Préparation des Hydrogels injectables axée sur le Chitosan et son Application en Culture cellulaire 3D

Summary

Nous décrivons ici une préparation facile des hydrogels injectables axée sur le chitosan aide chimie dynamique imine. Méthodes pour ajuster la résistance mécanique de l’hydrogel et son application en culture cellulaire 3D sont présentés.

Abstract

Le protocole présente une méthode facile, efficace et polyvalente pour préparer les hydrogels axée sur le chitosan aide chimie dynamique imine. L’hydrogel est préparé en mélangeant des solutions de chitosan de glycol avec un gelator de polymère synthétisé benzaldéhyde résilié et hydrogels sont efficacement obtenus en quelques minutes à température ambiante. Par divers ratios entre chitosane de glycol, gelator de polymère et des teneurs en eau, hydrogels polyvalents avec temps de gélification différents et rigidité sont obtenus. Si endommagé, l’hydrogel peut récupérer ses apparitions et du module, en raison de la réversibilité des liaisons dynamiques imine comme crosslinkages. Cette propriété se guérissables permet l’hydrogel à être injectable car il peut être autonome guéri de morceaux pressés d’un hydrogel intégrale en vrac après le processus d’injection. L’hydrogel est également multi-sensible aux nombreux stimuli bio-actifs en raison de statuts différents de l’équilibration des liaisons dynamiques imine. Cet hydrogel a été confirmé comme bio-compatibles et cellules de fibroblaste de souris L929 étaient embarqués suivant les procédures standards et la prolifération cellulaire a été évaluée facilement par un procédé de culture cellulaire 3D. L’hydrogel peut offrir une plate-forme réglable pour différentes recherches où un imitateur physiologique d’un environnement 3D pour les cellules est profité. Ainsi que ses propriétés multiples adaptées, Self guérissables et injectables, les hydrogels peut potentiellement être appliqués comme plusieurs transporteurs des médicaments et des cellules dans les futures applications bio-médicales.

Introduction

Les hydrogels sont des matériaux polymères réticulés avec de grandes quantités d’eau et des propriétés mécaniques douces et ils ont été utilisés dans nombreuses applications bio-médicales^1,2. Hydrogels peuvent offrir un environnement doux et humide, ce qui est très similaire à l’environnement physiologique des cellules in vivo. Par conséquent, hydrogels sont devenus l’un des plus populaires utilisés pour 3D cell culture^3,4. Par rapport à la culture cellulaire 2D Pétri, culture cellulaire 3D a progressé rapidement pour offrir qu'une matrice extracellulaire (ECM) imité le micro-environnement des cellules à contacter et assembler pour la prolifération et la différenciation des fins⁵. En outre, hydrogels contenant des polymères naturels pourrait offrir des environnements biocompatibles et promotion pour les cellules à proliférer et se différencier³. Hydrogels dérivés de polymères synthétiques sont préférés pour leurs composants simples et claires, qui excluent des influences complexes comme les protéines d’origine animale ou des virus. Parmi tous les candidats d’hydrogel pour culture cellulaire 3D, hydrogels qui sont facilement préparés et ont une propriété compatible sont toujours préférés. La possibilité d’ajuster les propriétés de l’hydrogel pour s’adapter aux exigences différentes recherches est importante en tant que puits⁶.

Ici, nous introduisons une préparation facile d’un glycol axée sur le chitosan hydrogel utilisant la chimie dynamique imine, qui devient une plateforme polyvalente hydrogel pour 3D cell culture⁷. Dans cette méthode, bien connu biocompatible glycol chitosan servent à établir les cadres des réseaux de l’hydrogel. Ses groupes aminés sont réagit avec un benzaldéhyde résilié polyéthylène glycol comme le gelator de polymère forment des liaisons dynamiques imine comme crosslinkages des hydrogels⁸. Liaisons dynamiques imine peuvent former et se décomposent réversiblement et adaptée à un environnement, dotant les hydrogels avec réglage mécanique réticulé réseaux^9,10,11. En raison de sa teneur en eau élevée, matériaux biocompatibles et résistances mécaniques réglables, l’hydrogel est appliquée avec succès comme un échafaudage pour les cellules L929 3D cell culture^12,13. Le protocole ici en détail les procédures, y compris la synthèse des polymères gelator, hydrogel préparation, cellule intégration et mise en culture cellulaire 3D.

L’hydrogel montre également plusieurs autres fonctionnalités en raison de son crosslinkages imine dynamique, y compris ses multiples adaptés à divers bio-stimulants (acide/pH, pyridoxal dérivés de vitamine B6, papaïne protéine, etc.), ce qui indique que l’hydrogel peut être induit à se décomposer sous des conditions physiologiques⁸. L’hydrogel est également automatique guérissables et injectable, qui signifie l’hydrogel pourrait être administré via une méthode d’injection invasive minimale et obtenir un avantage dans la drogue et la cellule livraisons^14,15. En ajoutant des additifs fonctionnels ou gelators polymère préconçu spécifique, l’hydrogel est compatible à l’obtention de propriétés spécifiques comme magnétique, température, pH réactif, etc.^16,17, ce qui pourrait remplir un large gamme de besoins de recherche. Ces propriétés révèlent capacité potentielle de l’hydrogel pour être un injectable plusieurs porteuses des médicaments et des cellules dans des applications et de recherches bio-médicales in vitro et in vivo .

Protocol

attention : veuillez consulter toutes les fiches signalétiques (FS) avant utilisation. S’il vous plaît utiliser les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution des expériences de chimie, y compris l’utilisation d’une hotte de laboratoire et des équipements de protection individuelle (lunettes, gants, blouse de laboratoire, etc.). Le protocole exige des cellules standard (stérilisation, récupération de cellules, cellule passage, gel cell, cellule coloration, etc.) des techniques de manutention.

1. préparation des Hydrogels

1. synthèse du benzaldéhyde résilié fonctionnalisés di polyéthylène glycol (PEG DF)
   1. avant la dessiccation du PEG polymère
      1. peser 4,00 g PEG (MW 4 000, 1,00 mmol), transférer dans un ballon à fond rond (250 mL) et ajouter le toluène (100 mL).
         Remarque : Autres pinces avec des poids moléculaires différents peuvent travailler pour la formation d’hydrogel mais conduira à différent raideur.
      2. Chauffer la solution par un pistolet à air chaud (ou une plaque de cuisson autour de 40 ° C) légèrement pour aider à dissoudre tous les polymères. Après que tous les polymères se dissolvent, utiliser un évaporateur pour supprimer tous les solvants. Répétez ce processus sec et dissoudre deux fois pour faire le PEG séché polymères.
         ATTENTION : Ceci doit être effectuée sous une hotte avec un soin extrême. Le toluène est inflammable.
   2. Réaction de terminaison benzaldéhyde de PEG
      1. Ajouter un agitateur magnétique et le tétrahydrofurane (THF, 100 mL) dans le ballon et dissoudre la cheville à l’aide d’un agitateur. Ajouter 4-carboxybenzaldéhyde (0,90 g, 6,0 mmol) et la 4-diméthylaminopyridine (0,07 g, 0,6 mmol) séquentiellement aux solutions pour dissoudre tous les solides complètement.
      2. Add N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) à la solution et ajouter un tube de séchage qui est rempli d’anhydre CaCl ₂ au ballon. Laissez la réaction sous agitation à température ambiante (~ 20 ° C) pendant environ 12 h.
   3. Processus de réaction post
      1. Filtrer les blancs solides générés dans la solution par le vide après la réaction est terminée. Versez la solution dans l’éther diéthylique froid (500 mL) en remuant pour précipiter les solides blancs. Rassembler tous les solides blancs par filtre et sécher les solides sous une hotte.
      2. Dissoudre les solides blancs en THF à nouveau, filtrer toute insolubles solides blancs, verser la solution dans la fraîche froide diéthyléther à précipiter les solides blancs et séchez-le. Répétez cette opération deux ou trois fois et puis placez les solides blancs dans un four de séchage sous vide (20 ° C, 0,1 mbar) pour les faire sécher complètement. Recueillir la poudre blanche que le produit final : benzaldéhyde résilié PEG DF.
2. Préparation des hydrogels
   1. peser des quantités différentes de DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol ; 0,22 g, 0,055 mmol ; 0,44 g, 0,110 mmol) dans un tube (10 mL), ajouter de l’eau désionisée (5,0 mL) et utiliser un vortex ou agitateur magnétique pour aider dissoudre le polymère.
   2. Dissoudre glycol chitosan (0,495 g, 6,18 x 10 ^-3 mmol) dans l’eau désionisée (15,0 mL) dans un tube (50 mL) et utiliser un vortex pendant quelques minutes pour homogénéiser la solution de chitosan (3 % en poids).
   3. Ajouter la solution de chitosan de glycol (0,2 mL, 3 % en poids) et DF PEG (0,2 mL) séquentiellement dans un tube (2,0 mL). Utiliser un vortex pour mélanger les solutions homogène aux hydrogels de forme en quelques minutes. Suivre les ratios dans le tableau 1 pour rendre les hydrogels de différentes résistances mécaniques.
      Remarque : Utilisez la méthode tube inversé afin de déterminer si l’hydrogel a déjà formé.
3. Des analyses de rhéologie
   1. réaliser des analyses de rhéologie sur un rhéomètre rotationnel avec une plaque d’acier parallèle (diamètre : 20 mm). Pour le test de gélification, répandre la solution de chitosan glycol (0,2 mL, 3 % en poids) sur une plaque inférieure. Ensuite, ajouter les solutions aqueuses de DF PEG (0,2 mL, 2 % en poids) uniformément goutte sur la surface de solution de chitosan et mélanger rapidement avec une pipette. Plus bas vers le bas de la plaque supérieure et commencer à tester
   2. D’hydrogel ' test de rigidité s, couper un hydrogel en un cercle (diamètre : 20 mm) et de mesurer le module de stockage (G ') valeurs en fonction des analyses de fréquence à une déformation de 1 %. G typique ' valeurs à 6,3 rad s ^{− 1} sont répertoriés dans le tableau 1.
      Note : Effectuer les analyses de la rhéologie de l’hydrogel 0,5 h après la formation d’hydrogel pour assurer la stabilisation de la liaison dynamique de l’hydrogel.
   3. Pour l’hydrogel ' propriété Self guérissables s test, couper un hydrogel en morceaux et rassembler les morceaux d’auto-guérison pour une pièce intégrale. Puis couper le morceau d’hydrogel pour faire un cercle (diamètre : 20 mm) et placez-le sur le rhéomètre pour effectuer l’analyse rhéologique.

2. la culture cellulaire 3D en Hydrogels

1. préparation des solutions de gélification hydrogel
   1. DF peser PEG (0,44 g, 0,11 mmol) dans un tube stérile (4,0 mL), ajouter dans les milieux de culture cellulaire (RPMI-1640, 2.0 mL) et utiliser un vortex ou agitateur pour aider à dissoudre le polymère pour obtenir la solution de polymère (20 % en poids). Chargez la solution dans une seringue (10,0 mL) et ensuite de le stériliser en le faisant passer à travers un filtre anti-microbien micron (0,22 µm).
   2. Peser le chitosane de glycol (0,165 g, 2,06 x 10 ^-3 mmol) dans un tube stérile (15,0 mL), ajouter dans les milieux de culture cellulaire (RPMI-1640, 4,0 mL) et vortex pour aider à dissoudre le polymère pour obtenir la solution de chitosan de glycol (4,0 % en poids). Chargez la solution dans une seringue (10,0 mL) et de la filtrer avec un filtre anti-microbien 0,22 µm.
2. Culture cellulaire en hydrogels
   attention : effectuer tous procédures connexes sous une hotte de vitroplants de cellules. Connaissance de base de la technique de stérilisation est prévu.
   1. Préparation de la suspension de cellules
      1. cellules L929 de Culture en milieu RPMI-1640 additionné de 10 % BF, la pénicilline (10 mL) de 5 % à un Petri dish (diamètre 10 cm) et incuber à 37 ° C, 5 % de CO ₂. Changer le milieu chaque jour avant l’utilisation.
      2. Récolter les cellules L929 avec du PBS contenant de la trypsine (0,025 % w/v) et l’EDTA (0,01 % p/v), puis centrifuger (70 x g, 5 min) et remettre en suspension les cellules dans le milieu RPMI-1640 (1,0 mL). Effectuer le comptage des cellules à l’aide de fonctionnement standard de comptage sang Conseil. Remettre en suspension les cellules pour ajuster la concentration en cellules à ~ 3,75 × 10 ⁶ cellules/mL.
   2. Encapsulation de cellules dans des hydrogels
      1. solution de chitosan de glycol (0,4 mL) dans un tube (4,0 mL) par vortex se mêlent les suspensions de cellules L929 (0,4 mL, 3,75 x 10 ⁶ cellules mL ^-1). Pipetter, la solution de chitosan L929/glycol (0,8 mL) dans le centre d’un plat de Pétri confocale (diamètre 2,0 cm). Dans le même plat, déposer les solutions de PEG DF (0,2 mL) et Pipetez doucement pour mélanger la solution et d’induire la formation de l’hydrogel.
         Remarque : Évaluer la formation de l’hydrogel en inclinant le Pétri.
      2. Pour la culture cellulaire directe, ajouter des montants supplémentaires de milieux de culture RPMI-1640 (1,0 mL) sur le dessus de l’hydrogel. Mettre les hydrogels cellule intégrée (1,0 mL, wt 1,5 % glycol chitosan, 4,0 % en poids DF PEG, 1,5 × 10 ⁶ cellules mL ^-1) dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO ₂) et changer le support de tous les jours. Se préparer pour l’imagerie cellulaire jour 1, 3, 5 et 7, après l’encapsulation de cellules.
   3. Pour la culture post de cellule 3D en hydrogels après injection, préparer la cellule chargé hydrogel (1,0 mL, reportez-vous à l’étape 2.2.2) dans une seringue (10,0 mL, 48 G aiguille). Après les formes d’hydrogel, injecter l’hydrogel lentement dans une boîte de Pétri pour l’imagerie confocale. Ajouter un montant additionnel de milieux de culture (1,0 mL) sur le dessus de l’hydrogel et changez-la tous les jours. Mettre la boîte de Pétri dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO ₂) et se préparer pour l’imagerie par la suite.
      ATTENTION : Veuillez vérifier et suivre le protocole de fonctionnement de sécurité d’une seringue.
3. Analyse de viabilité de cellules
   1. confocale observation
      1. Rincer les hydrogels avec du PBS (1,0 mL) deux fois. Tacher les hydrogels avec fluorescéine diacétate (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) et solutions de propidium iodure (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) pendant 15 min. Après coloration, retirer tous les solvants.
      2. Observer les hydrogels à l’aide d’un microscope confocal sous excitation longueurs d’onde de 488 nm et 543 nm pour visualiser en direct et morts cellules, respectivement. Prendre z-piles grâce à chaque profondeur de 2 µm de l’hydrogel pour valider une répartition uniforme des cellules tout au long de.
         Remarque : FDA taches des cellules vivantes tandis que PI taches mortes.
   2. Dégradent l’hydrogel (1,0 mL) avec de l’acide acétique (HAc, 3 v %, 1,0 mL) pendant 5 min et pipette dans un tube (4,0 mL). Prélever des cellules par centrifugation (70 x g, 5 min) et remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture cellulaire RPMI-1640 (1,0 mL). Effectuer le comptage des cellules à l’aide d’un sang comptage Conseil.

Results

Une présentation schématique du présent protocole sur la préparation de l’hydrogel et son utilisation comme culture cellulaire 3D est offert à la Figure 1. Information des contenus et des rapports préparés avec différentes résistances mécaniques de l’hydrogel est résumée dans le tableau 1. L’hydrogel de self guérissables et propriété de rhéologie présente la raideur de l’hydrogel de module de stockage par rapport à la fréquence de test dans la Figure 2

Discussion

L’hydrogel présentée dans le présent protocole (Figure 1) comporte deux grands volets : le chitosan de glycol polymère naturel et un benzaldéhyde synthétique fin gelator polymère DF PEG, qui sont les deux matériaux biocompatibles. Synthèse de DF PEG est présentée à l’aide d’une réaction de modification en une seule étape. PEG de poids moléculaire de 4 000 a été choisie dans le présent protocole dans les préoccupations de solubilité, efficacité de la modification, ainsi que raideur hydrogel. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycol chitosan	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90 % degré de désacétylation
4-Carboxybenzaldéhyde	Shanghai Aladdin  ; Bio-Chem Technology Co.,LTD	619-66-9	99
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide	Shanghai Aladdin  ; Bio-Chem Technology Co.,LTD	538-75-0	99 %
Chlorure de calcium anhydre	Shanghai Aladdin  ; Bio-Chem Technology Co.,LTD	10043-52-4	96
%4-diméthylamiopryidine	Shanghai Aladdin  ; Bio-Chem Technology Co., LTD	1122-58	99 %
Polyéthylèneglycol	Sino-pharm Réactif chimique	5254-43-7	99 %
Tétrahydrofurane	Sino-pharm Réactif chimique	109-99-9	99
Toluène	Sino-pharm Réactif chimique	108-88-3	99 %
Éther éthylique	Sino-pharm Réactif chimique	60-29-7	99 %
Acide acétique	Sino-pharm Chemical Reagent	64-19-7	99
% Anhydrus CaCl2	Sino-pharm Chemical Reagent	10043-52-4	99 %
Fluorescéine diacétate	Sigma	596-09-8	99 %
Iodure de propidium  ;	Sigma	25535-16-4	94 %
RPMI-1640 milieu de culture	Gibco
Sérum fœtal bovin	Gibco
Trypsine-EDTA	Gibco		0,25
PBS	Solarbio		0,01 M
Pénicilline streptomycine solution	Hyclone		10,000 U/mL
Rhéomètre	TA Instrument		AR-G2
	Zeiss		710-3channel
L929 Cellules	ATCC		NCTC clone 929 ; Cellule L, L929, dérivé de la souche L
Évaporateur	EYELA		N-1100
Aiguille de calibre 48	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD		Microscope de calibre 48
	Leica		DM3000 B
Logiciel de microscope	Imaris
Pistolet thermique	Confu		KF-5843  ;
Boîte de Pétri	NEST