Dosage pour la Transposase Accessible chromatine couplé avec le séquençage haut-débit (ATAC-seq) est une méthode de Génome-large pour découvrir la chromatine accessible. Il s’agit d’un protocole étape par étape de ATAC-seq, du moléculaire à la dernière analyse computationnelle, optimisé pour les lymphocytes humains (Th1/Th2). Ce protocole peut être adopté par les chercheurs sans expérience préalable dans les méthodes de séquençage de prochaine génération.
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Article de méthode
Cartographie de tout le génome de chromatine Accessible dans les Lymphocytes T humains primaires par ATAC-Seq
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dosage pour la chromatine Transposase Accessible avec le séquençage haut-débit (ATAC-seq) est une méthode utilisée pour l’identification des régions (accessibles) ouvertes de la chromatine. Ces régions représentent réglementaire des éléments d’ADN (par exemple, promoteurs, exhausteurs, locus contrôle les régions isolateurs) dont transcription facteurs se lient. Cartographie du paysage de la chromatine accessible est une approche puissante pour découvrir les éléments de régulation actives au sein du génome. Cette information sert une approche impartiale pour découvrir le réseau des facteurs de transcription pertinents et de la structure de la chromatine des mécanismes qui régissent les programmes d’expression de gène. ATAC-seq est une alternative robuste et sensible à la DNase I analyse hypersensibilité couplé avec le séquençage de prochaine génération (DNase-seq) et formaldéhyde assistée par isolement des éléments régulateurs (FAIRE-seq) pour l’analyse du génome de la chromatine l’accessibilité et à la séquence de micrococcique sites sensibles à la nucléase (MNase-seq) pour déterminer le positionnement des nucléosomes. Nous présentons un protocole détaillé de ATAC-seq optimisé immunitaire primaire humain cellules c.-à-d. CD4 + lymphocytes (T helper 1 (Th1) et les cellules Th2). Ce protocole complète commence par la récolte de cellules, puis décrit la méthode moléculaire de la chromatine tagmentation, préparation des échantillons pour le séquençage de prochaine génération et inclut également des méthodes et considérations pour les analyses de calculs utilisés pour interpréter les résultats. De plus, pour gagner du temps et argent, nous avons introduit des mesures de contrôle de qualité afin d’évaluer la bibliothèque ATAC-seq avant séquençage. Ce qui est important, les principes présentés dans le présent protocole permettent son adaptation à d’autres cellules primaires humaines immunitaires et non immuns et les lignées cellulaires. Ces lignes directrices sera également utiles pour les laboratoires qui ne maîtrisent pas avec les méthodes de séquençage de prochaine génération.
Introduction
ATAC-seq1,2 est une méthode robuste qui permet l’identification des régions de chromatine ouverte réglementaire3 et positionnement des nucléosomes. Cette information est appliquée pour inférer l’emplacement, identité et l’activité de facteurs de transcription. Sensibilité de la méthode pour mesurer les variations quantitatives dans la structure de la chromatine permet l’étude de l’activité des facteurs de la chromatine, y compris des rénovateurs de la chromatine et modificateurs, ainsi que l’activité transcriptionnelle de l’ARN polymérase II1. ATAC-seq fournit donc une approche puissante et impartiale pour décrypter les mécanismes qui régissent la régulation transcriptionnelle dans n’importe quel type de cellules d’intérêt. Nous décrivons l’adaptation de l’ATAC-seq aux cellules humaines primaires de Th1 et Th2.
ATAC-seq, hyperactif Tn5 transposase chargé avec adaptateurs pour la nouvelle génération de séquençage (NGS) couples fragmentation de l’ADN avec marquage de l’ADN avec adaptateurs (c'est-à-dire, le processus de « tagmentation »)1. Après amplification par PCR, les bibliothèques d’ADN qui en résultent sont prêts pour l’ordonnancement de prochaine génération (Figure 1). La tagmentation préférentielle de chromatine accessible est détectée par l’analyse d’un enrichissement local de lectures de séquençage ATAC-seq.
L’exigence pour moins produit de départ, par rapport à d’autres méthodes pour mesurer l’accessibilité de la chromatine et positionnement nucléosomique comme DNase-seq4, FAIRE-seq5et6de MNase-seq et une courte procédure expérimentale a encouragé l’utilisation du ATAC-seq dans les systèmes biologiques multiples, y compris les cellules humaines primaires1,7 et échantillons cliniques8, ainsi que des organismes unicellulaires-9plantes10, drosophiles11 et divers mammifères12.
L’identité de la transcription des facteurs qui sont liés au locus accessibles peuvent être découvert par analyse de l’enrichissement de leurs motifs de séquences de liaison ou alliant ATAC-seq immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivie par haut débit (de séquençage de l’ADN ChIP-seq). Cette approche a permis l’identification des facteurs de transcription spécifiques lignée importantes pour l’hématopoïèse dans la souris13. La nature globale et impartiale de l’ATAC-seq permet d’étudier la régulation génique dans les organismes pour lesquels les réactifs tels que les anticorps pour l’analyse de la puce ne sont pas disponibles. Par exemple, les variations évolutives cis-régions régulatrices ont été identifiés par l’étude des cellules de la crête neurale crânienne du14les humains et les chimpanzés, variations de développement dans les éléments de régulation au cours de la souris au début l’embryogenèse15, changements dans le paysage réglementaire pendant un cycle de vie des unicellulaires owzarzaki c.9et l’évolution des promoteurs et des amplificateurs à travers 20 mammifère espèces12.
ATAC-seq a également joué un rôle important pour mesurer l’accessibilité de la chromatine dans des cellules individuelles, donc révélateur variabilité au sein de populations de cellules, qui habituellement se soustrait pangénomique études7,16. En outre, ATAC-seq peut servir à étudier les changements qui se produisent dans les régions régulatrices de l’ADN dans des conditions de la maladie, dans lequel les échantillons sont rares. Par exemple, ATAC-seq peut être utilisé pour étudier les changements dans le paysage réglementaire lors de l’apparition de la leucémie myéloïde aiguë (AML)17 ou Ras-driven oncogenèse11.
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Protocole
toutes les procédures ont été approuvées par la Commission de révision institutionnelle de l’Université de Bar Ilan et le protocole suit les directives émanant de la Commission approuvant les expériences.
1. purification du naïf CD4 + des cellules humaines et polarisation T Helper 1 (Th1) et les cellules Th2
Remarque : ici, nous décrivons la procédure à partir de cellules mononucléaires de sang périphérique humain congelé (PBMC). La première étape consistant à isoler les cellules CD4 + à l’aide de microbilles et colonnes donnent qu’habituellement nous plus de 95 % des cellules CD4 +. Cependant, cette étape peut varier selon le protocole préféré dans chaque laboratoire. Le protocole d’activation des cellules T et la polarisation a été modifié de Jenner et al. (2009) 18. isolement de CD4 + cellules de 10 millions PBMC donne lieu à 4 millions de cellules CD4 +. Ils sont divisés en deux flacons et cultivés en Th1 et Th2 polarisant les conditions agronomiques les cellules Th1 et Th2 3 millions en seulement une semaine.
Remarque : refroidir le centrifuger à 4 ° C avant de commencer.
- Décongeler 1 mL de PBMC humaines (10 7 cellules) dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de milieu RPMI, additionné de 1 % la pénicilline-streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur. Centrifuger à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec une pipette stérile de 25 mL à 15 mL de milieu supplémenté de RPMI. Transférer les cellules (avec pipette stérile de 25 mL) dans un flacon de culture T75.
- Quitter les cellules pendant la nuit dans un incubateur humidifié (37 ° C, 5 % de CO 2).
- Transférer les cellules flottantes avec une pipette stérile 25 mL de tube de 50 mL. Déterminer le nombre de cellules et de la viabilité exclusion bleu trypan.
- Isoler CD4 + cellules de 10 millions vivre non adhérents PBMC par sélection positive en utilisant les colonnes selon le fabricant et CD4 + microbilles ' recommandations (voir Tableau de matériel/équipement) par ce qui suit modifications : 10 7 PBMC est étiquetés avec 30 µL de microbilles de CD4 dans 120 µL de 0,5 % de BSA dans du PBS.
- Activer les cellules T CD4 + pendant 72 h par rhIL-2 (10 ng/mL), lié aux plaque anti-CD3 (5 µg/mL) et soluble anti-CD28 (2 µg/mL). Pour la polarisation Th1, ajouter rhIL-12 (20 ng/mL) et anti-IL-4 (10 µg/mL). Pour la polarisation Th2, ajouter rhIL-4 (40 ng/mL) et anti-IFN-γ (10 µg/mL).
- Culture des cellules supplémentaires 7 jours en présence de rhIL-2 (10 ng/mL) et les mêmes cytokines polarisants (rhIL-12 pour Th1 et Th2 rhIL-4).
2. Isolement des noyaux
Remarque : ATAC-seq est exécutée avec noyaux intacts. Lyse tampon nonylphényl polyéthylène glycol contenant 0,05 % (voir Tableau des matériaux/matériel) a été étalonné pour isoler les noyaux de cellules humaines primaires de Th1 et Th2. Il est recommandé de calibrer cette étape avec les réactifs de laboratoire et les cellules. Un excès de cellules intactes de détergent insuffisant diminue l’efficacité de la réaction de transposition. Efficacité de la lyse des cellules est déterminée par le nombre de noyaux (cellules positives bleu trypan) par rapport au nombre total de cellules.
NOTE : Préparez le tampon de lyse (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2). Refroidir une centrifugeuse avec un rotor de swing-seau à 4 ° C. enrobage des cellules dans une centrifugeuse de swing-seau au lieu d’une centrifugeuse à angle fixe réduit la perte de/noyaux cellulaires. Pour éviter les noyaux ou la perte de cellules, pipette avec précaution lorsque vous jetez le liquide surnageant.
- Ajouter frais nonylphényl polyéthylène glycol (à une concentration finale de 0,05 %) et 100 x inhibiteurs de la protéase (à une concentration finale de 1 x) dans le tampon de lyse froid immédiatement avant l’emploi. Garder le tampon sur glace
- Cellules Count T pour déterminer leur montant et leur viabilité à l’aide de la méthode bleu trypan. La viabilité est inférieure à 90 % des résultats supérieurs non-spécifiques digestion.
- Transfert 0,5 x 10 6 T cells (Th1 ou Th2) aux microtubes de 1,5 mL. Tournez en bas à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Resuspendre le culot dans 1 mL de froid tamponnée au phosphate (PBS) du sérum physiologique. Tournez en bas à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de lyse froid (contenant nonylphényl polyéthylène glycol et inhibiteurs de la protéase). Maintenir le tube sur la glace. Pipette doucement pour ne pas perturber les noyaux.
- Rapidement prendre 10 µL et de compter les cellules avec un compteur de cellules automatisées, tandis que le microtube avec cellules lysées est sur la glace. Cette étape ne devrait pas dépasser cinq minutes pour éviter d’endommager les noyaux. Au moins 80 % des cellules devraient être lysé.
- Continuer immédiatement avec la réaction de transposition. Garder les noyaux disposés sur la Cie.
3. Réaction de transposition
Remarque : dans cette étape, les noyaux isolés sont incubés avec procaryote Tn5 transposase (TDE1) chargé avec des adaptateurs pour l’ordonnancement de la NGS. Tn5 hyperactif simultanément fragments d’ADN et ligates des adaptateurs dans les régions accessibles du génome (processus tagmentation). Le rapport entre noyaux et Tn5 transposase est critique pour le clivage préférentiel à chromatine accessible. Ce protocole est calibré pour 100 000 noyaux dans un volume de réaction 100 μL. Cependant, la réaction peut être réduite.
- Régler la température dans un shaker thermique à 37 ° C.
- Transférer 100 000 noyaux d’un microtube 1,5 mL.
- Centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C et délicatement retirer le surnageant.
- Ajouter les composants de réaction de transposition aux noyaux comme spécifié dans le tableau 1.
- Remettre en suspension par pipetage doux.
- Incuber la réaction de transposition dans un shaker thermique à 37 ° C pendant 30 min avec doux secouant (500 tr/min).
Remarque : ADN nettoyage est effectué par phase solide immobilisation réversible perles 19 (voir Table des matières, équipements) ou colonnes de purification de PCR. À la fin du nettoyage, éluer les fragments d’ADN dans 20 µL de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Éviter d’EDTA dans le tampon d’élution.
4. Enrichissement PCR des bibliothèques ATAC-seq
Remarque : cette étape vise à amplifier l’ATAC-seq bibliothèque par exemple, des fragments d’ADN avec des cartes insérées. Pour permettre le mélange de plusieurs bibliothèques de ATAC-seq dans la même voie de séquençage de nouvelle génération (" multiplexage ") usage sans indexation 1 Primer (Ad1_noMx) 1 pour tous les échantillons, et un autre indexé (avec code à barres) Primer 2 (Ad 2.1-2.24) 1 pour chaque échantillon. Les séquences d’amorces sont fournis dans l' supplémenté Table des matières, équipements.
- Amplification PCR initial
Remarque : la concentration de travail de 1 Primer (Ad1_noMx) et 2 de Primer est 25 µM. Toutes les amorces sont diluées du stock initial de 100 µM à 25 µM. Dans toutes les réactions de PCR, utilisez 1 Primer (Ad1_noMx) et un seul des 2 Primer indexée.- Ajouter les composants de la réaction PCR comme spécifié dans le tableau 2 dans un tube stérile de la PCR.
- Place PCR tuyau dans un thermocycleur et effectuer l’amplification par PCR en utilisant des conditions cyclisme décrites dans le tableau 3.
- Évaluation du nombre de cycles d’amplification supplémentaire
Remarque : le nombre de cycles PCR supplémentaires devrait produire une quantité suffisante de bibliothèque fragments fou une séquence de génération réussie durant, tandis qu’il réduit au minimum pour éviter les GC et dimensionner les biais 20. La détermination du nombre de cycles PCR (N) nécessaires pour l’amplification de fragment de bibliothèque optimale se faite par PCR quantitative (qPCR).- Des amorces de diluer 1 (Ad1_noMx) et 2 (utilisé pour l’amplification de la bibliothèque initiale) de 25 µM à 6,25 µM.
- Ajouter les composants pour tubes PCR optiques ou une plaque, comme indiqué dans le tableau 4.
- Place dans un instrument de qPCR et cycle comme spécifié dans le tableau 5.
- Pour estimer le nombre requis de cycles d’amplification supplémentaire (N), tracer le nombre de cycles sur l’axe des abscisses et la fluorescence relative (RFU) sur l’axe y. Cycles de
- le nombre d’amplification supplémentaire (N) est 1/3 du nombre de cycles au cours de laquelle la réaction de qPCR atteint le plateau. la figure 2 fournit des exemples pour les trois bibliothèques de ATAC-seq qui atteint plateau ~ 2 350 unités de fluorescence relative, la RFU (ligne verte épaisse). Le nombre de cycles PCR dans lequel un tiers de la quantité maximale (783 RFU, marquée sur l’axe des y) est amplifié correspond à 8 cycles pour deux des bibliothèques (courbes d’amplification rouge et bleu) et 9 cycles PCR pour la troisième bibliothèque (rose).
- Amplification PCR final
- amplifier le µL 45 restantes de la réaction PCR. Placer un tube PCR contenant la réaction d’amplification de l’étape 4.1.2 dans un thermocycleur. Exécutez le programme PCR décrit dans le tableau 6. Utilisez le préalablement déterminée (étape 4.2.5) nombre de cycles d’amplification (N).
5. Taille de sélection des bibliothèques de l’ATAC-Seq
Remarque : dans notre expérience, sélection de la taille des bibliothèques de ATAC-seq amplifiés améliore les résultats du séquençage de prochaine génération car il élimine les fragments de bibliothèque de haut poids moléculaire de la bibliothèque de ATAC-seq final.
Remarque : Laissez les billes magnétiques se réchauffer à température ambiante 30 min avant utilisation.
Préparer l’éthanol à 70 % frais dans de l’eau exempte de nucléase.
- Remettre en suspension les billes magnétiques en mélangeant.
- Ajouter eau exempte de nucléase aux bibliothèques ATAC-seq (obtenus à l’étape 4.3.1.) et porter jusqu'à 100 µL.
- Ajouter 50 µL (0,5 x) des remises en suspension billes magnétiques de liaison à l’ADN à 100 µL de bibliothèques amplifiés. La composition de pipetage de haut en bas au moins 10 fois. Incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante. Si nécessaire, faire tourner rapidement vers le bas les microtubes.
- Placer le tube sur un support magnétique approprié pendant 2 min séparer les billes magnétiques du surnageant. Après 2 min, transférer le surnageant dans un microtube de nouvel.
- Mesurer le volume du liquide surnageant de pipetage et ajouter 0,7 x de billes magnétiques. Mix de pipetage de haut en bas au moins 10 fois.
- Incuber 5 min à température ambiante. Place sur un support magnétique pour 2 min.
- Après les 2 min d’incubation, éliminer le surnageant. Ajouter 200 µL fraîchement 70 % éthanol pour laver les perles tandis que les tubes sont sur le support magnétique.
- Garder le microtube sur l’aimant pour 30 s et puis jeter l’éthanol. Répétez l’étape 5.7.for deux lavages éthanol final.
- Supprimer complètement l’éthanol restants et les laisser que sécher à l’air les perles pendant 5 min alors que le tube soit sur l’aimant. Si nécessaire, brièvement tourner le microtube. Éliminer les traces de l’éthanol avec une pointe de pipette p10.
- Supprimer le microtube de l’aimant et ajouter 22 µL de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Éluer pas les bibliothèques ATAC-seq dans un tampon contenant EDTA.
- Incuber le tube pendant 2 min à température ambiante et les placer sur le support magnétique.
- Lorsque la solution est claire, transférer 20 µL de bibliothèques éluées dans un microtube stérile nouveau.
- Store la taille sélectionnée ATAC-seq bibliothèques à -20 ° C.
6. Analyse de la qualité des bibliothèques ATAC-Seq
- Validation de la qualité des bibliothèques ATAC-seq par PCR en temps réel
Remarque : il est important d’évaluer le rapport signal sur bruit des bibliothèques ATAC-seq avant génération séquençage. Cela se fait par la détermination de la quantité relative des fragments d’ADN de loci accessibles et inaccessibles à l’aide de la PCR quantitative (qPCR). Les locus inaccessibles (témoin négatif, chr1:48, 137, 860-48,137,934 et chr1:193, 093, 748-193,093,827) sont complétées par des paires d’amorces 1 et 2. Les locus accessibles (contrôle positif, chr19:30, 336, 166-30,336,253 et chr19:11546154-11546237) sont complétées par des paires d’amorces 3 et 4. Positifs et négatifs des loci ont été définis de profils d’accessibilité (DHS-seq) chromatine de CD4 + cellules humaines (ENCODE les entrées ENCSR000EQE et ENCSR000EQG). Amorce négative 1 se trouve dans une grande région intergénique hétérochromatique (230 ko de TRADB2 et 88 Ko de FOXD2). Contrôle négatif région 2 est dans le premier intron du gène CDC73. Positif de paire d’amorces 3 se trouve une région ouverte de la chromatine en aval du gène cycline E (CCNE1) tout en paire d’amorces positives 4 est centrée dans le promoteur de la protéine kinase C substrat 80K-H (PRKCSH). Ce qui est important, ces locus de contrôle montrent une tendance similaire de l’accessibilité dans d’autres types de cellules humaines de projet ENCODE 3, ce qui suggère qu’ils peuvent être utilisés pour surveiller les bibliothèques ATAC-seq d’un vaste éventail de types de cellules humaines. La spécificité de toutes les paires d’amorces et apprêt efficacité a été vérifiée par qPCR sur une dilution en série de l’ADN génomique (à partir de cellules humaines de Th) et une analyse des courbes de fusion des amplicons obtenus.- Isoler l’ADN génomique à l’aide d’un disponible dans le commerce nécessaire (voir le Tableau des matériaux/matériel).
- Diluer l’ATAC-seq amplifié bibliothèque 01:10 (1 µL bibliothèque + 9 µL d’eau exempte de nucléase) et l’ADN génomique à ~ 5 ng/µL.
- Préparer le mélange réactionnel (tableau 7) pour chaque paire d’amorces de témoins positifs et négatifs, en tenant compte du fait que les réactions sont effectuées en trois exemplaires.
- Incuber dans qPCR thermocycleur selon le protocole recommandé par qPCR mélange principal fournisseur.
- Analyser les résultats en instrument de qPCR ' logiciel de s (voir Table des matières et équipements). Choisissez l’ADN génomique comme un échantillon de contrôle. Les valeurs obtenues représentent un enrichissement des régions accessibles (amplifié par des amorces de contrôle positif). Un exemple est illustré dans le tableau 8.
NOTE : Estimation de la taille moyenne de bibliothèque et de la concentration : la distribution de taille des fragments d’ADN de bibliothèques ATAC-seq est déterminée par les systèmes de haute sensibilité électrophorèse automatisée selon le fabricant ' instructions de s. Il est conseillé de mesurer la concentration de l’échantillon sur un fluorimètre à l’aide de kit de haute sensibilité ADN double brin et au moins 2 µL de chaque échantillon d’ADN.
NOTE : Séquençage de prochaine génération - avant multiplexage par les bibliothèques, calculer la molarité de chaque bibliothèque ATAC-seq en utilisant la formule : (ng/µL x 10 6) / (660 x bibliothèque moyenne longueur de fragment). But pour > 30 millions de lectures de chaque bibliothèque ATAC-seq pour évaluer la chromatine ouverte régions d’échantillons humains. Si vous souhaitez déterminer si la bibliothèque est assez bonne pour l’ordonnancement de la NGS, initialement objectif de lectures 10 millions (5 % de la voie de séquençage sur instrument de séquençage de l’ADN en mode exécution rapide). N’oubliez pas que pour déduire le positionnement des nucléosomes, séquençage jumelé-fin est nécessaire 1.
7. Analyse des résultats obtenus génération séquençage
- déduire la qualité des lectures de séquençage en inspectant les fichiers FastQC, séparément pour chaque bibliothèque.
- Aligner les lectures au génome humain référence (montage hg19) à l’aide de noeud papillon 21 logiciels dans l’environnement Unix/Linux. La commande est ' noeud papillon -m 1 - q -S génome directory reads.fastq output_aligned.sam '. Répertoire de génome représente le dossier où sont stockés les index du génome du noeud papillon. Le paramètre -m 1 pour ne pas permettre l’alignement des lectures à plusieurs locus dans le génome, - q est pour le fichier d’entrée qui doit être au format fastq, -S pour la sortie qui est au format SAM.
- Supprimer des lectures en double à l’aide de SAMtools 22 rmdup option dans l’environnement Unix/Linux. Les commandes sont ' samtools Découvre output_aligned.sam -b -S | samtools Tri -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. La première commande, avis, modifie le format de SAM dans le format BAM qui est ensuite trié. L’option de rmdup est ensuite appliquée sur le fichier trié de BAM. Éventuellement, on peut ajuster les lectures pour le site d’insertion du transposon, tel que décrit dans l’original papier de ATAC-seq 1. Cela se fait à l’aide de BEDtools commandes 23 dans l’environnement Unix/Linux. Les commandes sont ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i output_aligned _rmdup.bed génome de 4 - m-5 g - p - > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. La première commande, bamTobed, modifie le format BAM en format de lit qui peut ensuite être utilisé pour la commande shiftBed. Le fichier de génome est un fichier délimité onglet qui contient la longueur de chacun des chromosomes du génome. Le fichier est généralement ajouté dans le répertoire BEDtools.
Appel de pic - Perform moyen d’analyse basées sur le modèle du ChIP-seq (MACS2) 24 logiciels dans l’environnement Unix/Linux sur le fichier lit décalé avec les paramètres suivants :--nomodel--extsize 75--shift -30. Ces paramètres sont utilisés pour ajuster les lectures afin que le site d’insertion de transposon se trouve au milieu de chaque lecture de séquençage.
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Résultats
Le résultat final de ce protocole est une bibliothèque de ATAC-seq typiquement 3-20 ng/µl. Lorsqu’il est exécuté sur un système d’analyse de l’intégrité de l’ADN (voir la Table des matières, équipements), ils montrent apparence échelle2 (Figure 3 a). La taille moyenne des fragments d’ADN est généralement bp ~ 450-530.
Bon contrôle de la qualité des bibliothèq...
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Discussion
Le protocole de ATAC-seq décrit ici a été avec succès employé pour l’analyse de la chromatine accessible dans les cellules primaires (humain Th1, Th2 cellules et B) ainsi que les lignées de cellules cultivées (MCF10A humain cellules cancéreuses et les cellules de glioblastome U261). Application de ATAC-seq aux autres types de cellules peut-être exiger certains optimisation de protocoles, en particulier dans l’étape de lyse. Si la concentration de détergent non ionique est trop élevée, il peut y avoir un pourcentage plus ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail est soutenu par la Fondation des sciences Israël (subvention 748/14), Marie Curie intégration accorder (CIG) - pcrd7-personnes-20013-CIG-618763 et j’ai-CORE programme et de la planification et budgétisation Comité The Israel Science Foundation grant no 41/11.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes de 50 mL | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Pipettes sérologiques de 25 mL | Corning Costar | 4489 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Flacon de culture tissulaire | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Compteur automatisé de cellules Countes | Invitrogen | C10227 | |
| Tissu NucleoSpin | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Cellules mononucléées du sang périphérique ;( PBMC) | ATCC | ; PCS&timide ; 800 ; 011 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Solution de L-glutamine (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Pénicilline-Streptomycine | Biological Industries | 03-031-1B | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Sérum fœtal bovin (FBS), ; Inactivé par la chaleur, | European Grade Biological Industries | 04-127-1 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Microbilles MACS CD4, humaines | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Colonnes MACS MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Souris IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Biogemmes Purifiées | 10311-25 | ||
| IL2 Humain Recombinant | Peprotech | 200-02 | |
| IL4 Humain Recombinant | Peprotech | 200-04 | |
| IL12 Humain Recombinant IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF ; IFN-&gamma anti-humain purifié ; | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, qualité analytique | Carlo Erba | 479687 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Chlorure de magnésium, hexahydraté, biologie moléculaire de qualité | Calbiochem | 442611 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Tris, ultra pur, pur à 99,9 % | MP Biomedicals | 819620 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Alternative NP-40 (nonylphényl polyéthylène glycol) | Calbiochem | 492016 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Inhibiteurs de protéase | Sigma | P2714 | cet inhibiteur de protéase coctail est une poudre. Pour faire 100 x solution, diluer dans 1 mL d’eau de biologie moléculaire. |
| Perles d’immobilisation inverse magnétiques en phase solide : Perles AMPure XP | Beckman | 63881 | |
| Kit de purification PCR | HyLabs | EX-GP200 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase et tampon TD) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I ; | Invitrogen | S7585 | |
| ; CFX Connect PCR en temps réel ; Détection ; Le système | Bio-rad | 185-5200 | peut provenir d’autres fournisseurs. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix pour qPCR : iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Fluorimètre Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Kit de dosage | Invitrogen | Q32854 | |
| Aimant pour tubes eppendorf | Invitrogen | 12321D | Peut provenir d’autres fournisseurs. |
| Centrifugeuse de refroidissement à godet pivotant avec les godets pour tubes Falcon de 15 ml et tubes Eppendorf | Thermo Scientific 75004527 | Pourrait provenir d’autres fournisseurs. Il est important qu’il ait des godets pour les tubes eppendorf. | |
| Thermo-shaker | MRC | Peut provenir d’autres fournisseurs. | |
| Haute sensibilité D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Haute sensibilité D1000 Réactifs | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 Système TapeStation | Agilent Technologies | G2991AA | Plate-forme à bande pour l’électrophorèse |
| Kit d’ADN haute sensibilité | Agilent Technologies | 5067-4626 | Réactif pour analyse TapeStation haute sensibilité |
| Nom et séquence de l’amorce | de l’entreprise | ||
| : 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT | Ad1-noMx : 5'-P5 séquence-transposase séquence-3'Ad2.1_TAAGGCGA | ||
TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.1_expected séquence d’index : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3'Ad2.2_CGTACTAG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.2_expected séquence d’index lire : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3' | ||
| Ad2.3_AGGCAGAA : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGG TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.3_expected séquence d’index read : 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.4_TCCTGAGC | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.4_expected séquence d’index lecture : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3'Ad2.5_GGACTCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.5_expected séquence d’index lecture : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3'Ad2.6_TAGGCATG | ||
| : 5'-CAAGCAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.6_expected séquence d’index lire : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3'Ad2.7_CTCTCTAC | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.7_expected séquence d’index lire : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3' | ||
| Ad2.8_CAGAGAGG : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGG TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.8_expected séquence d’index read : 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.9_GCTACGCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.9_expected séquence d’index lecture : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3'Ad2.10_CGAGGCTG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.10_expected séquence d’index : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3'Ad2.11_AAGAGGCA | ||
| : 5'-CAAGCAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.11_expected séquence d’index lire : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-séquence de transposase-3'Ad2.12_GTAGAGGA | ||
| : 5'-CAAGCAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.12_expected séquence d’indice lire : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3' | ||
| Ad2.13_GTCGTGAT : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.13_expected séquence d’index read : 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.14_ACCACTGT | ||
| : 5'- CAAGCAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.14_expected séquence d’index lire : 5'-P7 sequence-[séquence d’index]-transposase sequence-3'Ad2.15_TGGATCTG | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.15_expected séquence d’index read : 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.16_CCGTTTGT | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC< br/> TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.16_expected séquence d’index lecture : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-séquence de transposase-3' | ||
| ; Ad2.17_TGCTGGGT : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.17_expected séquence d’index read : 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | ||
| ; Ad2.18_GAGGGGTT : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.18_expected séquence d’index read : 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.19_AGGTTGGG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.19_expected séquence d’index se lit : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-séquence de transposase-3' | ||
| ; Ad2.20_GTGTGGTG : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.20_expected séquence d’index lire : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-séquence de transposase-3' | ||
| ; Ad2.21_TGGGTTTC : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.21_expected séquence d’index read : 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.22_TGGTCACA | ||
| : 5'- CAAGCAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.22_expected séquence d’index lire : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3'Ad2.23_TTGACCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.23_expected séquence d’index lire : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-transposase séquence-3'Ad2.24_CCACTCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.24_expected séquence d’index lecture : 5'-P7 séquence-[séquence d’index]-séquence de transposase-3'F1 | ||
| : 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT | |||
| R1 : 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT | |||
| F2 : 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT | |||
| R2 : 5'-CTGCTGAACAACAACAACACCCTTCAC-3'IDT | |||
| F3 : 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT | |||
| R3 : 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT | |||
| F4 : 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT | |||
| R4 : 5'-AGCCGGAAAGAAAAAGTTCCTG-3'IDT |
Références
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