Caractérisation biochimique et structurelle de l’hydrate de carbone Transport substrat-GRB2 SP0092

Résumé

Un protocole simplifié permettant d’effectuer une caractérisation biochimique et structurelle vaste une protéine de liaison du substrat glucidique de Streptococcus pneumoniae est présenté.

Résumé

Développement de nouveaux antimicrobiens et de vaccins pour Streptococcus pneumoniae (pneumocoque) sont nécessaires pour enrayer l’augmentation rapide de souches résistantes aux multiples. Protéines de liaison des substrats glucidiques (SSPE) représentent des cibles viables pour le développement de vaccins à base de protéines et de nouveaux antimicrobiens en raison de leur localisation extracellulaire et la centralité de l’importation de glucides pour le métabolisme contre le pneumocoque, respectivement. Décrit ici est un protocole intégré rationalisé pour effectuer une caractérisation complète de SP0092, qui peut être étendu aux autres glucides SSPE du pneumocoque et d’autres bactéries. Cette procédure peut aider à la conception basée sur la structure des inhibiteurs pour cette classe de protéines. Présenté dans la première partie de ce manuscrit sont des protocoles d’analyse biochimique par analyse de décalage thermique, multi angle de diffusion de la lumière (MALS) et taille d’exclusion stérique (SEC), qui optimisent la stabilité et l’homogénéité de l’échantillon réalisé à essais de cristallisation et donc améliorent la probabilité de succès. La deuxième partie de cette procédure décrit la caractérisation des cristaux à l’aide d’une source de rayonnement synchrotron faisceaux de longueur d’onde accordable diffraction anormale et protocoles de collecte de données pour données de mesure qui peuvent être utilisées pour résoudre les protéines cristallisées SBP structure.

Introduction

S. pneumoniae (pneumocoque) est une bactérie Gram positive résidant de façon asymptomatique dans les voies aériennes supérieures de l’appareil respiratoire humain avec la possibilité de migrer vers des niches normalement stériles provoquant l’otite moyenne, pneumonie, septicémie, septicémie, et méningite^1,2. Par ailleurs, l’infection à pneumocoques est la principale cause de la pneumonie extra-hospitalière, qui contribue à une charge clinique et économique dans le monde entier^3,4. Des souches résistantes aux antibiotiques de S. pneumoniae sont répandues à travers le monde et même si un 7-valent et un vaccin conjugué antipneumococcique protéine de treize-valent ont contribué à réduisent le taux de résistance aux antimicrobiens, des souches de remplacement de utilisation du vaccin ont émergé et ont conduit à des exigences accrues pour la recherche dans le développement de nouveaux traitements pour les maladies pneumococciques^5,6,7,8.

Le pneumocoque dépend de sucres importés de l’hôte comme un de^9,de la source de carbone¹⁰; en effet, il consacre 30 % de ses mécanismes d’importation pour le transport de 32 différents glucides^11,12,13. Ces importateurs comprennent au moins huit transporteurs ABC¹³. Dans les transporteurs ABC, les SSPE extracellulaires jouent un rôle fondamental dans la détermination de la spécificité pour le ligand et de le présenter au transporteur membranaire intégré pour l’absorption dans la cellule. SSPE représente des cibles valides pour la conception de nouveaux vaccins et antimicrobiens parce qu’ils sont des protéines de surface et leur rôle essentiel dans les processus cellulaires.

Caractérisation des protéines cibles et description détaillée des caractéristiques structurelles, comme les poches de ligand et flexibilité inter-domaines, constituent un outil utile pour médicament basée sur la structure conception^14,15. Cristallographie aux rayons x est la méthode de choix pour la caractérisation de protéines à proximité de résolution atomique, mais le processus de cristallisation est imprévisible, chronophage et pas toujours réussis. Méthodes systématiques ont amélioré le taux de réussite et facteurs importants sont la qualité et la stabilité. Le taux de réussite de cristallisation est influencé par les propriétés chimiques de protéine et la méthodologie de préparation d’échantillon. L’effet de ces peut être évaluée et informé par caractérisation biochimique^16,17.

Une autre complication pour la conception basée sur la structure est le problème de phase cristallographique, qui doit être abordé. Comme plusieurs structures protéiques sont devenus disponibles, plusieurs structures peuvent être résolus par la méthode de remplacement moléculaire, qui requiert une structure homologue¹⁸. Comme SSPE présente une structure de domaine flexible, remplacement moléculaire peut également s’avérer difficile¹⁹. Si un modèle de structure qui est assez similaire à la protéine cible n’est pas disponible, un certain nombre de techniques permet d’obtenir le "phasage" experimental²⁰. Parmi celles-ci, la méthode de Dispersion anomale simple-longueur d’onde (SAD) a émergé comme la principale technique et a été largement utilisée pour résoudre le problème de phase²¹. L’utilisation de la méthode triste a été plus avancée avec des améliorations dans les matériels et logiciels, ainsi que des stratégies de collecte de données permettant la détection et l’utilisation de faibles signaux anormaux pour l’élimination de^{22,23, 24}. par ailleurs, les progrès dans les méthodes directes pour résoudre les structures des macromolécules, qui, dans le passé, tenu des données de diffraction à résolution atomique, peut maintenant être utilisé en combinant par exemple, les connaissances stéréochimique tel qu’implémenté dans le programme ARCIMOLDO²⁵. Un examen utile des méthodes pour résoudre le problème de phase en cristallographie est donné par Taylor²⁶.

Nous présentons ici un protocole rationalisé pour la caractérisation du transport glucides SBP, SP0092 de S. pneumoniae, intégrant des techniques biochimiques et structurales (Figure 1). Ce protocole étape par étape fournit un scénario de test exemple utile des stratégies visant à améliorer le taux de réussite des études structurales sur SSPE en général, que l'on retrouve dans tous les royaumes de la vie. En particulier, le protocole met en évidence l’importance de la caractérisation de l’État oligomère plus stable de la protéine en solution dans une méthode rapide et efficace et permet d’identifier les meilleures espèces pour le suivi des expériences de cristallisation. Bien qu’il n’y a plus de 500 structures SBP signalés dans la Protein Data Bank²⁷, remplacement moléculaire peut être difficile en raison de la souplesse inhérente des deux domaines α/β, qui sont reliés par une charnière région¹⁹. Ainsi, la deuxième partie du protocole décrit l’utilisation de la méthode triste pour l’élimination des ions métalliques liés, qui est commun au SSPE, ainsi que l’incorporation de la sélénométhionine et utilisation du sélénium (Se) dans triste progressive.

Protocole

Remarque : la séquence codante pour lequel le peptide signal est supprimé est clonée dans le vecteur pOPINF selon un protocole standard de dans-fusion ; la protéine native est exprimée comme une fusion His-tag dans les cellules d’Escherichia coli BL21 Rosetta ^{28 , 29}. la sélénométhionine étiqueté variante est exprimée suivant les méthodes standard selon le fabricant ³⁰. Le recombinant SBP est purifiée comme précédemment décrit ^{31 , 32}.

1. caractérisation biochimique

1. thermique passer test
   1. solutions tampons préparer 48 avec un pH allant de 4.0 à 9,5 et concentration en NaCl de 0 à 0,5 M et administrer 40 µL dans une plaque à 96 puits, comme décrit dans Tableau 1 ³³.
   2. Ajouter à chaque bien 5 µL de la solution SBP à concentration 1-2 mg/mL.
   3. Ajouter à chaque bien 5 µL de 20 x tache fluorescente pour des protéines (voir Table des matières).
   4. Mélanger les solutions en pipettant également, sceller la plaque à l’aide d’un film adhésif transparent et faire tourner pendant 2 min à 112 x g à la température ambiante.
   5. Exécuter l’expérience sur une machine en temps réel : une rampe de température de 3 ° C/min de 4 à 99 ° C avec un temps de maintien s 10 et lire la fluorescence tous les 0,5 ° C avec excitation à 483 nm et d’émission à 568 nm.
   6. Analyser les courbes d’émission de fluorescence pour chaque condition de tampon, déterminer la température de fusion (T _m) étant le minimum de la dérivée.
      Remarque : Cette procédure donne une bonne indication de la meilleure solution tampon pour aider à l’amélioration de la stabilité des protéines. Choisissez les pH et la concentration en sel basée sur l’état de la mémoire tampon avec la plus haute T _m et ajoutez 2,5 % (v/v) de glycérol et de 0,5 mM de tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) pour définir la solution tampon pour les étapes suivantes (SEC-tampon).
2. MALS et analytique SEC
   1. effectuer un lavage du volume de deux colonnes de la colonne de filtration de préemballages gel avec de l’eau filtrée dégazé (utiliser une colonne de 24 mL gamme poids moléculaire).
   2. Connecter la colonne au niveau du détecteur de diffusion de la lumière et équilibrer la colonne avec le tampon SEC déterminé de l’analyse de décalage thermique.
   3. Injecter 100 µL de SBP purifiée à 5 mg/mL dans le milieu SEC colonne et flux une colonne volume du SEC-tampon.
   4. Vérifier le chromatogramme d’élution unique ou plusieurs pics et examiner les données de diffusion en utilisant le logiciel d’analyse, obtention de la masse molaire et l’indice de polydispersité pour toutes les espèces.
      Remarque : Pour chaque pic correspond à une espèce oligomérique, il est utile de vérifier la polydispersité indice calculé comme la masse molaire pondérée sur masse/molaire masse pondérée en fonction du nombre de molécules (Mw/Mn). Une valeur de polydispersité proche de 1 indique un pic monodisperses.
      Remarque : Une fois que toutes les espèces d’oligomérisation sont définies, il est utile d’étudier leur dépendance sur la concentration des protéines, que des concentrations plus élevées pourraient favoriser la plus grande formation de l’oligomère.
   5. Exécuter les essais analytiques multiples de SEC ; injecter 100 µL de SBP purifiée à l’augmentation des concentrations (0,1 - 10 mg/mL) dans la colonne de filtration gel équilibré (utiliser une colonne de 5 mL de poids moléculaire de gamme) et couler un volume de colonne de SEC-tampon chaque fois que.
   6. Vérifier le chromatogramme d’élution unique ou plusieurs pics et d’analyser les intensités de l’absorbance à 280 nm des courbes correspondant à différentes concentrations de protéine départ. Si les intensités relatives des différents sommets restent constantes, alors aucune conversion inter entre l’espèce oligomérique n’est présente. Variation des intensités relatives à différentes concentrations est une indication de l’interconversion entre différentes espèces d’oligomères qui dépend de la concentration de protéine.
      Remarque : Cette étape de caractérisation est fondamentale pour définir quelles espèces sont plus adaptés pour la cristallisation. En effet, espèces distinctes monodisperses sont plus enclins à se cristalliser si elles sont dans un état stationnaire oligomère à une concentration définie.

2. Préparation de la protéine et de cristallisation

1. préparative SEC
   1. après un volume de colonne lavage avec de l’eau filtrée dégazé, équilibrer avec un tampon SEC la colonne de filtration préparative en gel pré-emballés (un éventail moléculaire poids 120 mL colonne).
   2. Injecter 1 à 5 mL de SBP purifiée à 5-50 mg/mL dans le volume équilibré gel de filtration colonne et flux d’une colonne de tampon SEC.
   3. Recueillir la colonne intermédiaire dans les fractions de 1 mL.
   4. Mettre en commun les fractions correspondant à un pic unique monodispersés ; tourner l’échantillon dans les filtres de centrifugation de 15 mL à 1 500 g et quantifier la concentration jusqu'à ce que la concentration désirée est atteinte (généralement de 50 à 100 mg/mL pour SP0092).
2. Cristallisation
   1. déterminent la plage de concentration optimale pour l’expérience de cristallisation en utilisant le Test de cristallisation préalable telle que décrite par le fabricant :
      1. distribution 0,5 - 1,0 mL de chacun de l’essai de quatre cristallisation des solutions dans un réservoir différent d’une séance de 24 puits chute plaque cristallisation.
      2. Préparer les gouttes de cristallisation en mélangeant 1 µL de solution de protéine avec 1 µL de solution de réservoir sceller la plaque et incuber à température ambiante pendant pas moins de 1 h (des résultats plus fiables sont obtenus après une nuit d’incubation).
      3. Vérifier la qualité de la goutte pour chaque concentration à l’aide d’un microscope à grossissement 10 x.
         Remarque : Vérifier la concentration de protéines différentes au moins trois : (I) la plupart des gouttes restant clair indiquent que la protéine est trop diluée pour la cristallisation ; (II) la présence de précipité lourde dans la majorité des gouttes implique une concentration trop élevée ; et (III) un équilibré apparition des gouttes claires et précipité (mieux si léger) est une bonne indication que la concentration d’essai est favorable pour la cristallisation.
   2. Préparer la chute de 96 puits séance plaques de cristallisation ; déposer 100 µL de solution de cristallisation commerciale différente dans chaque réservoir bien ^{34 , 35 , 36 , 37}.
   3. distribuer 100 ml d’échantillon de protéine à la concentration définie précédemment (étape 1.1.6) dans tous les puits de chute de cristallisation à l’aide d’un système robotisé de cristallisation.
   4. Distribuer 100 nL du réservoir différent solutions pour la cristallisation correspondante drop puits se mêler à la protéine distribué au cours de l’étape 2.2.3. La flasque de cristallisation pour éviter l’évaporation et de permettre à l’équilibration de la goutte de cristallisation avec le réservoir.
   5. Vérifier périodiquement les gouttes (initialement chaque 1-2 jours, plus tard chaque semaine) à l’aide d’un x 10 (au moins) microscope grossissement pour évaluer la croissance et la formation de cristaux.
      NOTE : Un système automatisé d’imagerie pour la cristallisation de protéines peut être utilisée pour les gouttes visualisation et en capturant.

< classe p = j «ove_title "> 3. Caractérisation de cristal et de collecte de données de rayons x

montage

1. cristal
   1. Préparez la solution de cryoprotecteurs en ajoutant 25 % (v/v) de glycérol (concentration finale) à la condition de cristallisation (remplaçant ainsi 25 % de l’eau dans le rapport initial mélange) ³⁸.
   2. Remplir une mousse dewar avec azote liquide et placez la partie d’enceinte échantillon d’une rondelle-uni dans le dewar. Laisser refroidir à la température de l’azote liquide.
   3. Couper et enlever l’étanchéité ruban adhésif de la plaque de cristallisation sur la baisse lorsque les cristaux sont forment.
   4. Mettez une goutte de 1 µL de solution cryoprotecteur sur un coverslide positionné à proximité de la chute de la cible.
   5. Transférer le cristal sélectionné dans la liste déroulante originale à la chute de substances cryoprotectrices solution utilisant une cryo-boucle de nylon sur une base standard de colonne vertébrale, montée sur une baguette magnétique ^{39 , 40}.
   6. Transférer rapidement le cristal dans la liste déroulante cryoprotecteur à azote liquide, en plaçant la boucle dans la première position vide du porte-échantillon et uni-puck.
   7. Répéter (à partir de l’étape coupe de ruban étanchéité) jusqu'à ce que tous les cristaux désirées sont récoltées et stockées dans le porte-échantillon uni-puck.
   8. Place l’uni-puck baser sur l’uni-rondelle à l’aide de la baguette de la rondelle et prendre la rondelle à la source de rayonnement (dans des conditions de l’azote liquide).
      ATTENTION : Extrêmement basse température !
   9. Utiliser les cryo-pinces et la rondelle outil chargement dewar pour charger l’uni-puck(s) dans le robot de changeur d’échantillon beamline dewar. Le porte-échantillon uni-puck se détachera du couvercle base laissant les détenteurs de boucle échantillon verticalement dans le robot échantillon dewar et donc exposées à l’azote liquide et accessible au robot changeur échantillon.
2. Caractérisation Crystal
   Remarque : les cristaux récoltés peuvent ensuite projetés pour la qualité de la diffraction en utilisant soit une source de rayons x de laboratoire ou à une source de rayons x de rayonnement synchrotron (SR). Faisceaux de cristallographie macromoléculaire (MX) fournit une source d’énergie accordable pour exploiter la diffraction anormale pour la solution de la structure. Dans la section suivante, une série d’instructions de travail en ligne avec les fonctionnalités expérimentales de faisceaux de lumière Diamond Light Source MX est proposée, mais ces lignes directrices adaptable aussi à ces faisceaux MX à autres synchrotrons dans le monde entier.
   1. Dans un premier temps, il est utile confirmer ou identifier des diffuseurs anormales dans le cristal. Ceci peut être facilement réalisé en mesurant un spectre de fluorescence de rayons x de cristal. Assurez-vous d’abord que l’énergie des rayons x de la source de rayonnement a la valeur suffisamment élevée pour exciter tous les éléments attendus généralement pour les cristaux macromoléculaires (14 keV ou version ultérieure).
   2. Utiliser le logiciel de contrôle de source de rayonnement pour choisir l’échantillon pour être monté par le robot de changeur d’échantillon ; la boucle sera automatiquement centrée dans le faisceau de rayons x et le centrage de cristal peut être confirmé manuellement en utilisant le logiciel de contrôle de source de rayonnement.
   3. Enregistrer un spectre de fluorescence de rayons x en utilisant le logiciel de contrôle de source de rayonnement : l’utilisateur sélectionne un temps de pose et initie la mesure (réglage du spectre de Fluorescence/Fluorescence, → exécuté, Figure 2 a). Le logiciel de contrôle de source de rayonnement positionne automatiquement la radiographie détecteur de fluorescence en place et détermine l’incident minimale des flux de rayons x pour obtenir un signal lisible sur le détecteur de fluorescence. Le spectre acquis est ensuite analysé de façon automatisée avec des pics d’émission montés d’origine naturelle des éléments biologiques. Ces routines sont disponibles dans la source de rayonnement contrôle logiciel interface utilisateur graphique (GUI) - GDA (www.opengda.org) à notre société et à synchrotrons dans toute l’Europe ^{41 , 42}.
   4. Si les éléments appropriés sont identifiés qui peuvent être exploitées pour une expérience de diffraction anormale, exécuter une analyse d’énergie x-ray absorption bord pour déterminer la longueur d’onde optimale pour la collecte des données de diffraction anormale de la crystal : sur la ligne de faisceaux maitrise des logiciels, sélectionnez l’élément et lancer le scan (Fluorescence/Fluorescence Scan réglage, → nom de l’atome, → exécuté, Figure 2 b).
      Remarque : Pour une expérience unique de diffraction anormale, le sommet de l’arête de l’absorption est utilisé pour maximiser la dispersion anomale. Des considérations expérimentales permettant d’effectuer une expérience de diffraction anormale multi-longueur d’onde ont été précédemment détaillées ⁴³.
   5. Pour déterminer les paramètres de cellule unité crystal, la symétrie et la limite de diffraction, mesure trois diffraction de rayons x à des intervalles de 45° à l’aide de la méthode d’oscillation (Data Collection/dépistage → Run actuel, Figure 2). Le logiciel de contrôle de source de rayonnement fournit à l’utilisateur un choix de l’angle d’oscillation et temps d’exposition et la possibilité de définir la transmission pourcentage du faisceau de rayons x. Pour une projection de cristal standard, un angle d’oscillation de 0,5 °, un temps de pose de 0,5 s et 5 % aux rayons x faisceau de transmission sont recommandés. Les images de diffraction mesurés sont automatiquement analysés par le pipeline d’EDNA et renvoyer un ensemble de stratégies pour la collecte d’un ensemble de données complet ²².
3. X-ray de collecte de données
   Remarque : l’utilisateur peut sélectionner pour collecter des données en mode oscillation standard ou faisceau inverse, qui permet aux compagnons de Friedel à enregistrer proches dans le temps et la dose de rayons x et ayant approximativement le même comportement d’absorption ce qui permet une mesure plus précise des différences anormales. Ce dernier est utile surtout si petites différences anormales sont attendus et/ou les échantillons sont rayonnement sensible lorsqu’on effectue une expérience de diffraction anormale. Considérations sur les meilleures stratégies de collecte de données à utiliser ont été complètement révisé ^{22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47}.
   1. en utilisant le logiciel de contrôle de source de rayonnement, importer les paramètres de collection de données tel que suggéré par le programme de stratégie qui fournira :
      i. position de départ de l’axe de rotation ω
      ii. Largeur de oscillation de la ω-axe de rotation d’angle pour chaque image de diffraction
      iii. Temps d’exposition pour chaque image de diffraction
      iv. Nombre d’images pour un ensemble de données complet (indirectement en définissant l’angle de rotation totale ω-axe pour la collecte de données entière)
      c. pourcentage d’atténuation du faisceau de rayons x pour éviter d’endommager une surexposition et rayonnement
      Remarque : dans notre établissement, pour la collecte de données en cours d’exécution, les pipelines de logiciels pour le traitement automatisé des données recueillies sont bien établis : (i) la diffraction données sont réduites (indexée, intégrée et à l’échelle) par le pipeline de xia2, qui génère des fichiers de mtz de réflexion pour l’utilisateur comme entrée pour l’élimination progressive et la structure de solution/raffinement ⁴⁸. (ii) lorsqu’un important signal anormal est détecté pendant l’analyse de données, un premier pipeline de solution rapide structure automatisé (fast_ep) en utilisant SHELX tente de résoudre la structure de l’atome lourd par expérimentale progressive, fournissant une carte de densité électronique progressive Lorsque cela est possible. Un deuxième pipeline de solution structure plus complète automatiquement s’engage les tentatives de résoudre et de construire la structure en utilisant des logiciels indépendants suites ^{49 , 50 , ,} du ^{51 52} ; dans les cas où cela est réussie, l’utilisateur fournira avec une carte de densité électronique et du modèle initiale. Ceci fournit la base pour l’utilisateur de compléter de raffinement et de valider le modèle avec les suites de logiciel cristallographique de choix.

Résultats

Ce protocole intégré s’est avéré pour être efficace avec quatre (deux publiés et deux inédits structures) de glucides six contraignant protéines cibles contre pneumocoque analysés à ce jour^32,53. Dans cette section, nous présentons la caractérisation biochimique et structurelle de SP0092 comme un résultat représentatif pour orienter les études structurales de SSPE en général.

Après le SP0092 de SBP a été exprimé et purifié défini précédemment³², la protéine purifiée a été analysée pour la stabilité de tampon à l’aide d’une analyse de décalage thermique : SP0092 montre une augmentation T_m à pH 6,5 et en présence de NaCl dans le 0 - 0,2 M plage de concentration (Figure 3 a). Dans ce contexte, la solution de tampon pour les étapes suivantes a été définie comme : 0,02 M MES pH 6.5, 0,2 M NaCl, 2,5 % (v/v) de glycérol, 0,5 mM TCEP. La masse molaire absolue des États différents de l’oligomérisation de SP0092 a été mesurée par MALS couplé à SEC mesure un poids moléculaire de 187,2 140,8, 97,0 et 49,4 kDa, correspondant à l’espèce de monomère, dimère, trimère et tétramère, respectivement () Figure 3 b). L’analyse du profil SEC à des dilutions différentes protéines ont révélé que l’oligomérisation est déclenchée par la concentration de protéines accrue, ce qui suggère que les oligomères plus gros sont plus stables à des concentrations plus élevées que généralement utilisé dans les cristallisation. En effet, les plus grandes espèces oligomériques purifiées réalisé aux essais de cristallisation, des cristaux de protéine produite avec succès tandis que le monomère espèces n’ont pas.

Les cristaux optimisé provenant de l’indigène et Se-méthionine marquée des formes de SP0092 ont été caractérisés par diffraction des rayons x. Mesure de la fluorescence de rayons x de ces cristaux a révélé dans les deux cas les pics d’émission pour Zn étant liée à la protéine, alors que S’a été détectée seulement pour les cristaux Se-méthionine comme prévu. Plus tard, les scans d’absorption des rayons x sur les bords Se et Zn ont été effectuées, qui ont fourni des données expérimentales directes pour régler la longueur d’onde des rayons x incident jusqu’aux bords de l’absorption des rayons x respectifs du Zn ou Se présentent dans les cristaux pour optimiser le signal anormal peut être obtenu d’après les données qui en résulte (Figure 4 a–B).

Après avoir mesuré trois patrons de diffraction à faible transmission, un ensemble complet de données anormal a été obtenu à l’aide de la stratégie de collecte de données proposée par EDNA (Figure 4). Le signal anormal déclenche le pipeline "phasage" automatisé à la source de rayonnement pour déterminer la structure secondaire, et d’après les premières phases expérimentales dérivées, produit initial cartes et modèles, qui peuvent ensuite être affinées et validés (Figure 4 ).

En résumé, les pièges potentiels de cette technique sont centrées principalement sur la qualité et la disponibilité de crystal. Optimisation des conditions tampon pour améliorer la stabilité de la protéine ainsi que l’identification de l’État oligomère plus approprié de la protéine à utiliser, lorsque plus d’un oligomère est indiqué dans la solution, peut réduire le risque de défaillance à la cristallisation stade. Exploiter l’utilisation des ions métalliques liés identifié à un stade précoce peut accélérer solution de structure et d’éviter la production inutile de la sélénométhionine protéines marquée lors de l’échouent des méthodes de remplacement moléculaire.

Figure 1. Diagramme de flux de travail pour la caractérisation biochimique et structurelle des glucides SSPE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Caractérisation de cristal dans GDA. (A) capture d’écran de l’onglet de contrôle de fluorescence de rayons x du logiciel de contrôle beamline GDA. (B) capture d’écran de l’onglet de contrôle aux rayons x énergie bord-scan à GDA. (C) capture d’écran de l’onglet données de collection crystal dépistage GDA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 3. Caractérisation biochimique de SP0092^39-491. Graphique en 3D de la surface (A) traçant la température de fusion de SP0092^39-491 en fonction du pH et la concentration en NaCl de la solution tampon. (B) SEC et MALS résultats pour SP0092^39-491. Absorption à 280 nm est affiché en bleu. Les masses molaires des États différents oligomérisation figurent en rouge. Panneau (B) a été modifié par³². S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 4. La caractérisation structurale de SP0092^39-491. (A) et (B) x-ray absorption énergétique scan au bord Zn et Se pour SP0092^39-491 cristaux. La fluorescence mesurée du Zn et Se contenant des cristaux apparaît en bleu et cyan, le calculé f' et f » dispersion anomale fractions sont en vert et rouge, respectivement. (C) exemples de diffraction de rayons x provenant de cristaux de SP0092^39-491 . (D) représentation de la structure de dimère de^39-491 SP0092 de dessin animé. Un protomère est de couleur blanc et l’autre magenta (résidus 39-366) et violet (résidus 367-491), et les atomes de diffusion anomale apparaissent comme des boules de bleus et cyan pour Zn et Se, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

0,1 M acide citrique pH 4.0

0,1 M acide citrique pH 4.5

0,1 Phosphate de M pH 5.0

0,1 M pH de Citrate 5,5

0,1 M Bis-tris pH 6

0,1 M pH de ADA 6,5

0,1 vadrouilles de M pH 7

0,1 M pH de HEPES 7,5

0,1 M pH d’Imidazole 8.0

0,1 M Tris pH 8,5

0,1 M pH CHES 9

0,1 M pH de CHES 9,5

NaCl 0 M

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0.1 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,2 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 0,5 M de NaCl 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL

Le tableau 1. Composition du tampon pour analyse de décalage thermique.

Discussion

Dans cet article, nous décrivons et valider un protocole intégré pour la caractérisation biochimique et structurel des glucides SSPE avec un accent spécifique sur les protéines de S. pneumoniae. Néanmoins, cela peut servir comme une procédure standard pour l’analyse des autres SSPE de différents organismes et même d’autres protéines solubles non apparentés.

La première partie du Protocole se concentre sur la fourniture d’informations biochimiques sur la stabilité des protéines et la structure quaternaire, qui peut être exploitée dans la préparation des échantillons de protéines pour la cristallisation. Dans la section d’essais de décalage thermique, nous décrire seulement le pH et les variations de concentration de NaCl pour maintenir la nature générale de cette procédure. Malgré cela, beaucoup d’autres problèmes de mémoire tampon peut être testés de façon similaire, par exemple, y compris tout composé chimique utilisé comme un additif de stabilisation : en particulier la toute réelle qui se lie à une péritonite bactérienne spontanée spécifique est remarquablement efficace pour augmenter la T_m de quelques degrés Celsius³¹. Dans certains cas, les courbes de dénaturation peuvent être mal définies en raison de la faible signal ou un fond de fluorescence élevée, qui est causé par l’agrégation des protéines ou partielles qui se déroulent. Pour éviter cela, un titrage de protéine : colorant peut être effectué afin d’optimiser les courbes dénaturants pas clairs. Si aucune amélioration n’est obtenue, dépistage de différents additifs qui peuvent améliorer la stabilité de la protéine est conseillée, et écrans appropriés ont été décrites précédemment⁵⁴.

Généralement, la plupart SSPE est monomère dans leur milieu naturel, mais comme indiqué ici multimerization peut se produire à l’utilisé dans des expériences de cristallisation des concentrations plus élevées, la caractérisation du comportement oligomérisation fournie par MALS et SEC est donc essentiel pour évaluer l’état d’oligomérisation monodispersés stable plus favorable pour la cristallisation. Néanmoins, il est difficile de prévoir l’effet de différents produits chimiques inclus dans la condition de la cristallisation sur le comportement de l’oligomérisation des protéines. Si l’examen de la SEC et MALS montre une agrégation de l’échantillon de protéines, nous conseillons ce qui suit afin de réduire la probabilité cela se produise : utiliser l’échantillon de protéine fraîche (ne pas gel-dégelé) et d’élargir l’analyse du stabilisation thermique essais, tests additifs possibles et un détergent doux comme dernière ressource, pour réduire au minimum l’agrégation. Dans cet article, nous présentons des directives de base pour la cristallisation à l’aide de dépistage cristallisation commercial haut débit matrices creuses pour maintenir le caractère général du présent protocole. Toutefois, obtenir des cristaux de protéine de diffraction de rayons x à haute résolution faudra peaufiner itérative pour optimiser les conditions de cristallisation en ce qui concerne la concentration precipitant, pH, ajout d’additifs chimiques, températures différentes, et autres facteurs d’évolution dynamique d’équilibre entre le crystal drop et réservoir^16,17.

La deuxième partie du protocole décrit la caractérisation des cristaux de protéines afin de définir la stratégie optimale pour la collecte de données de diffraction des rayons x avec un accent particulier sur l’acquisition de données anormales de triste élimination progressive. Même si SSPE maintenir une architecture générale similaire (et il y a beaucoup de structures 3D déposé potentiellement utilisable comme modèles de départ), élimination progressive de ces protéines par la méthode de remplacement moléculaire n’est pas toujours simple en raison de la variabilité de la les éléments de structure secondaire et la souplesse intrinsèque de ces protéines. Par conséquent, nous proposons la méthode triste et mettre en évidence que ces protéines peuvent déjà avoir intrinsèquement lié métaux ou en effet non-spécifiques de métaux aux conditions de tampon de cristallisation, qui peuvent fournir une gamme d’éléments diffractants anormaux tels qu’un étape standard dans notre protocole général.

En conclusion, ce protocole définit un flux de travail standard guidée de procédures permettant la description détaillée des caractéristiques biochimiques et structurales de SSPE qui peut être exploitée pour accroître le taux de réussite de détermination de structure, en plus d’accélérer la caractérisation structurale de SSPE en général.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SélénoMéthionine Milieu Dimensions Moléculaires Complètes		MD12-500	Basé sur un milieu minimal synthétique M9 complété par du glucose, des vitamines et des acides aminés à l’exception de la L-méthionine. D’autres produits équivalents sont disponibles dans le commerce par d’autres sociétés.
Plaque optique MicroAmp à 96 puits	Applied Biosystems	4306737	La plaque de réaction optique à 96 puits avec code-barres d’Applied Biosystems est optimisée pour offrir une précision et une uniformité de température inégalées pour une amplification PCR rapide et efficace. Cette plaque, fabriquée à partir d’une seule pièce rigide de polypropylène dans un format de 96 puits, est compatible avec Applied Biosystems® ; Systèmes PCR en temps réel à 96 puits et thermocycleurs.
Sondes moléculaires	SYPRO Orange	S6651	La coloration SYPRO Orange Protein Gel est une coloration fluorescente sensible et prête à l’emploi pour les protéines dans les gels 1D. Colorant protéique assez universel et bien établi pour les régions hydrophobes.
Le film adhésif optique MicroAmp	d’Applied Biosystems	4311971	Le film adhésif optique MicroAmp d’Applied Biosystems réduit le risque de contamination de puits à puits et d’évaporation de l’échantillon lorsqu’il est appliqué sur une microplaque. Il est idéal pour la mesure optique, car il donne un faible bruit de fond.
Système de PCR rapide en temps réel 7500	Applied Biosystems	4362143	Le système de PCR rapide en temps réel Applied Biosystems 7500 permet un cycle thermique à grande vitesse au format standard de 96 puits, réduisant considérablement votre temps d’exécution pour les applications de PCR quantitative en temps réel, fournissant des résultats en 30 minutes environ. Le kit de mise à niveau est disponible pour mettre à niveau un système PCR en temps réel 7500 standard vers la configuration rapide via une installation de service sur site. D’autres machines RT-PCR peuvent être utilisées. L’exportation des données n’est pas facile pour les anciens logiciels d’analyse de données.
Colonne Superdex 200 increase 10/300 GL	Healthcare	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL est une colonne polyvalente et pré-emballée pour la chromatographie d’exclusion stérique dans la purification préparative à petite échelle (mg) ainsi que pour la caractérisation et l’analyse de protéines dont le poids moléculaire est compris entre 10 000 et 600 000, telles que les anticorps. Séparation optimale idéale pour les techniques biophysiques à haute résolution.
DAWN HELEOS II	Wyatt		DAWN HELEOS II est le premier détecteur multi-angle de diffusion statique de la lumière (MALS) pour la caractérisation absolue de la masse molaire et de la taille des macromolécules et des nanoparticules en solution. Le DAWN offre la sensibilité la plus élevée, la plus large gamme de poids moléculaire, de taille et de concentration, ainsi que le plus grand choix de configurations et de modules optionnels pour des capacités améliorées. D’autres systèmes de détection MALS d’autres sociétés que Wyatt n’ont pas été testés, de sorte qu’aucun retour d’information supplémentaire ne peut être fourni.
Superdex 200 5/150 GL	GE Healthcare	28906561	Superdex 200 sont des colonnes de chromatographie d’exclusion stérique préemballées pour les séparations préparatives et analytiques à petite échelle à haute résolution de biomolécules. Superdex 200 a une plage de séparation pour les molécules dont le poids moléculaire est compris entre 10 000 et 600 000. La séparation des pics n’est pas aussi optimale que pour la version « augmentation », mais ce modèle est idéal pour une utilisation standard au quotidien.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade sont des colonnes XK préemballées conçues pour la chromatographie de filtration sur gel préparative à haute résolution.
Plaque de cristallisation à 24 puits « grande »	MiTeGen	XQ-P-24S-A	La « grande » plaque de cristallisation à 24 puits est utilisée principalement pour le criblage de cristaux de protéines par des techniques de diffusion de vapeur de goutte assise et pour l’optimisation des conditions de cristallisation. Il dispose d’un puits réservoir assez grand et d’un récipient d’échantillons, ce qui favorise la manipulation manuelle et la croissance de cristaux de protéines de grande taille. De plus, ses surfaces planes peuvent être facilement scellées à l’aide de ruban adhésif transparent ou de lamelles.
Test de pré-cristallisation PCT	Hampton	HR2-140	Le test de pré-cristallisation PCT est utilisé pour déterminer la concentration de protéines appropriée pour le criblage de cristallisation.
96 puits CrystalQuick	Greiner bio-one	6098xx	Les plaques à puits carrés ont trois puits de cristallisation par réservoir, ce qui permet de tester 288 échantillons par plaque. Généralement utilisé uniquement pour le criblage initial car leur bord carré rend la pêche aux cristaux difficile.
Uni-Puck	Dimensions moléculaires	MD7-601	Le V1-Puck universel (Uni-puck) est un conteneur de stockage et d’expédition de goupilles d’échantillons destiné à être utilisé avec la majorité des systèmes de montage d’échantillons automatisés dans le monde entier - comprend les systèmes ACTOR, SAM et CATS entre autres (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI et à travers les États-Unis)
Standard Foam Dewar	Molecular Dimensions	MD7-35	5,7 » de diamètre par 2,8 » de profondeur. Capacité de 800mL.
CryoLoop monté - 20 microns	Hampton	HR4-955	CryoLoops montés avec nylon de 20 microns de diamètre. Ces boucles en nylon sont collées à des MicroTubes creux en acier inoxydable ; qui sont utilisés pour monter, geler et sécuriser le cristal pendant les procédures cryocristallographiques et la collecte de données de rayons X. Différentes tailles existent et elles peuvent être adaptées en longueur. Ce sont des outils assez polyvalents.
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Outil de chargement Puck Dewar	Dimensions moléculaires	MD7-607	Cet outil est utilisé pour séparer les uni-pucks afin de les charger dans le robot dewar. Il se compose de deux pièces : une pièce de tube en téflon et une partie de tige métallique.