Article de méthode

Ingénierie du tissu cornéen : Un In Vitro modèle des Interactions stroma-nerf de la cornée humaine

DOI :

10.3791/56308

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24 janvier 2018

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1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un roman en trois dimensions in vitro model, où les cellules du stroma cornéens et différenciés de cellules neuronales sont élevées ensemble afin d’aider à l’examen et la compréhension des interactions entre les deux types cellulaires.

Résumé

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Génie tissulaire a acquis une reconnaissance considérable en raison de la forte demande pour les remplacements de la cornée humaine avec environ 10 millions de personnes dans le monde souffrent de perte de vision cornéen1. Pour répondre à la demande de cornées humaines viables, des progrès significatifs dans le tissu en trois dimensions (3D) génie a2,3,4. Ces cornée modèles allant des systèmes monocouche simple aux modèles multicouches, menant à 3D pleine épaisseur cornéenne équivalents2.

Cependant, l’utilisation de la 3D corné tissulaire dans le contexte des modèles in vitro de maladies étudiées à date n’a pas de ressemblance avec la structure multicouche du tissu cornéen 3D, la fonction et la mise en réseau des différents types de cellules (c.-à-d., nerf, épithélium, stroma et l’endothélium)2,3. En outre, la demande pour les modèles de tissus in vitro cornée a augmenté dans le but de réduire l’expérimentation animale pour les produits pharmaceutiques. Ainsi, des modèles plus sophistiqués sont nécessaires afin de mieux correspondre aux besoins physiologiques humaines, les systèmes et le développement d’un modèle qui est plus pertinent à la population de patients est absolument nécessaire. Étant donné que plusieurs types de cellules de la cornée sont touchés par les maladies et les dystrophies musculaires, tels que le kératocône, kératopathie diabétique et Fuchs, ce modèle comprend un modèle 3D de co-culture de fibroblastes cornéens humaines primaires (CS) de donneurs sains et les neurones de la lignée de cellules SH-SY5Y. Cela nous permet pour la première fois étudier les interactions entre les deux types de cellules dans le tissu de la cornée humain. Nous croyons que ce modèle pourrait potentiellement disséquer les mécanismes sous-jacents liés à des interactions stroma-nerf de maladies de la cornée qui présentent des dommages de nerf. Ce modèle 3D reflète la nature fondamentale d’anatomique et physiologique du tissu cornéen in vivo et peut servir à l’avenir comme un outil pour étudier les défauts cornéens ainsi que l’efficacité des divers agents de dépistage avant l’expérimentation animale.

Introduction

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Dans le corps humain, la cornée est un tissu plus densément innervé. Les nerfs sont responsables pour des sensations variées comme le toucher, la douleur, température et ont également un rôle essentiel dans la guérison des plaies, réflexes de cligner des yeux, déchirer la production et la sécrétion5,6,7. Dans la cornée, stromales troncs nerveux proviennent du plexus limbique et entrer dans le stroma cornéen périphérique radialement. L’organisation nerveuse stromales est parallèle aux lamelles de collagène et elles davantage créer une branche en petits fascicules comme ils aller de l’avant vers le stroma superficiel5,8. Les fibres nerveuses plus pénétrer la couche épithéliale et ainsi, innervation est largement étalée dans l’épithélium de la cornée et le stroma. Par conséquent, une innervation a un rôle essentiel dans l’état sain et malade de la cornée. Dans ce protocole, nous révélons la promotion d’un modèle nouveau 3D in vitro , qui est le premier du genre à simuler les interactions de stroma-nerf in vivo . La lignée SH-SY5Y a été utilisée pour cette étude, car il est une des lignes plus établis, bien caractérisés, utilisés pour étudier la croissance neuronale. La lignée SH-SY5Y a été décrite pour produire les deux adhérentes de substrat (type S) et les cellules neuroblastiques (type N) qui peut subir la transdifférenciation9. Ainsi, même si cette lignée cellulaire provient d’une sélection de triple sous-clone successives de cellules de type N, il contient également un petit nombre de cellules de type S capables de subir une différenciation dans les neurones grâce à l’utilisation de retinoic acid et encéphales Neurotrophic factor9. Ceci fournit un outil qui peut conduire à une meilleure compréhension des cornée complications associées de la rétinopathie diabétique (DM) et d’autres maladies oculaires. En raison des difficultés liées à l’obtention et la culture de neurones provenant de patients atteints de maladie oculaire, ce modèle 3D en vitro fournit des conséquences majeures en étudiant les interactions neuronales et la signalisation avec le stroma cornéen.

Conditions de malades affectent souvent divers tissus du corps à très grande échelle, menant à une qualité de vie compromise. Dystrophies oculaires sont des complications fréquentes, souvent associées aux maladies systémiques et conduire à la perte d’acuité visuelle ou une perte de vision voire permanente. Études approfondies sont souvent indispensables pour une meilleure compréhension de la maladie ainsi que les effets au niveau cellulaire basal. Afin d’étudier les effets de ces maladies, les différents modèles in vivo et in vitro ont été développés avec l’aide d’applications en génie tissulaire. Applications d’ingénierie du tissu cornéen ont suscité grand intérêt dans des domaines variés des sciences10,11,12,13,14, mais il y a des limitations majeures subsistent pendant application effective, y compris cornée greffe rejets, infections et cicatrices10,11,12,13,14. Il existe plusieurs études qui ont avec succès développé et mis en place diverses in vitro modèles3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Les modèles 3D in vitro sont les plus prometteurs et d’un grand intérêt scientifique. Les modèles 3D sont connus pour mieux refléter l’in vivo événements cellulaires et physiologiques qui sont essentiels au cours de la fibrose et enroulé de guérison15,27,28,29. Ces modèles in vitro jouent un rôle essentiel dans la recherche de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des différentes pathologies dont les complications cornéennes. Malgré le rôle essentiel de l’innervation en fonctions de la cornée, peu d’efforts accompli pour promouvoir la prolifération des nerfs périphériques au sein des constructions tissulaire cornéenne2,3. Toutefois, les constructions de cellule projet 3D en vitro imitent le tissu cible afin de réaliser la fonctionnalité désirée de tissu.

Kératopathie diabétique est une application évidente pour le modèle décrit ici les défauts neuronale, il y a plusieurs autres maladies de la cornée qui peuvent bénéficier d’un modèle humain in vitro y compris dystrophies kératocône et Fuchs. Notre modèle 3D se dégage de cette perspective et propose le développement d’une représentation in vitro de tissu cornéen pour évaluer l’administration de médicaments et de la sécurité des nouveaux médicaments oculaires.

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Protocole

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Ce protocole suit les directives de la Commission de révision de l’Université d’Oklahoma Health Sciences Center/institutionnel (CISR #4509). Toutes les parties du protocole a rencontré les principes de la déclaration d’Helsinki. Cornée échantillons ont été prélevés de développement National et Research Institute (NDRI) et la Banque des yeux Lions Oklahoma.

1. isolement de cellules primaires

  1. Dès réception des échantillons de tissus cornée humaine, transférer les tissus dans un 21,5 cm2 boîte de Pétri contenant 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco stérile (SPD) (1 x).
  2. Gratter et enlever l’épithélium cornéen en positionnant la cornée dôme face vers le haut. Afin d’assurer l’élimination complète, gratter la couche épithéliale soigneusement à l’aide d’une lame de rasoir à un angle de 45°. Ensuite, retournez la cornée dôme face vers le bas et grattez soigneusement l’endothélium du stroma avec une lame de rasoir à un angle de 45° pour assurer l’élimination complète. Laver le tissu stromal avec le SPD.
  3. Couper les tissus stromales en petits morceaux, à l’aide d’une lame chirurgicale du numéro 10, gardant les morceaux stromales mouillés lors de tous les temps à l’aide de SPD. Ramasser stromales morceaux avec une pince stérile et la place dans une fiole de la culture du T25 sans médias (4 ou 5 morceaux de tissu de 2 x 2 mm par flacon).
  4. Laissez les explants d’adhérer au fond de la fiole à 37 ° C pendant environ 30-40 min. Une fois collé, ajouter lentement le minimum indispensable milieu Eagle (EMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % antibiotique/antimycosique au ballon sans déranger les explants.
  5. Placer délicatement le ballon dans l’incubateur à 37 ° C, 5 % de CO2. Laisser les explants jusqu'à ce que les cellules commencent à isoler et migration dans le ballon. Après environ 2 à 4 semaines, les cellules devraient atteindre 100 % confluence. À la confluence de 100 %, les cellules de passage en enlevant les milieux de culture de tissu et laver les cellules avec le SPD.
  6. Ajouter la trypsine aux cellules et puis les incuber à 37° C. Après environ 5 min, Découvre les cellules sous microscopie pour confirmer qu’ils ont détaché et puis arrêter la protéolyse en ajoutant les supports neufs.
  7. Transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL pour centrifugation à 1 000 x g. éliminer le surnageant soigneusement sans déranger le culot et suspendre les cellules en EMEM frais 10 % BF 1 % aux antibiotiques. Compter les cellules et les graines environ 1 x 106 cellules en flacon de culture T75 pour poursuivre son expansion avec EMEM frais 1 % FBS 1 % aux antibiotiques.

2. primaire CS Culture et assemblage de constructions 3D

  1. Montage 3D constructions d’explants auparavant cultivés en EMEM 10 % BF 1 % antibiotique/antimycosique, passage et comte cs.
  2. Graines environ la 1 x 106 cellules/puits de primaires CS sur inserts membrane en polycarbonate avec pores 0,4 µm des constructions 3D, ainsi que de 1,5 mL de EMEM frais 10 % BF 1 % antibiotique/antimycosique jusqu’au sommet de la construction. Ajouter un autre 1,5 mL de ces mêmes médias au fond de chaque construction.
  3. Après 24 h d’ensemencement de la cellule, la culture des cellules avec EMEM 10 % BF 1 % antibiotique/antimycosique, stimulée par l’acide 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (vitamine C) de 0,5 mM par ajoutant 1,5 sur le dessus et 1,5 mL sur la partie inférieure de chaque construction.
  4. Maintenir les cultures dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 semaines et fournir les supports neufs, tous les deux jours pendant toute la période témoin. Aucun autre passage n’est nécessaire.

3. différenciation et des cultures de cellules

  1. Après 3 semaines, ajoutez 8 x 103 cellules/puits de cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y sur le dessus de la 3D déjà assemblé construit contenant 1,5 mL de la EMEM contenant 10 % BF, 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 1 % antibiotique/antimycosique et 0,5 mM Acid (vitamine C).
    1. Laissez les cellules de neuroblastome SH-SY5Y de croître sur le dessus les cellules stromales de la cornée pendant au moins 24 h avant d’initier la différenciation cellulaire.
  2. Initier la différenciation des cellules SH-SY5Y en stimulant les cellules avec EMEM contenant 1 % FBS et 1,5 mL de 10 µM acide rétinoïque sur le dessus de la construction. Ajouter 1,5 mL de la EMEM FBS 1 % antibiotique/antimycosique 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acide à 10 % (vitamine C) vers le bas de la construction. Veuillez noter que l’étape de l’acide rétinoïque doit être exécutée dans l’obscurité.
    1. Continuer à la culture des cellules dans les médias de cette différenciation pendant 5 jours.
  3. Lorsque les cellules atteignent la phase de différenciation, passer les cellules à 1,5 mL de milieu sans sérum contenant 2 nM de Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) et 1 % antibiotique/antimycosique ajouté à la EMEM, en ajoutant au début de la construction. Ajouter 1,5 mL de la EMEM FBS 1 % antibiotique/antimycosique 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acide à 10 % (vitamine C) vers le bas de la construction. Veuillez noter que l’étape BDNF doit être exécutée dans l’obscurité.
  4. La culture des cellules pour 2 jours supplémentaires avant le traitement pour une analyse ultérieure, comme il est indiqué dans le tableau 1.

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Résultats

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La figure 1 présente une image représentative étape par étape du travail 3D in vitro modèle. Lors de la première étape, les cellules sont isolées de cornées humaines. Puis, ils sont cultivés sur une membrane en polycarbonate et stimulés par la vitamine C pour assembler une matrice 3D automatique sécrétée. Ce système de construction 3D induit la synthèse d’un multicouche cellulaire in vivo-comme matrice stromal. Par la suite, les cellules de ...

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Discussion

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Plusieurs études ont surtout portés sur le développement de divers modèles animaux peuvent aider à développer une meilleure compréhension des maladies de la cornée ainsi que découvrir des traitements. Toutefois, une valeur significative pour les humains de ces études n’a pas été vérifiée. A ce jour, différents modèles in vitro ont été mis au point et largement étudiés en raison de leur importance clinique remarquable. Notre modèle établie antérieurement 3D in vitro est un système novateur qui significat...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Nous tenons à remercier sincèrement le Dr Ben Fowler pour son aide technique avec les expériences TEM.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tissu cornéen sainNDRIÉchantillons provenant de donneurs sans traumatisme oculaire ni maladie systémique
Dulbecco' s Solution tamponnée phosphate (1X)Gibco by Life Technologies14190-144
Pince stérileFischer Scientific13-812-42Fisherbrand Dissection Extra-Fine-Point-Splinter
Span Blades de rasoir à un seul tranchantPersonna270100
Lames de scalpel chirurgical stériles No.10Feather Surgical Blade2976#10
Eagle' s Minimum Essential MediumATCC30-2003
Fetal Bovin SerumAtlanta BiologicalsS1155010 % FBS est requis pour la préparation des milieux
Antibiotique-Antimycosique (100X)Gibco by Life Technologies15240-0621 % Antibiotique-Antimycosique est nécessaire pour la préparation des milieux
0,05 % Trypsine EDTA(1X)Gibco de Life Technologies25300062
Inserts de membrane en polycarbonate avec 0,4-&mu ; PoresCorning Costar3412
Acide 2-O-&alpha ;-Dglucopyranosyl-L-ascorbique (Vitamine C)Sigma-AldrichSMB00390-14Une concentration de 0,5 mM doit être utilisée pour l’étude
Bloc de cireVWR50-949-027
SH-SY5Y Cellules de neuroblastomeATCCSHSY5YATCC CRL-2266
Acide rétinoïque Sigma-AldrichSRP3014-10UGLa concentration finale de 10 μM doit être utilisée
BDNFSigma-AldrichR2625-100MGconcentration finale de 2 nM doit être utilisée
Diméthylsulfoxyde (DMSO)VWR-Alfa Aesar67-68-5Ultra Pure Grade-Sterile DMSO à utiliser
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)Fisher Scientific12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)Fisher Scientific12-565-349
La

Références

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