Denne protokollen beskriver hvordan produsere netthinnens pigment epitelceller (RPE) fra pluripotent stamceller. Metoden bruker en kombinasjon av vekstfaktorer og små molekyler til direkte differensiering av stamceller i umodne RPE i fjorten dager og modne, funksjonelle RPE etter tre måneder.
Vi beskriver en robust metode for direkte differensiering av pluripotent stamceller i retinal pigment epitelceller (RPE). Formålet å gi en detaljert og grundig protokoll er tydelig vise hvert trinn og gjøre dette lett tilgjengelig for forskere innen. Denne protokollen gir et homogent lag av RPE med minimal eller ingen manuelle disseksjon nødvendig. Metoden som presenteres her har vist seg å være effektive for indusert pluripotent stamceller (iPSC) og menneskelige embryonale stamceller. I tillegg beskriver vi metoder for kryonisk bevaring av mellomliggende cellen banker at langvarig lagring. RPE genereres ved hjelp av denne protokollen kan være nyttig for iPSC sykdom-i-en-fat modellering eller klinisk anvendelse.
Netthinnens pigment epitel er en monolayer av pigmentert celler som støtter avgjørende fotoreseptorer. Netthinnens pigment epitelceller (RPE) har mange funksjoner i visjon, inkludert lys absorpsjon, Nærings-og ion, retinoid sykling, photoreceptor ytre segmentet fagocytose, og vekst faktor sekresjon1. Det finnes en rekke retinal dystrophies som påvirker funksjon RPE og resulterer i tap av syn, inkludert alder makuladegenerasjon og retinitis pigmentosa. Generasjon av RPE fra pluripotent stamceller kan lette undersøkelser for å forstå disse øyesykdommer og kan gi en ubegrenset kilde av RPE for cellen terapi2. Faktisk, bruker flere kliniske studier i gang RPE avledet fra pluripotent stamceller3.
Denne differensieringen protokollen ble opprinnelig beskrevet av Buchholz4 og var basert på tidligere publiserte metoden Clegg5. Prosedyren etterligner normal i vivo utviklingsprosessen for direkte udifferensierte pluripotent stamceller mot en RPE skjebne via manipulering av insulin vekstfaktor (IGF), grunnleggende fibroblast vekst faktor (FGF-2; FGF-basic), transformasjon av vekstfaktor beta (TGF-β) og WNT trasé4,5. Protokollen ble forbedret med tillegg av en WNT veien Agonistiske sent i protokollen, som ga 97.77% ± 0,1% pre-melanosome protein (PMEL) positive celler, og har blitt tilpasset xeno uten betingelser6,7. Den resulterende RPE har vist å uttrykke RPE markører på transkripsjon og protein, skiller kjent RPE vekstfaktorer med riktig polaritet og utføre fagocytose photoreceptor ytre segmenter8. Denne protokollen er raskere og pålitelig enn “spontan” protokoller av differensiering som involverer enkel fjerning av grunnleggende fibroblast vekstfaktor8. Videre RNA sekvensering data viser at RPE fikk bruker denne protokollen er svært like de oppnådd ved hjelp av de vanligste spontane tilnærming8. 14-dag-metoden genererer RPE som passer “5 P’s” nevnt av Mazzoni9 (pigmentert, polarisert, phagocytic, etter mitotisk, mangekantet)9. Mens denne prosedyren har vist seg for å være reproduserbar i flere labs, ønsker vi å erkjenne flere ekstra rettet differensiering metoder som er publisert i siste årene10,11,12 , 13.
Denne protokollen beskriver hvordan produsere netthinnens pigment epitelceller fra pluripotent stamceller. Metoden ble optimalisert ved hjelp av både menneskelige embryonale og indusert pluripotent stamceller fra en mater-fri, serum-fri kultur-metode. Siden første isolering av menneskelige embryonale stamceller i 1998 og avledning av indusert pluripotent stamceller (iPSC) i 2007, en rekke stamcelleforskningen kultur metoder har blitt utviklet14,15,16, 17. Disse metodene bør være tilstrekkelig for å produsere stamcelleforskningen koloniene som er utsatt for denne differensiering. Det er ingen kjente begrensninger til anvendelsen av denne metoden å riktig avledet og vedlikeholdt pluripotent stamceller.
De viktigste trinnene er passaging av stamceller dag 0 av differensiering (trinn 2.5) og behovet for manuell disseksjon på dag 14 av prosessen (trinn 4.5). Når plukke fjerne differensierte celler fra stamcelleforskningen koloniene, se bildene i Kent18. Som indikert, angi fibroblastic cellene mellom kolonier og ugjennomsiktig cellene i koloniene differensierte celler som må fjernes før du begynner denne protokollen18. Bare udifferensierte, tett pakket kolonier med definerte kanter bør være passaged for differensiering.
Antall stamceller seeded per brønn (trinn 2.6.7) er komplisert ved det faktum at stamceller kan ikke være triturated i en enkelt celle suspensjon på passasje og kan ikke telles nøyaktig ved hjelp av en hemocytometer. Tilnærming av 80% confluent stamceller er angitt for passaging 1 godt av en 6-vel plate i 4 brønner av en 12-vel plate. Forskjeller mellom stamcelleforskningen linjer, for eksempel vekst, kan påvirke hvor raskt den umodne RPE nå samløpet mellom dager 0 til 4. Stamceller vil produsere RPE uansett nøyaktig samløpet, men cellen avkastningen vil påvirkes negativt hvis cellene er for sparsom på dette stadiet. Umoden RPE cellene bør være ca 40-50% confluent på dag 1 og nesten 100% confluent dag 4. Hvis cellene ikke produserer en confluent monolayer dag 4 eller 6, skal protokollen gjentas på en høyere seeding tetthet på dag 0. For eksempel hvis 1 godt av en 6-vel plate var passaged 4 brønner av en 12-vel plate på dag 0 og den umodne RPE er ikke 100% confluent på dag 4, redusere frø til en 1:3 eller 1:2 passasje på dag 0 eller tillate stamceller blir mer confluent før passaging. Det er viktig å etablere en konsekvent seeding tetthet når du sammenligner flere linjer.
Manuell disseksjon trinnet på dag 14 er bare nødvendig når ikke-RPE celler finnes i kultur (figur 2C). Siden tillegg av CHIR99021 i protokollen krever mange pluripotent stilk cellen lite eller ingen manuell disseksjon. Noen forberedelser har en høyere forekomst av nevrale oppdateringer og det er viktig å fjerne disse cellene. Hvis RPE ikke levedyktig på passage 0 gjennom passering 3, er det mulig å gjenta differensiering protokollen tar nok tid til å fjerne alle ikke-RPE celler. Dette skjer ikke ofte, men det er nevnt her for å merke seg at disseksjon trinnet på dag 14 kan optimaliseres ved behov.
Det finnes en rekke RPE differensiering protokoller som varierer i pris samt kultur metoder, effektivitet, kvantifisering og funksjonell vurdering, som har vært vurdert grundig2. Vi foretrekker metoden 14 dagers detaljert her på grunn av sin effekt, tilpasningsevne og anvendelighet til et bredt spekter av cellen linjer4,7,8. Kryonisk bevaring trinnet i denne protokollen gir også en stor fordel i å skape en mellomliggende cellen bank for fremtidig bruk, unngå parti til parti variasjon i eksperimenter. Starter med bare 4 brønner av en 12-vel plate, er det mulig å utvide til 6-vel plater på passage 0 og MT75 flasker på passering 1 og 2. På passage 2 dag 3-5, når cellene er fortsatt subconfluent og har ikke fått tilbake pigment, er det mulig å cryopreserve millioner av celler og deretter tine den eldre RPE, utpekt passering 3 dagers 30, for å sjekke RNA uttrykk, protein uttrykk, vekstfaktor sekresjon, fagocytose, etc. Vi har også etablert for å utvide RPE for opp til 13 passasjer 19.
Gleder oss, vil denne metoden være nyttig for iPSC modellering av okulær sykdom og generasjon RPE for mobilnettet terapi. Med hensyn til iPSC sykdom modellering brukes denne protokollen for øyeblikket i laboratoriet til å produsere RPE fra CRISPR-korrigert linjene med ikke-korrigert kontroller fra samme pasient. Videre er denne protokollen tilpasningsdyktig syntetiske underlag og xeno uten betingelser som er nyttige for å overholde de anbefalte fremgangsmåtene kreves for mobilnettet terapi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Garland initiativ for visjon, California Institutt for regenerativ medisin (CIRM, tilskudd DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 og TG2-01151), The Vermont samfunnet Foundation, The Breaux Foundation, og Foundation Fighting blindhet Wynn-Gund translasjonsforskning akselerasjon programmet.
SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet | Baker | model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 | 6' Baker laminar flow biosafety cabinet |
Dissection Hood | Labconco | Model 3970405 | laminar flow bench top |
dissecting microscope | Nikon | SMZ 1500 | heated stage |
air-jacketed CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | 37 oC and 5% CO2 |
inverted phase contrast microscope | Olympus | IX53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Media Components | |||
DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
NEAA | Gibco | 11140050 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Factors and Reagents | |||
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
Recombinant mouse noggin | R&D systems | 1967-NG-025 | |
Recombinant human DKK-1 | R&D systems | 5439-DK-010 | |
Recombinant IGF-1 | R&D systems | 291-G1-200 | |
FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
Recombinant human/mouse/rat Activin A | Peprotech | 120-14E | |
SU5402 FGF inhibitor | Santa Cruz Biotechnology | sc-204308 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Substrates | |||
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free | Corning | 356237 | extracellular matrix-based hydrogel (ECMH) |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free | Corning | 354277 | growth factor reduced ECMH |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other reagents | |||
1X Versene (EDTA) | Gibco | 15040066 | |
DPBS | Gibco | 14190250 | |
1X PBS (no calcium, no magnesium) | Gibco | 10010023 | |
TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) | Gibco | 12563011 | |
X-VIVO 10 (RPE supporting medium) | Lonza | BW04-743Q | |
Y-27632 | Tocris | 12-541-0 (1254) | |
CryoStor CS10 | BioLife Solutions | 210102 | cryopreservation medium |
1.2 mL Cryogenic Vial | Corning | 430487 | |
Mr. Frosty (freezing container) | Nalgene | 5100-0001 | freezing container |
Normocin | Invivogen | ant-nr-2 | antimicrobial reagent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other Equipment | |||
Pipet-aid | Drummond | 4-000-101 | |
12-well culture plate | Corning | CLS3516 | Used during differentiation. |
T75 flask | Corning | 430641 | Used during RPE maturation. |
6-well culture plate | Corning | CLS3513 | Used during RPE maturation. |
cell scraper | Corning | 08-771-1A | Used during passages. |
cell strainer | Falcon | 352340 | Used during passages before cell count. |