Personnalisés de microéchantillons de peptides pour la détection des allo-anticorps HLA dans la Transplantation d’organes

Résumé

Incompatibilités dans les séquences antigen (HLA) leucocytaire humain entre donneur d’organe et de paires de destinataire sont la principale cause de rejet humoral dans la transplantation d’organes. Nous présentons ici l’utilisation de tableaux d’antigène personnalisés qui sont basées sur les séquences de HLA de donateurs individuels pour sonder des allo-anticorps d’anti-donneurs HLA chez des receveurs d’organes.

Résumé

Transplantation d’organes, la fonction et la longévité de la prothèse critique s’appuient sur le succès de contrôler la réactivité immunologique de rejet contre les antigènes des leucocytes humains (HLA). Histocompatibilité lignes directrices sont fondées sur des tests de laboratoire de l’immunité anti-HLA, qui présente en tant que la préexistant ou de novo généré anticorps HLA qui constituent un obstacle majeur de la transplantation. Les tests actuels sont construits sur une plate-forme unique-antigène perles (SAB) en utilisant un ensemble fixe d’antigènes HLA ~ 100 présélectionnés pour sonder les sérums de transplantation. Cependant, chez les humains, il existe une variété beaucoup plus grande de types HLA, avec aucun deux individus autres que les jumeaux identiques qui peuvent partager la même combinaison de séquences HLA. Alors que les technologies de pointe pour le typage HLA et le séquençage direct peuvent capturer précisément toute inadéquation dans la séquence d’ADN entre un donneur et HLA du receveur, le dosage de la SAB, en raison de sa variété limitée dans la représentation de la séquence, est incapable de détecter avec précision allo-anticorps spécifiquement contre le donneur HLA des incompatibilités. Nous avons cherché à développer une méthode complémentaire à l’aide d’une technologie différente pour détecter et caractériser les anticorps HLA anti-bailleurs de fonds sur une base personnalisée. L’outil de dépistage est un tableau personnalisé de peptide de séquences de donneur HLA-dérivées pour sonder post-transplantation sérums du receveur orgue pour évaluer le risque de rejet humoral. Sur un tableau unique pour une paire de donateur-bénéficiaire, jusqu'à 600 peptides uniques sont prises en fonction sur les séquences de protéines HLA du donneur, chaque peptide transportant au moins un résidu ne correspondent pas dans une séquence d’acides aminés 15. Dans nos expériences pilotes pour comparer les modèles d’antigène pour pré et post-transplantation sérums sur ces tableaux, nous avons pu détecter des signaux anti-HLA avec la résolution que nous a également permis d’identifier les épitopes immunitaires impliqués. Ces personnalisés tableaux antigène faire une détection à haute résolution de des épitopes spécifiques donneur HLA dans la transplantation d’organes.

Introduction

Thérapie de remplacement d’orgue qui est systématiquement menée à travers le monde a sauvé des millions de vies. Transplantation d’organes solides se produit dans environ 100 patients par million de personnes aux Etats-Unis chaque année, alors qu’un plus grand nombre encore sont sur listes d’attente pour recevoir des organes du donneur en raison d’une grave pénurie d’approvisionnement (selon les informations fournies par l’organe Approvisionnement et Transplantation Network - OPTN/UNOS : optn.transplant.hrsa.gov). Transplantation d’organe est fortement réglementée afin de réduire le gaspillage de l’orgue et de sauver des vies, mais les outils scientifiques utilisés po....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par la Northwestern University Institutional Review Board (IRB protocol #: STU00104680). Un flux de travail global du protocole est illustrée à la Figure 1.

1. analyse bioinformatique du donneur et receveur HLA séquences

1. récupérer les séquences de base de données IMGT/HLA ¹⁵.
   1. Rapports typage HLA obtenir du don d’organe et l’accès à son destinataire.
      NOTE : S’assurer que les procédures appropriées pour protéger les dossiers médicaux confidentiels sont utilisés. En règle générale, un agrément de Institutional Revi....

Résultats

Dans l’étude originale en utilisant le tableau¹⁷de la méthode de dépistage, nous avons inscrit un total de 5 sujets de greffe de rein. Nous avons obtenu le HLA typage des résultats de notre cohorte et de leurs bailleurs de fonds respectifs. Leurs antécédents médicaux et les titres d’anticorps allélique de CCS essais étaient également à notre disposition. Dans notre étude pilote de ces 5 patients, nous avons mis au point deux méthodes différentes : un tableau standa.......

Discussion

La conception du tableau SPOT décrit ici est pour une étude expérimentale de la spécificité des alloanticorps dans la transplantation contre les antigènes HLA du donneur de l’organe. Contrairement à l’essai de SAB existante, largement utilisé en clinique, la méthode array et antigène a un avantage majeur dans sa conception flexible pouvant accueillir les séquences HLA vrais du donateur individuel. La nouvelle plateforme exploite le potentiel de la technologie de séquençage ADN essor rapide qui sera bientôt en mesure de p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réseau de peptides	INTAVIS Bioanalytical Instruments
Éthanol	Sigma-Aldrich	E7023
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170
Lait écrémé	Bio Rad Laboratories	1706404
TBST	Santa Cruz Biotechnology	10711454001
IgG anti-humaines de chèvre. HRP  ;	ThermoFisher Scientific	A18811
Clarity Western ECL	Substrate Bio Rad Laboratories	1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientifics	21059
Système d’imagerie sur gel ChemiDoc	Bio Rad Laboratories	1708265  ;