anton, A., Rajkai, K. Electrical impedance and capacitance method: a new approach for detection of functional aspects of arbuscular mycorrhizal colonization in maize. Eur. J Soil Biol. 54, 25-31 (2013).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Automatic panoramic image stitching using invariant features. Int. J. Comput. Vision. 74, 59-73 (2007).
  35. Jiang, Y., Li, C., Takeda, F. Nondestructive detection and quantification of blueberry bruising using near-infrared (NIR) hyperspectral reflectance imaging. Scientific Reports. 6, 35679(2016).
  36. Chang, C. -W., Laird, D. A., Mausbach, M. J., Hurburgh, C. R. Near-infrared reflectance spectroscopy-principal components regression analyses of soil properties. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 480-490 (2001).
  37. Leitner, D., Felderer, B., Vontobel, P., Schnepf, A. Recovering root system traits using image analysis exemplified by two-dimensional neutron radiography images of lupine. Plant Physiol. 164 (1), 24-35 (2014).

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Imagerie hyperspectraleimagerie RVBconfiguration de rhizoboxcartographie de la teneur en eausegmentation des racinesanalyse spectralebruit de fond du soltraitement d images
RVB et l’imagerie spectrale racine pour le phénotypage de l’usine et la recherche en physiologie : montage expérimental et des protocoles d’imagerie
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.