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Article de méthode

Injection hydrodynamique bassinet non-virale expression des protéines dans le rein

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DOI :

10.3791/56324

⸱

8 janvier 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterans Affairs, Tennessee Valley Healthcare System, 2Departments of Medicine and Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Medicine, Baylor University College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour injecter de l’ADN de plasmide dans le rein de souris via le bassinet pour produire l’expression du transgène spécifiquement dans le rein.

Résumé

Injection hydrodynamique crée un environnement local et à haute pression de transfecter divers tissus avec l’ADN de plasmide et d’autres substances. Injection dans la veine queue hydrodynamiques, par exemple, est une méthode bien établie par lequel le foie peut être transfecté. Ce manuscrit décrit l’application de principes hydrodynamiques par injection du rein souris directement avec l’ADN de plasmide pour l’expression des gènes spécifiques rein. Souris sont anesthésiés et le rein est exposé par une incision du flanc suivie d’une injection rapide d’une solution contenant de l’ADN de plasmide directement dans le bassinet. L’aiguille est maintenue en place pendant dix secondes, et l’incision est suturée. Le jour suivant, vivre l’imagerie animaux, Western blot ou immunohistochimie peut être utilisé pour analyser l’expression des gènes ou autres dosages adaptés pour le transgène de choix sont utilisés pour la détection de la protéine d’intérêt. Méthodes publiées pour prolonger l’expression des gènes comprennent le transgène induite par le transposon intégration et cyclophosphamide traitement pour inhiber la réponse immunitaire pour le transgène.

Introduction

La technique d’injection hydrodynamique queue veineuse est devenu un moyen couramment utilisé pour atteindre de hauts niveaux d’expression des gènes chez les souris du foie1,2. Les reins sont également transfectées par cette technique à un niveau beaucoup plus faible, environ 100 fois moins3. L’injection hydrodynamique bassinet décrite ici offre un moyen simple pour contrôler la spécificité d’expression organe par des moyens physiques, selon les mêmes principes d’hydrodynamiques qui ont été établies précédemment dans le foie4,5 , muscle6et autres organes7,8. Cette méthode transfects cellules d’animaux vivants en vivo à l’aide de la pression et la vitesse pour forcer le liquide contenant de l’ADN dans les cellules, en même temps induisant des dommages à l’organe qui est rapidement résolu9. À l’aide de techniques chirurgicales bien établies pour visualiser le rein via une incision de flanc10 avec une seule injection par seringue à insuline, nous avons trouvé une transfection réussie de divers types de cellules de rein, principalement les fibroblastes interstitielles, les tubules et perception conduit11. Dissection de ces souris a montré que les autres organes sont transfectées pas à des niveaux suffisamment élevés pour visualiser de la luciférase imaging techniques11. La technique étant non viraux, utilisation d’ADN plasmidique pour la transfection permet une préparation rapide et facile des réactifs nécessaires pour injection.

Nous avons utilisé les injections localisées de l’hydrodynamiques pour exprimer l’antioxydant glutathion S-transférase A4, le récepteur du facteur de croissance 1 analogue à l’insuline et l’hormone érythropoïétine dans le rein, tous avec les effets biologiques attendus11, 12 , 13. une évaluation détaillée de la voie d’administration, volume d’injection, dosage de l’ADN et choix du promoteur a été effectué11. En outre, les deux le piggyBac transposon système cyclophosphamide traitement et/ou de supprimer la réaction immunitaire du transgène a été démontré pour améliorer à long terme gene expression résultats11. Autres chercheurs ont utilisé une approche de la veine rénale chez le rat avec succès, accroître l’efficacité élevée de transfection pour des périodes supérieures à un mois14. Cependant, correction génétique des phénotypes imitant des maladies humaines sont généralement effectués chez des souris tout d’abord comme une preuve de concept car plus de mammifères modèles génétiques sont des modèles de souris. Nous avons comparé injection dans la veine rénale à l’injection de bassinet du rein et constaté que l’injection dans le bassinet était supérieure à la veine rénale pour l’expression des gènes (environ dix fois plus élevée) et11de la survie. Le bassinet est une voie idéale de pénétration dans le rein car il est assez souple pour supporter les fluctuations dans la production d’urine et est souvent en mesure de conserver son intégrité structurelle même quand dilaté pendant une hydronéphrose. En outre, l’injection dans le bassinet autorisé à accéder à du rein sans percer la capsule rénale, permettant ainsi le fluide injecté sera visiblement conservé par le rein mieux qu’intraparenchymateuses injection. Autres organes de souris n’ont pas d’itinéraire d’entrée autres que le système vasculaire, mais l’espace urinaire du rein est un site d’injection idéale. En outre, injection dans la veine rénale a entraîné la fuite de sang dans la cavité abdominale. Le volume total de rein des reins de souris sauvage a été estimé par imagerie par résonance magnétique à environ 0,2 cm3, donc le volume d’un seul rein est approximativement égal à la quantité de liquide injecté par bassinet hydrodynamique injection (100 µL)15. Ici, nous proposons toutes les nuances détaillées du protocole injection hydrodynamique bassinet pour réaliser une transfection reproductible du rein.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’utilisation de comités (IACUCs) du Baylor College of Medicine et Vanderbilt University Medical Center et d’institutionnels animalier.

1. préparer la solution d’ADN pour injection

  1. Sélectionnez le plasmid(s) d’exprimer les transgènes soigneusement afin de maximiser les caractéristiques souhaitables pour améliorer l’efficacité de la transfection et l’expression du transgène.
    NOTE : Injection hydrodynamique bassinet des plasmides d’exprimer le marqueur fluorescent TdTomato, l’hormone érythropoïétine (Epo) et luciférase luciole ont été décrites précédemment11. S’il n’y a pas une analyse bien développée pour l’efficacité de transfection pour le transgène, effectuer une imagerie animale vivant de la luciférase en introduisant 10 µg de plasmide exprimant luciférase comme luciférase luciole améliorée à l’ADN dilué pour injection.
    1. Choisissez le plasmide plus petit qui est pratique pour l’application.
      Remarque : Les petits plasmides transfecter généralement mieux que les plasmides de cellules. Par exemple, le gène de résistance zeomycin et R6K origine de réplication sont petites, donc utilisant ces éléments dans le squelette plasmidique va diminuer la taille du plasmide.
    2. Exprimer le transgène d’un instigateur de mammifères.
      Remarque : Le type de cellules de rein transfecté, la longueur de l’expression génique et force d’expression de gène tous subira le choix du promoteur. Voir Woodard et al. pour une comparaison du cytomégalovirus (CMV ; constitutive virale), élongation facteur-1 alpha (EF-1α ; constitutive endogène), gamma-glutamyl transférase (γGT ; tubule spécifiques) et podocin (NPHS2 ; podocyte spécifiques)11.
    3. Utiliser un système intégrant non viraux tels que les transposons si des niveaux d’expression génique plus élevés à long terme sont souhaitables11,16. Pour les études avec les premières lectures inférieur à 5 jours après injection, intégration du transgène n’est pas nécessaire.
  2. Préparer l’ADN de plasmide pour injection à l’aide d’une méthode commerciale comme un kit maxiprep exempte d’endotoxine. Soigneusement éviter d’introduire des endotoxines via le matériel de laboratoire.
    Remarque : Présence d’endotoxines dans la solution d’ADN va susciter une réponse immunitaire sévère dans l’animal en question, compromettre l’expérience et éventuellement tuer l’animal.
    1. Après que la dernière étape de lavage isolement de l’ADN est terminée, assurez-vous qu’aucun éthanol n’est laissé par l’odeur et l’inspection visuelle. Gel-chargement conseils permet d’enlever les gouttes visibles. Sécher les tubes contenant le granule d’ADN à l’envers sur laboratoire tâche délicate essuie-glace tissus à température ambiante ou dans un four de 37-60 ° C avec une surveillance constante. Resuspendre le culot immédiatement après que l’éthanol résiduel s’est évaporée pour empêcher le surséchage du culot.
      Remarque : L’éthanol résiduel interfère avec la lecture de spectrophotomètre de la concentration d’ADN et introduction au rein n’est pas souhaitable.
    2. Resuspendre le culot d’ADN dans le même tampon car vous serviront pour injection (tampon de livraison hydrodynamiques ; 100-300 µL) de limiter la variation de la composition chimique de la solution tampon d’ADN entre les groupes.
      Remarque : Ne pas Resuspendre le culot de l’ADN dans la solution tampon d’élution qui vient avec le kit. L’agent de chélation EDTA trouve couramment dans les préparations de tampon « TE » susceptibles d’affecter les reins et la fonction cardiovasculaire. Selon la taille de granule, éluer à 100-300 µL de tampon de livraison hydrodynamique pour atteindre une concentration élevée. La concentration finale de l’ADN dilué se situera entre 100 ng/µL (dose de 10 µg/souris) et 500 ng/µL (dose de 50 µg/souris) alors la concentration d’ADN stock devrait dépasser cela.
    3. Entièrement Resuspendre le culot d’ADN dans un tampon. Laisser le diabolo dans tampon livraison hydrodynamique dans le tube d’origine à température ambiante pendant au moins une heure ou toute la nuit à 4 ° C avant de passer à un tube à centrifuger stérile pour s’assurer que l’ADN soit complètement dissout.
    4. Lire la concentration d’ADN de plasmide sur un spectrophotomètre ou par toute autre méthode établie.
      Remarque : Les lectures devraient être faits en double exemplaire avec répétitions supplémentaires si nécessaire. Si le ratio 260/280 est inférieur à 1,8, la préparation est contaminée avec de l’ARN, ou une autre substance ainsi jetez-le et préparer l’ADN de nouveau.
    5. Magasin plasmid DNA resuspendu dans un tampon injection à-20 ° C à l’intérieur d’une boîte dans un manuel de dégivrer le congélateur pour éviter la dégradation de l’ADN.
      NOTE : Mémoire de cette façon, la préparation de l’ADN va durer pendant de nombreuses années. Vérifier l’intégrité de l’ADN par électrophorèse sur gel digest et d’agarose restriction. L’ADN qui est étalé dans la ruelle s’est dégradée et ne peut être utilisé si l’ADN qui produit des bandes de taille correcte peut être utilisé pour l’injection.
  3. Préparer la solution d’ADN de plasmide diluées pour injection dans le bassinet.
    NOTE : Prenons le contrôle des groupes soigneusement. Dans plusieurs études, contrôles injecté seule, naïf et tampon sont inclus, car l’injection elle-même inflige des dégâts et peut affecter le résultat expérimental11.
    1. Décongeler l’ADN exempte d’endotoxine élué dans un tampon livraison hydrodynamiques à température ambiante sur le banc.
    2. Calculer la quantité d’ADN nécessaire pour les injections et préparer l’ADN dilué pour chaque groupe. Administrer 10-50 µg d’ADN à un volume total de 100 µL tampon hydrodynamique livraison par souris plasmidique.
      Remarque : Pour obtenir un exemple, les calculs d’injecter 3 souris avec 10 µg/souris d’un plasmide d’ADN qui a une concentration de 0,5 µg/µL sont comme suit.
      1. Préparer suffisamment de solution ADN d’avoir environ 20 % de bonus pour charger les seringues et les dead space à l’aiguille. Pour les 3 souris, préparer un mélange à 3,5 x. Calculer la masse de l’ADN en µg qui devrait être dans la solution. Ici, il serait 10 µg x 3,5 = 35 µg.
      2. Calcule le volume total de solution souhaitée pour injecter 100 µL par souris. Dans ce cas, il serait 100 µL x 3,5 = 350 volume total µL.
      3. Calculer le volume de stock plasmid DNA à ajouter à la solution. Dans ce cas, il serait 35 µg / 0,5 µg/µL = 70 µL de l’ADN de plasmide stock.
      4. Calculer le volume de tampon pour ajouter à la solution diluée d’ADN par soustraction du volume du stock ADN ajouté (étape 1.3.2.3) du volume total d’ADN dilué qui est souhaitée (étape 1.3.2.2). Dans ce cas, il serait 350 µL - 70 µL = 280 µL de tampon de livraison hydrodynamique.
    3. Préparer des solutions dans des microtubes stériles à l’aide de pointes de pipette de filtre disponibles dans le commerce avec la technique stérile sur le banc de laboratoire.
      NOTE : Solutions d’ADN peuvent préparer et stockées à température ambiante pour les injections défini ce jour-là. Ne pas injecter de souris avec une solution froide car cela fera baisser la température de leur corps, mais le réchauffement n’est pas nécessaire.

2. effectuer l’opération d’injection hydrodynamique bassinet

  1. Sélectionnez souris soigneusement pour la chirurgie.
    NOTE : Des différences spécifiques de souche n’ont pas encore été observés mais il peuvent être possibles. Plupart des injections ont été sur le C57BL/6 ou milieux FVB. Les injections de bassinet du rein fonctionnent parfaitement dans des souris qui sont âgés de 6 à 12 semaines. Chez les souris plus de 16 semaines, jusqu'à un taux d’échec de 50 % de la luciférase imagerie est possible pour des raisons peu claires. Le même taux d’échec lié à l’âge a été observé pour les injections de veine queue hydrodynamique pour le foie donc cela peut être une restriction générale au principe de l’injection hydrodynamique. Dans le même sens, d’autres ont montré que l’injection dans la veine queue hydrodynamique dans le foie de rat fibreuse n’est pas aussi efficace que la santé du foie, il est donc possible que, dans les milieux de la fibrose rénale l’injection hydrodynamique du bassinet rénal, ne sera pas aussi efficace, mais Cela n’a pas été testé directement17.
  2. Préparer des souris et seringues d’ADN pour la chirurgie.
    1. Anesthésier les souris avec la kétamine et de xylazine.
      1. Mettre sur l’équipement de protection individuelle correcte exigée par l’animalerie, comme le tablier jetable lab, masque chirurgical et des gants de nitrile.
      2. En collaboration avec 2-4 souris en même temps, peser chaque souris dans un bécher de 500 mL en plastique sur une échelle qui est précis à 0.1 g. calculer le montant exact de xylazine dilué dans le sérum physiologique 0,9 % à administrer à chaque souris par injection intrapéritonéale de la kétamine et 2 mg/mL 24 mg/mL (voir la vidéo référencée pour en savoir plus sur l’injection intrapéritonéale) 18. utiliser la formule (50 µL + ((5 µL) x (poids (g))), ou vous pouvez également calculer selon une autre formule après consultation avec l’équipe vétérinaire local et IACUC.
      3. Injecter la souris par injection intrapéritonéale de techniques standard. Placez votre souris dans un seau de papier jusqu'à ce que la souris est immobile.
        NOTE : Souris sont prêts pour la chirurgie quand ils ne répondent plus à l’épreuve de l’orteil-pincée. Donne souris qui continuent de répondre à l’orteil-pincée d’essai 20-30 min après l’injection initiale 20-60 µL plus anesthésiques, selon la force de la réponse.
      4. Place la souris sur une bouillote fait circuler l’eau recouvert d’un tampon bleu et la pommade vétérinaire lieu dans les deux yeux pour éviter la dessiccation cornéenne.
    2. Utiliser le côté gauche du dos de la souris de l’épaule à la croupe et le flanc de la colonne vertébrale un rasoir conçu pour le toilettage d’animaux. Enlever les débris et les cheveux dénoués.
    3. Préparez une seringue distincte contenant 100 µL d’ADN dilué pour chaque souris anesthésiés, assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air.
      1. Utiliser une seringue d’insuline de 0,5 mL U-100 stérile 29 x ½" avec une aiguille sans un dispositif de sécurité.
        Remarque : Le type de seringue est d’une importance cruciale. Cette jauge permet une injection rapide. L’aiguille empêche la solution de fuite. Présence d’une sécurité n’entravera accès au bassinet. Les seringues indiquées dans le tableau des matériaux glissent plus uniformément pendant l’injection que d’autres marques testées.
      2. Chargez la seringue à ~ 120 µL et tirez le piston vers le bas pour créer un espace en haut. Tapoter avec un stylo jusqu'à ce que tout l’air bulles lieu vers le haut. Maintenant l’aiguille vers le haut, bien appuyer sur le poussoir pour enlever tout l’air jusqu'à ce qu’une goutte se forme à la pointe de l’aiguille. Il faut éviter les bulles visibles présents, car ils peuvent causer une embolie gazeuse qui va tuer l’animal.
      3. Finition en appuyant sur le piston jusqu'à ce qu’il est de 100 µL dans la seringue en vidant les excès solution d’ADN dans le tube à centrifuger original. Soigneusement l’étiquette si nécessaire et placer les seringues chargés sur un drap stérile pour maintenir la stérilité si l’établissement où les travaux sont exécutés ne permet pas recapuchonner les aiguilles.
  3. Effectuer une chirurgie injection.
    1. Préparer le site pour la chirurgie. Placez un drap stérile sur la bouillote et vides outils chirurgicaux stériles sur le drap stérile sans y toucher. Soulevez la souris et le placer dans le champ de vision. Régler l’éclairage pour éclairer la zone.
    2. Retirer les paquets de trois 3,15 % chlorhexidine gluconate et 70 % d’alcool isopropylique peau tampons antiseptiques et placer près de l’animal.
    3. Transformer des gants chirurgicaux stériles. Travaillant dans un début de mouvement circulaire sur le site d’incision, écouvillon l’animal avec un nouveau tampon de chlorhexidine/alcool trois fois.
    4. Localiser le site d’incision comme illustré dans la Figure 1 a. Pincer la peau avec des pincettes, utiliser des ciseaux pour faire une coupe à la peau couche environ 1 cm de la colonne vertébrale et au-dessous de la cage thoracique. Une fois le site coupe environ 1 cm de long, faire un site similaire de coupe ci-dessous, dans la couche musculaire.
      Remarque : Faire l’incision à la bonne longueur pour permettre le rein à venir à peine dans l’incision puis être maintenus en place par l’incision lui-même. Trop petite une incision et le rein ne peuvent être exposés ; trop grande et le rein se glissera continuellement dans la cavité abdominale.
    5. Localiser les reins.
      Remarque : Il peut être visible entre le tissu adipeux blanc. La rate est également située sur le côté gauche de l’animal. La couleur de ces organes peut être visuellement différenciée, comme la rate est un marron foncé tandis que le rein est un rouge-orange foncé. Il n’est pas souhaitable de manipuler la rate comme il peut se rompre facilement.
    6. Sans toucher le rein, exposez-le doucement de la cavité abdominale en exerçant une pression régulière et douce sur le ventre avec les doigts (Figure 2). Utiliser des pinces fermés doucement repousser des organes dans l’abdomen si nécessaire. Ne pas utiliser la pince ouverte car cela pourrait endommager les reins ou autres organes.
    7. Une fois que le rein est hors de l’abdomen, doucement séparé de l’entourage fat juste assez pour visualiser le bassinet, un petit point blanc (Figure 1 b). Pousser l’excès de graisse sur le côté ou supprimer le cas échéant. Être sûr de ne pas retirer la glande surrénale, située près du pôle supérieur du rein, ou la capsule rénale.
    8. À l’aide de fermé les pinces à pousser vers le bas sur le côté droit du rein afin que le bassinet reste en vue, saisir la seringue à insuline chargée avec la main droite et maintenez-le parallèle à la surface de travail avec l’aiguille dirigée vers le bassinet du rein (Figure 2E). Introduire l’aiguille avec soin dans le bassinet du rein immobilisé comme illustré dans la Figure 1 b.
    9. Injecter la solution rapidement au sein de trois s. Environ un tiers du rein peut effacer et changer de couleur en blanc.
      Remarque : Il est fréquent d’observer l’accumulation de liquide dans la capsule après l’injection de reins ainsi que la formation d’un hématome. Quelques dommages sont nécessaire pour atteindre un niveau suffisant de la transfection d’ADN pour la détection.
    10. Maintenir l’aiguille en place pendant environ 10 s pour empêcher le reflux de la solution. Puis, lentement et avec précaution Retirez l’aiguille. Retourner à l’organe de la cavité abdominale en douceur qui s’étend de l’incision et en utilisant fermé forceps.
    11. Suture de la couche musculaire de l’animal avec des sutures résorbables 5-0, placer 2 à 4 noeuds indépendants.
    12. Suture de la couche de la peau de l’animal avec des sutures non résorbables en nylon 5-0 ou 6-0, placer 2 à 4 noeuds indépendants.
      Remarque : Instruments chirurgicaux peuvent être réutilisés après avoir placé dans un bain perle stérile et refroidis.

figure-protocol-1
Figure 1. Placement de site et aiguille incision correcte pour les injections de bassinet hydrodynamique. A) l’incision (ligne rouge) doit être située à environ 1 cm de la colonne vertébrale et à environ 1 cm sous la cage thoracique de la souris. B) après que le rein est exposé via l’incision du flanc, le bassinet doit être situé aussi à mi-chemin vers le bas le rein un petit point de transparent/blanc jaunâtre. L’injection ne devrait pas perturber la veine rénale, l’artère rénale ou l’uretère. L’aiguille de la seringue à insuline est inséré directement dans le bassinet du rein, tel qu’illustré sur une profondeur d’environ 0,5 cm et rapidement diminué dans les 2-3 s. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-2
Figure 2. Les étapes chirurgicales pour effectuer l’injection hydrodynamique bassinet d’ADN plasmidique. A) pince pincer la peau pour permettre au chirurgien de pratiquer une incision de flanc de ~ 1 cm avec un scalpel, tout d’abord à travers la couche de la peau, puis par le biais de la couche musculaire. B) utilisant deux paires de pinces fermées pour ouvrir la plaie opératoire, le rein est visualisé dans l’abdomen, si possible. C) avec une légère pression sur l’abdomen, sans toucher les organes directement, le rein est exposé dans l’incision du flanc. D) graisse ait été découpée doucement du rein, déranger elle aussi peu que possible pour assurer l’accès à du bassinet. E) appuyant sur le côté droit du rein gauche afin de mieux visualiser le bassinet du rein, la seringue est tenue avec le pouce sur l’abaisseur et l’aiguille est placée dans le bassinet délicatement mais fermement. F) qui suit le < 3 injection de s, de compensation peut-être être observés dans les domaines du rein qui a reçu la plus grande partie de l’injection. G) sutures résorbables vicryl violet stérile servent à confectionner des nœuds indépendants de 2 à 4 dans la couche musculaire. H) sutures non résorbables stérile en nylon bleu servent à confectionner des nœuds indépendants de 2 à 4 dans la couche de la peau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Récupération de la chirurgie et le suivi post-opératoire.
    1. Fournir des souris avec analgésique selon les exigences de l’institution de IACUC pour contrôler la douleur. Par exemple, administrer buprénorphine par voie sous-cutanée toutes les 8-12 h pendant 48 h après l’opération si des lésions rénales liées à AINS sont à éviter pour l’étude.
    2. Maintenez les souris sur une chaleur pad et suivi par le chercheur jusqu'à ce que complètement mobiles avec décubitus sternal. Lorsque complètement rétabli, retourner les souris à une cage propre contenant une petite quantité de litière dans leur cage maison pour réduire le stress. Ne pas les souris domestiques soumis à la chirurgie avec souris naïves.
      Remarque : La condition des souris s’améliorera rapidement, semblent avoir un comportement normal sous 24-48 h.
    3. Donne salines fluides et une augmentation de l’analgésie à souris qui apparaissent stressés pour améliorer leur condition. Si la souris ne récupèrent pas rapidement, mesurer le poids de la souris et euthanasier des souris qui ont perdu plus de 20 % de leur poids corporel initial. Euthanasier la souris apparaissant urémique ou autrement moribonde. Éventuels problèmes de santé sont détaillés dans le tableau 1.
      Remarque : Souris parfois retirer leurs sutures externes ou les sutures sont détacher avant la fermeture de la plaie. Mauvaise suture de la couche musculaire avec une couche de peau intacte peut entraîner une hernie sur le site d’incision, indiqué par le renflement. Dans ce cas, placez votre souris sous anesthésie (isoflurane est plus rapide que la kétamine/xylazine) et réparer le site chirurgical avec sutures nouveau dès que possible. Si les sutures non-absorbables peau restent après 10-14 jours, supprimez-les. Occasionnellement, souris peuvent enlever les sutures de leurs potes-cage ou se battre. Retirer les souris agresseur à leur propre cage avec un enrichissement pour les empêcher de blesser les autres souris dès qu’un tel comportement est identifié.
    4. Lorsque la santé ou des points de terminaison expérimentales sont atteints, euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone ou de surdosage isoflurane, suivie d’une méthode secondaire de l’euthanasie comme la dislocation cervicale selon le mode opératoire normalisé pour l’euthanasie dans placer dans l’établissement
CauseDébutNombre de souris affectéesSymptômesAction immédiateSolution à long terme
Endotoxines ADN contenuaprès l’injection 6-40 h.Susceptibles d’affecter chaque souris compte tenue de la préparation d’ADN contaminée.Problèmes respiratoires, des signes de douleur sévère, défaillance multiviscérale, mort.Euthanasier les souris touchées. Tester chaque composant injecté des endotoxines avec Limulus Amebocyte Lysate.Utilisez maxiprep exempte d’endotoxine trousses et seulement matériel stérile et nouvel ou imprégnées de NaOH de laboratoire. Utilisez un tampon acheté dans le commerce, endotoxine-testé pour diluer l’ADN.
Surdosage d’anesthésieAu cours de la chirurgie, avant ou après l’injection de l’ADN.Peut affecter seulement les souris plus jeunes, plus petits ou plus maigres.Cesser la respiration lors d’un coussin chauffant, miction.Diminuer l’anesthésie pour les autres souris.Vérifiez le protocole d’exactitude de dosage et de préparation. Exclure les « avortons ». Consulter le vétérinaire si la dose appropriée a été utilisée.
Bulle d’air dans la seringue ou une aiguille utilisée pour l’injectionImmédiatement après injection de bassinet du rein.À moins que toutes les seringues ont été chargés avec négligence, cela affecte seulement les souris.À bout de souffle.Vérifiez les autres seringues pour des signes de bulles d’air.Préparer les seringues soigneusement, tapant la seringue pour enlever les bulles au fond. Améliorer les conditions d’éclairage pour mieux visualiser les bulles.
Ouverture du site chirurgicalaprès l’injection 12-72 hUn ou plusieurs souris. Parfois la cage entière.Plaie béante, habituellement aucun autre détresseRépétez la suture pour réparer la plaie soigneusement sous anesthésie isoflurane avec technique stérile. Devrez arroser avec une solution saline ou de supprimer les bordures de la plaie avec des ciseaux.Si toutes les souris ont des sutures très courts ou manquants, il peut y avoir une souris supprimant, donc la souris peuvent être séparés. Améliorer la technique de suture. Utiliser les nœuds indépendants.
Hernie au site opératoire+ de 48 h après l’injectionUn ou plusieurs souris.Monticule est visible au site opératoire.Sous anesthésie isoflurane avec une technique stérile, couper la peau cicatrisée pour révéler la hernie de la couche musculaire. Remplacer les organes dans le péritoine, réparer la couche musculaire avec des sutures résorbables et fermer le site.Ceci indique mauvaise suture de la couche musculaire. Améliorer la technique de suture. Utiliser les nœuds indépendants.
Insuffisance rénale+ de 48 h après l’injectionUn ou plusieurs souris.Perte de poids > 20 %, éventuellement devenir urémique, voûté de postureFournir une solution saline et augmenter ou prolonger l’analgésie. Si aucune amélioration n’est constatée, sacrifier les souris touchées.Modifier l’état de la maladie de l’animal pour le rendre moins sévère. Modifier le transgène pour être moins fort ou inductible. Injecter la souris à un validant antérieure dans la progression de la maladie.
Abcès ou infectionQuelques jours ou semaines suivant la chirurgieUn ou plusieurs souris.Abcess palpable ou signes de septicémieEuthanasier les souris touchées. Demande d’autopsie pour confirmer la suspicion d’infection.Cela peut se produire lorsque les conditions chirurgicales et les injections ne sont pas suffisamment stériles. La procédure présentée est pour les souris avec un système immunitaire normal, mais encore des précautions doivent être prises dans le cadre des animaux immunodéprimés tels que ceux traités avec le cyclophosphamide.

Tableau 1. Tableau des potentiels problèmes de santé rencontrés durant le protocole d’injection de bassinet du rein. Bien que les problèmes de santé énumérés ne sont pas communes, il y a un certain nombre d’erreurs liées à l’enquêteur qui peut survenir au cours de la procédure. Ce tableau peut être d’une aide dans la prévention et le diagnostic des problèmes de santé, ainsi que pour la mise en œuvre des remèdes potentiels afin d’éviter ce genre de problèmes ne se produisent à l’avenir. Avec la pratique, enquêteurs devraient s’attendre à des problèmes de santé peu fréquentes et la mortalité en raison de la procédure.

3. évaluer les effets de l’efficacité et le transgène injection

  1. Utilisez un essai bien développé pour le transgène désiré afin d’évaluer l’efficacité de transfection. Utilisez les contrôles positifs et négatifs soigneusement pour s’assurer que le test est spécifique.
    Remarque : Selon le choix du promoteur, souris auront probablement la plus forte expression de transgene le jour 1 ; toujours dans la première semaine après l’injection.
  2. Effectuer une imagerie animale vivant de la luciférase en introduisant 10 µg de plasmide exprimant luciférase comme luciférase luciole améliorée à l’ADN dilué pour injection.
    1. Nettoyer toutes les surfaces exposées à des souris. Placez la première cage de souris dans la chambre et du sceau, qu'elle ferme. Assurez-vous il est assez isoflurane pour l’expérience en vérifiant le gage ; Si ce n’est pas le cas, ajouter isoflurane jusqu'à ce que le niveau atteigne la ligne « max ». Ouvrir le flux d’isoflurane en tournant le cadran de l’isoflurane 3.5 et l’oxygène à 2.
    2. Injecter chaque souris par injection intrapéritonéale avec 100 µL de luciférine décongelé 30 mg/mL. Enregistrer l’heure.
    3. Ouvrez le logiciel pour contrôler la machine d’imagerie en cliquant sur l’icône de souris orange et jaune. Sous « Select/Add User ID, » choisissez les initiales correctes dans le menu déroulant à côté de « Code d’utilisateur. » Cliquez sur « OK ». Sur la barre de menu, cliquez sur « Acquisition » et sélectionnez « Sauvegarde automatique à... » dans le menu déroulant. Sélectionnez le dossier ou créer un nouveau dossier pour enregistrer les données.
    4. Accédez à la zone d’acquisition image dans le coin inférieur droit. Vérifiez que les réglages automatiques sont les suivants : Binning, moyen ; F/Stop, 1 pour luminescents, 8 pour la photographie ; Filtre d’émission, ouverte ; Mode d’imagerie documentaire, vérifie seulement regard Luminescent, photographie, superposition et l’alignement. Cliquez sur « initialiser » pour initialiser le système et attendre l’initialisation à la fin, puis changer le « champ de vision » à « E » à l’image des cinq souris.
    5. Tourner le robinet pour l’anesthésie tube tel que les nosecones à l’intérieur de la machine administrez isoflurane. Placer les animaux à l’intérieur de la machine d’imagerie dans l’ordre souhaité sur le ventre avec le dos face à la caméra ci-dessus pour visualiser les reins. Si plus d’une cage doit être imagé, placez la cage suivante dans la chambre de l’isoflurane.
    6. 5-10 min après injection de luciférine, appuyez sur « Acquisition » de prendre l’image.
    7. Dans la « Palette » sur la droite, cliquez sur « Image Adjust. » En vertu de le « Échelle de couleurs, » diminuer la barre « Min » jusqu'à ce que l’expression se manifeste dans toutes les souris attendus, visualisées comme violet sur chaque rein de souris. Si une souris ne présentent pas d’expression, pour réinjecter les souris avec 100µl de la luciférine et attendre au moins 3 min avant de redemander.
      1. Si l’image a saturé pixel, diminuer le temps d’exposition et acquérir à nouveau pour obtenir une image quantitative car la présence de pixels saturés se traduira en sous-estimant l’efficacité de transfection. Le temps d’exposition possible le plus bas est de 0,5 s.
      2. Si l’image montre la seule expression du gène faible à la première fois de l’exposition, augmenter la durée d’exposition jusqu'à 2 min et reacquire. Chaque fois que l’image est reporté, les données sont enregistré automatiquement dans le dossier choisi donc toutes les images sont disponibles pour une analyse ultérieure plus tard.
    8. Répétez les étapes d’imagerie pour les cages de souris.
    9. Retirer les souris de la machine d’imagerie. Fermez le gaz. Nettoyer la chambre, de nosecones et stade d’imagerie. Fermez le programme d’ordinateur.
      Remarque : Le logiciel vous demandera de « Enregistrer le groupe de données. » Il s’agit des manipulations faites au groupe de données, pas les données elles-mêmes.
      1. Cliquez sur « Oui » pour enregistrer les modifications dans l’échelle et les régions d’intérêt (ROIs). Cliquez sur « Non » pour restaurer les paramètres d’origine pour les images.
    10. Pour l’analyse de données, ouvrez le logiciel. Dans la « Palette » cliquez sur « Outils de ROI ». Cliquez sur l’icône de cercle et cliquez sur « 1 » dans le menu déroulant pour placer un nouveau ROI dans la fenêtre d’image comme il est indiqué par un ovale rouge avec quatre carrés autour d’elle. Ajuster la taille du ROI en plaçant le curseur de la souris sur un carré rouge en faisant glisser pour joindre la zone violette qui vient se superposer le rein injecté.
      1. Avec le curseur sur un carré rouge sur le retour sur investissement, faites un clic droit puis sélectionner « Dupliquer le ROI » pour créer un nouveau ROI dans la fenêtre de l’image et déplacez-la vers la prochaine souris. Répétez la procédure jusqu'à ce que toutes les souris dans l’image ont un retour sur investissement sur le rein injecté.
      2. Dans le menu directement au-dessus de l’image, changer « Unités » de « Chefs » à « Radiance (Photons). » Pour exporter les données ROI, dans la « Palette d’outils », cliquez sur « Outils de ROI », puis cliquez sur l’icône de crayon/règle pour créer une feuille de calcul des mesures. Utilisez la mesure « Avg Radiance » dans une analyse plus approfondie dans le programme de statistiques et d’analyse des données de choix.
  3. Effectuer la coloration de coupes comme décrit11.
    Remarque : L’injection ne pas transfecter le rein entier également pour différentes sections capturera transfection différentes efficacités11. Coinjection de perles comme latex fluorescente microsphères peuvent aider à identifier les régions devrait être positifs transgène (Figure 3D)11. Optimisation du protocole de coloration est extrêmement importante.
  4. Effectuer la tache occidentale afin d’identifier le gène d’intérêt dans le rein transfectée.
    NOTE : Récolte d’organes pour les extraits de protéine doit être fait sur la glace. Encore une fois, n’utilisez pas une petite tranche de l’orgue, car ce domaine ne peut pas ont été transfecté bien. Transfection est inégalement répartie dans l’ensemble de l’organe ainsi combiner différents domaines et leur piscine. Bassinet injection hydrodynamique d’un plasmide produisant l’hormone érythropoïétine a entraîné une augmentation modeste de l’hématocrite, donc il est prévu que les produits sécrétés transgène devraient se trouver dans la circulation11.
  5. Pour l’expression de haut niveau à long terme de transgènes, combiner un intégrateur système de vecteur avec des agents immunosuppresseurs comme le cyclophosphamide. La réponse immunitaire au transgène se produit au cours de la première, plusieurs semaines après l’injection et est robuste11.

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Résultats

La technique d’injection et de la chirurgie sont simples à effectuer une fois maîtrisé, nécessitant pas de matériel lourd ou matériaux coûteux. Si la nouvelle à la chirurgie rénale flanc-incision, une journée de formation sur plusieurs souris, à la demande d’euthanasie devrait pouvoir dans laquelle les souris ne sont pas récupérée après une chirurgie parce que la première tentative à cette chirurgie peut prendre beaucoup plus longtemps que la normale. Par ailleurs, enquêteurs connaissent ...

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Discussion

Dans le présent protocole est décrit une méthode robuste pour parvenir à l’expression des gènes reproductible expressément dans le rein. Dans les mains d’un chirurgien moyennement expérimenté, nous avons trouvé le pourcentage de souris transfectées par cette technique d’être dans la gamme de 50 à 100 %, selon l’âge de la souris et la sensibilité de la lecture du transgène. Le niveau d’expression de gène de luciférase dépassait de fond pendant plusieurs mois chez les souris recevant les transposons piggyBac et co...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer et à ne déclarer aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Une bourse de développement de carrière du ministère des anciens combattants [BX002797] soutenu L.E.W. et le National Institutes of Health [R01-DK095867] et American Heart Association [15GRNT25700209] soutenu J.C. Le National Institutes of Health [DK093660], ministère des anciens combattants [BX002190] et le centre de Vanderbilt pour une maladie rénale, prise en charge M.H.W. Ce matériau est le résultat d’un travail soutenu avec les ressources et l’utilisation des installations du système de soins de santé VA Tennessee Valley.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AnaSed XylazinePatterson Veterinary07-808-1947Anesthésique - Substance non contrôlée
BD Seringue à insuline 0,5 mL 29G 1/2 pouceCardinal Health309306Seringues requises
BuprenexPharmacien/VétérinaireAnalgésie - Substance contrôlée
Dynarex Drap de serviette jetableThermo Fisher Scientific19-310-671Placer sur un coussin chauffant
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Utiliser uniquement de l’ADN plasmidique sans endotoxines
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive ControlCharles RiverPC200Contrôle positif pour le test d’endotoxines
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single TestVial Charles RiverR13500Test d’endotoxines
Micro Dissection extra fine CiseauxRoboz Surgical InstrumentRS-5882Outil chirurgical
Fisherbrand Pochette de stérilisation à fermeture instantanée - 9"Thermo Fisher Scientific01-812-51Pour l’autoclave des outils chirurgicaux
Pompe à chaleur GaymarParagon MedicalTP-700Pompe à chaleur à circulation d’eau
Germinator 500Roboz Instrument chirurgicalDS-401Pour réutiliser les outils chirurgicaux pendant l’opération
Graefe PinceInstrument chirurgical RobozRS-5136Outil chirurgical
Graefe Pince à tissusInstrument chirurgical RobozRS-5153Outil chirurgical
Halsey Porte-aiguille, 5 » de longueurInstrument chirurgical RobozRS-7841Outil chirurgical
Coussins chauffants - 15 » x 21 » - nécessite au moins 3Paragon MedicalTP22GÀ utiliser avec la pompe
à chaleur GaymarIsoFlo (Isoflurane, USP)Abbott Animal Health5260-04-05Pour l’imagerie et l’euthanasie
Système d’administration d’isoflurane Isotec VaporisateurSmiths MedicalVCT3K2Pour l’imagerie et l’euthanasie
KétaminePharmacien/VétérinaireAnesthésique - Substance contrôlée
KimwipesKimberly-Clark Professional34120Tissus de laboratoire
Logiciel d’image vivanteCaliper Life SciencesPour l’imagerie d’animaux vivants
LuciferinPerkin Elmer122796Pour l’imagerie d’animaux vivants
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000-US-CANSpectrophotomètre pour la mesure
de l’ADN Prevantics SwabsThermo Fisher Scientific23-100-110Pour la préparation à la chirurgie de la peau Prolene
5-0 sutures Taper 30"Thermo Fisher ScientificNC0256891Sutures non résorbables pour la peau
Puralube Brand Opthalmic OintmentPatterson Veterinary07-888-2572Pour garder les yeux humides pendant la chirurgie
Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery SolutionMirus BioMIR-5240Tampon de distribution hydrodynamique pour diluer l’ADN
Vicryl 5-0 Sutures J303HThermo Fisher ScientificNC9816710Sutures résorbables pour couche musculaire
Wahl Mini Arco ClipperMed-Vet International8787-1550Rasoir pour la préparation de la peau
Xenogen IVIS 200Caliper Life SciencesPour l’imagerie d’animaux vivants

Références

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Réimpressions et autorisations

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