Article de méthode

Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

DOI :

10.3791/56358

⸱

3 décembre 2017

 , 
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode pour générer des progéniteurs interneurones corticaux et des interneurones post-mitotiques précurseurs de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide d’une méthode modifiée de corps-à-monocouche embryoïdes. Ces cellules souches/précurseurs peuvent être utilisés in vitro fluorescent triés et transplantés dans le néocortex néonatal pour l’étude de détermination de sort ou utilisés dans des applications thérapeutiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les corticales interneurones GABAergiques sont une population hétérogène de cellules qui jouent un rôle crucial en réglementant la production de neurones pyramidaux excitatrices mais aussi de synchroniser les sorties des ensembles de neurones pyramidaux. Les déficits en fonction d’interneurones ont été impliqués dans une variété de troubles neuropsychiatriques, y compris la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La dérivation des interneurones corticaux de cellules souches embryonnaires permet non seulement pour l’étude de leur développement et leur fonction, mais donne un aperçu sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie des affections interneurones corticale. Interneurones ont également la capacité remarquable de survivre, migrer et intégrer dans hôte des circuits corticaux après la transplantation, rendant les candidats idéaux pour une utilisation dans les thérapies cellulaires. Nous présentons ici une méthode monocouche-à-corps embryoïdes évolutive, hautement efficace, mis à jour le pour la dérivation des progéniteurs d’interneurones exprimant Nkx2.1 et leur progéniture de cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). En utilisant une ligne de mESC journaliste double Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, progéniteurs Nkx2.1 ou leur progéniture post-mitotiques exprimant le Lhx6 peut être isolé par cellule activée par fluorescence triant (FACS) et par la suite utilisé dans un certain nombre d’applications en aval. Nous fournissons également des méthodes pour enrichir pour la parvalbumine (PV) ou de la somatostatine sous-groupes d’interneurones (SST), qui peut être utile pour l’étude des aspects de la détermination du sort ou pour une utilisation dans des applications thérapeutiques qui pourraient bénéficier d’interneurones enrichie en sous-groupe transplantations d’organes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chez les souris et les humains, environ la moitié des interneurones inhibiteurs tout corticales (CIns) sont créés dans une structure sous-corticale transitoire appelée l’éminence ganglionnaire médial (MGE), où les progéniteurs neuroépithéliales CIns et autres neuronales et gliales sous-groupes d’exprimer le facteur de transcription Nkx2.11,2. Sous-groupes de CIn ou sous-types sont définis par intersection morphologiques, neurochimiques, électrophysiologique et connectivité caractéristiques3,4. Les CIns MGE-dérivés peuvent être regroupés en sous-groupes pour la plupart non-cumul basé sur leur expression de PV ou de SST, l’expression de qui est en corrélation avec notamment électrophysiologiques et connectivité tendances5. Dysfonctionnement des interneurones, surtout dans le sous-groupe de PV, a été impliqué dans plusieurs neuropsychiatriques troubles et maladies6,7. L’objectif général de cette méthode est de produire des cellules souches dérivées de cellules souches mitotiques et migrateurs précurseurs enrichis pour PV ou SST CIn sort pour étudier la biologie des interneurones corticaux et pour utilisation dans les thérapies à base cellulaire.

Nous avons développé une méthode évolutive et très efficace pour la dérivation des progéniteurs d’interneurones exprimant Nkx2.1 et leur progéniture de mESCs. À l’aide d’un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP double journaliste mESC line8, progéniteurs Nkx2.1 ou leur progéniture post-mitotiques exprimant le Lhx6 peut être isolées par l’intermédiaire de FACS et par la suite utilisé dans un certain nombre d’applications en aval. En manipulant un certain nombre de voies de signalisation, de la durée de la culture et le mode de la neurogenèse, nous pouvons obtenir des millions de précurseurs interneurone fluorescent étiquetés convenant à une multitude d’applications en aval.

Bien que plusieurs autres méthodes existent pour générer des progéniteurs MGE-like du mESCs9,10,11,12,13,14, notre méthode, qui repose sur la voie Wnt antagoniste de XAV-939, est particulièrement efficace de générer des Foxg1/Nkx2.1 exprimant des progéniteurs télencéphaliques. En outre, la possibilité de sélectionner des progéniteurs interneurone ou leur progéniture exprimant le Lhx6 post-mitotiques via notre système de double Rapporteur, améliore grandement la capacité de générer des cellules souches distinctes et leur progéniture.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Remarque : La ligne de mESC double journaliste décrite dans le présent protocole est disponible sur demande (sande@mail.med.upenn.edu).

1. préparation de support

NOTE : Réchauffer tous les médias à 37 ° C avant de l’utiliser en culture cellulaire.

  1. Médias de fibroblastes embryonnaires souris (MEF) (pour préparer 500 mL)
    1. Ajouter sérum foetal 50 mL (SVF) à 449 mL de milieu (DMEM modifié de l’aigle) de Dulbecco et filtrer sur une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.
    2. Ajouter 1 mL antimicrobial agent (50 mg/mL) après filtration. Stocker les médias à 4 ° C jusqu'à 1 mois ou partie aliquote et magasin à ≤-20 ° C.
  2. Médias de N2 (pour préparer 500 mL)
    1. Ajouter 5 mL L-alanine-L-glutamine (x 100) et 500 µL 2-mercaptoéthanol (55 mM) à 489,5 mL DMEM : mélange de nutriments F-12 (DMEM/F-12) et filtrer sur une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.
    2. Ajouter agent antimicrobien de 1 mL (50 mg/mL) et 5 mL N2 Supplément-B après filtration. Entreposer les médias à 4 ° C à l’obscurité pendant environ 1 mois.
  3. Milieu sans sérum croissance (KSR) (pour préparer 500 mL)
    1. Ajouter 75 mL supplément moyen sans sérum, 5 mL L-glutamine (x 100), 5 mL MEM (MEM-NEAA) des acides aminés Non essentiels (x 100), et 500 µL 2-mercaptoéthanol (55 mM) à 413,5 mL non-glutamine contenant DMEM et filtrer à travers une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.
    2. Ajouter 1 mL antimicrobial agent (50 mg/mL) après filtration. Stocker les médias à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  4. Médias de cellules souches embryonnaires de souris (pour préparer 500 mL)
    1. Ajouter catégorie de cellules souches 75 mL FBS, 5 mL MEM-NEAA (x 100), 5 mL L-glutamine (x 100), et 500 µL 2-mercaptoéthanol (55 mM) à 413,5 mL non-glutamine contenant DMEM et filtrer à travers une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.
    2. Ajouter 1 mL antimicrobial agent (50 mg/mL) après filtration. Entreposer les médias à 4 ° C à l’obscurité pendant jusqu'à un mois ou partie aliquote et stocker à ≤-20 ° C.

2. culture mESCs

  1. Plaque des cellules nourricières MEF mitotically inactifs dans les médias sur des plaques de culture de tissus traitée à 3-4 x 104 cellules/cm2MEF. Laissez au moins 12 heures pour eux de s’installer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2 avant les mESCs de placage. Si ne pas utilisée immédiatement, remplacer les médias MEF tous les 3 jours. Disposer de MEFs si ne pas utilisé dans les 7 jours du bordé.
  2. Ajouter mESCs (gamme de densité de 1-4 x 104 cellules/cm2) aux plaques de MEF dans mESC milieux contenant du facteur inhibiteur de leucémie de souris (mLIF) (1 000 U/mL). Incuber les cellules à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2.
  3. Passage de mESCs à l’aide de la trypsine-EDTA (0,05 % trypsine) (1:5-1:10) une fois que le plat devient ~ confluente de 70 à 80 % ou si les colonies commencent à toucher. En général, cela se produit tous les 2 jours, mais peut prendre jusqu'à 4 ou 5 jours selon la densité des ensemencements initiaux.
  4. Maintenir les mESCs sur une couche de conducteur MEF dans mESC moyen de garder la pluripotence.
  5. Avant de commencer la différenciation, le passage des cellules au moins une fois sur des plaques de gélatine enduit sans MEFs diluer sur les MEFs.
    1. Préparer des plaques de gélatine enduit en ajoutant 0,1 % gélatine dans saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Ca2 +/Mg2 + pour un plat de culture de tissus traité et laissant à 37 ° C pendant au moins 1 h. plaque de 1,5 à 2 x 106 cellules/10 plaque de cm (2,7 à 3,6 x 104 cellules/cm2) et laissez les cellules afin d’élargir pour 2 jours avant le début de la différenciation.

3. différencier les mESCs vers MGE-comme progéniteurs télencéphaliques

  1. Jour de différenciation (DD) 0 = « float cellules »
    1. Après que les mESCs ont cultivé sur des plaques de gélatine couché pendant 2 jours, aspirer les médias et laver les cellules une fois avec du PBS sans Ca2 +/Mg2 +. Ajouter suffisamment la trypsine-EDTA (0,05 % trypsine) pour couvrir la surface de la plaque (en général 4 mL trypsine-EDTA pour un plat de culture de tissu de 10 cm) et remettre les cellules dans l’incubateur à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2 pendant 4 min.
    2. Après 4 min, étancher la trypsine-EDTA à l’aide de 2 fois le volume avec les médias de la mescaline. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de taille appropriée et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Après 5 min, retirez le tube et aspirer les médias sans déranger le culot. Resuspendre le culot dans 1 mL KSR:N2 media (1:1) contenant l’inhibiteur BMP LDN-193189 (250 nM) et l’inhibiteur de la voie Wnt XAV-939 (10 µM).
    3. Mesurer la concentration de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées. Démarrer les cellules en croissance comme corps embryoïdes (EBs) en ajoutant 75 000 cellules/mL dans les médias de la KSR:N2 (1:1) contenant LDN-193189 (250 nM) et XAV-939 (10 µM) dans les plats de culture de tissus non adhérents. Incuber les cellules à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2.
  2. DD1, préparer pour la cellule « atterrissage » par revêtement tissu traité Pétri avec poly-L-lysine (10 µg/mL dans du PBS avec Ca2 +/Mg2 +) du jour au lendemain (O/N) à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative ou pendant au moins 1 h.
  3. DD2, aspirer la poly-L-lysine et enduire les plaques de laminine (10 µg/mL dans du PBS avec Ca2 +/Mg2 +) O/N à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative.
    Remarque : O/N est optimale, aussi peu que 2 h peut être suffisante. Si les plaques ne sont pas utilisés par le lendemain, aspirer la laminine, de remplacer avec du PBS sans Ca2 +/Mg2 +et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.
  4. DD3 (« terre de cellules »)
    1. Avant de commencer la dissociation EB, aspirer la laminine et laisser les plaques à sécher sous une hotte de culture de tissus. Ne pas utiliser de plaques qui apparaissent brillantes ou visiblement humide. Transférer l’EBs avec les médias dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 3-4 min à 15 x g, ou jusqu'à ce que l’EBs ont granulée.
  5. Aspirer les médias et ajouter 3 mL de solution de détachement de cellules contenant la DNase (2 U/mL) et incuber à 37 ° C avec une humidité relative ≥ 95 % et 5 % CO2 pendant 15 min. balayer doucement le tube toutes les 3 min pour aider à la dissociation de l’EB.
  6. Une fois que l’EBs ne sont plus visibles ou 15 minutes se sont écoulées, ajoutez 6 mL KSR:N2 (1:1) contenant la DNase (1 U/mL) et centrifuger pendant 5 min à 200 x g.
  7. Les cellules de KSR:N2 (1:1) contenant LDN-193189 sur plaque (250 nM), XAV-939 (10 µM) et l’inhibiteur ROCK Y-27632 (10 µM) à 4,5 à 5 x 104 cellules/cm2.

4. enrichissement personnel SST protocole : « DD12 GFP haute Sonic Hedgehog (SHH) » (suite de l’étape 3,7)

  1. Sur DD5, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) et SSH (50 ng/mL).
  2. Préparer la modification des plaques le jour 8 (étape 4.4) plaques de culture de tissu en suivant les instructions décrites aux étapes 3.2-3.3.
  3. Sur DD7, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) et SHH (50 ng/mL).
  4. Sur DD8, re-plaque les cellules.
    NOTE : Bien que cette étape n’est pas essentielle, ré-ensemencement des cellules peut réduire types cellulaires début dissociés, indésirables. Modification des plaques aussi rompt les boules des cellules qui compliquent l’analyse immunohistochimique en aval et augmente l’efficacité des FACS aux moments plus tard.
    1. Pour re-plaque de cellules, de détacher les cellules de la plaque avec la trypsine-EDTA (0,05 % trypsine) pendant 5 min à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2. Étancher la trypsine-EDTA avec 2 fois le volume de KSR:N2, et centrifuger à 200 x g pendant 5 min. filtrer les cellules à travers un tube de filtre de 40 µm pour éliminer tout amas. Re-plaque les cellules à 250 000 cellules/cm2 à N2/KSR (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) et Y-27632 (10 µM) avec SHH (50 ng/mL).
      Remarque : Si au lieu de cela, la décision est prise ne pas à re-plaque les cellules sur DD8, changer les médias avec KSR:N2 contenant SHH (50 ng/mL) tous les 2 jours de DD7 à DD12 et continuer à ajouter des IGF-1 (20 ng/mL) et FGF-2 (10 ng/mL) jusqu'à DD9.
  5. Sur DD10, changer les médias avec KSR:N2 contenant SHH (50 ng/mL).
  6. Sur DD12, pour obtenir des cellules qui sont enrichis pour les sous-types de SST, utilisez FACS pour isoler Lhx6::GFP-exprimant seulement les cellules.
    1. Pour détacher les cellules, utilisez un réactif de dissociation cellulaire contenant non-trypsine plutôt que la trypsine-EDTA. Laver les cellules une fois avec du PBS sans Ca2 +/Mg2 +. Ajouter pré chauffé non-trypsine contenant la dissociation cellulaire réactif contenant DNase (2 U/mL) pour les cellules. Placez-les dans l’incubateur à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2 pendant 10 à 30 min ou jusqu'à ce que les cellules ont détaché. Secouer doucement les plaques toutes les 5 min pour la dissociation de l’aide.
      Remarque : Pour les cultures DD11-12, seulement 10-15 min peut être nécessaire. Pour les cultures DD15-16, 30 min ou plus peuvent être requis pour une dissociation complète.
    2. Une fois que les cellules ont complètement levées au large de la plaque, procéder à l’isolement de FACS en utilisant les protocoles standards ou utiliser les cellules dans d’autres analyses en aval.

5. PV-enrichir protocole : « DD11/DD17 mCherry + aPKCi » (suite de l’étape 3,7)

  1. Sur DD5, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Préparer des plaques de culture de tissus pour ré-ensemencement sur DD8 (étape 4.4) en utilisant les instructions décrites dans les étapes 3.2-3.3.
  3. Sur DD7, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL).
  4. Sur DD8, re-plaque les cellules comme indiqué au point 4.4, avec les exceptions suivantes : lorsque la modification des plaques les cellules, remplacez SHH lissé agoniste (SAG ; 30 nM) et ajouter des inhibiteur de PKC atypique (aPKCi ; 2 µM). Pris ensemble, les médias re-électrodéposition est maintenant N2/KSR (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) et aPKCi (2 µM).
  5. Sur DD10, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM).
  6. DD11
    Remarque : À ce stade, les cellules Nkx2.1::mCherry+ sont enrichis pour devenir PV CIns.
    1. Détacher les cellules de la plaque des FACS en utilisant le même protocole décrit à l’étape 4.6. Si la décision est prise à prélever des cellules Nkx2.1::mCherry+ à une date ultérieure de la différenciation, ignorez cette étape.
  7. Sur DD12, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM). Sur DD14, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM). Sur DD16, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM). Sur DD17, recueillir les cellules Nkx2.1::mCherry+ en utilisant le même protocole décrit à l’étape 4.6.

6. PV-enrichir protocole : « DD17 mCherry Low SHH » (suite de l’étape 3,7)

  1. Sur DD5, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL). Sur DD7, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Sur DD9, changer les médias avec KSR:N2 (1:1). Partir de ce moment, aucun facteur de croissance supplémentaires ne sont nécessaires.
    1. Continuer à changer les médias tous les 2 jours jusqu'à la récolte des cellules sur DD17.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit dans le présent document est une version modifiée de nos protocoles publiés15,16,17 et a été optimisé pour une utilisation avec notre gamme de double-journaliste mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. En ajoutant l’inhibiteur de la voie Wnt XAV-939 du DD0-5, combiné avec la modification des plaques à DD8, nous obtenons robuste Nkx2.1 induction, dans lequel plus de 50 % de tous les no...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alors que cette méthode est très efficace pour le patterning mESCs dérivé de J1 (CPCR-1010), nous avons connu un succès variable avec d’autres lignes de la mescaline et isolats clonales. Par exemple, Foxg1::venus mESCs (dérivés EB3 ; Danjo et al. 13) répondent mal au présent protocole et l’induction de la Foxg1 par DD12 est typiquement sur l’ordre de 1 à 2 %. Pour des raisons que nous ne comprenons pas entièrement, clone de journaliste double un autre Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP (appelé JQ5...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants à Qing Xu pour développer le Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP double journaliste mESC ligne ainsi que Jennifer Tyson, Asif Maroof et Tim Petros pour leur premiers travaux sur les façons d’élaborer ce protocole. Nous remercions également le noyau de cytométrie de flux CHOP pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu par un NIH R01 MH066912 (SA) et F30 MH105045-02 (DT).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Système de filtre sous vide pour bouteilleCorningCLS430769
Tube à essai avec filtre cellulaire Snap CapThermoFisherCorning 352235
Fibroblastes embryonnaires de souris (CF-1 MEF IRR 7M)MTI-GlobalstemGSC-6101G1 flacon de 7M MEF suffit pour quatre plaques TC de 10 cm. Références : 29,35
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2Aussi connu comme agent antimicrobien. Ne filtrez pas avec un média de base - ajoutez-le après la filtration. Références : 9,11,36,37
N2 supplement-BStemcell Technologies7156Ne pas filtrer avec le média de base -- ajouter après filtration
Glutamax (100x)ThermoFisher35050061Également connu sous le nom de L-alanine-L-glutamine. Références : 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR)ThermoFisher10828028Aussi connu sous le nom de supplément moyen sans sérum. Références : 9,11
L-glutamine (100x)ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018Aussi connu sous le nom de DMEM non contenant de la glutamine. Références : 9,11
Hyclone FBSVWR82013-578Aussi connu sous le nom de FBS de qualité cellule souches. Références : 9,11
Boîte de Pétri traitée pour culture tissulaire (10cm)BD Falcon353003
Boîte de Pétri stérile non adhérente (10cm)VWR25384-342
Facteur inhibiteur de la leucémie (mLIF)ChemiconESG1107Ne pas congeler, conserver à 4'C. Références : 9,11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
0.1 % Gelatin SolutionATCCATCC PCS-999-027
LamininSigmaL2020
Poly-L-lysineSigmaP6282
Trypsine-EDTA (0,05 %)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501également connu sous le nom de réactif de dissociation cellulaire sans trypsine. Références : 9,11
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074Remettre en suspension dans DMSO et stocker à -80'C dans les aliquotes à usage unique
XAV939Stemgent04-0046en suspension dans DMSO et stocker à -80'C dans les aliquotes à usage unique
rhFGF-2R& D Systems233-FBRemise en suspension dans PBS avec 0,1 % BSA et stockage à -80'C dans des aliquotes à usage unique
rhIGF-2R& D Systems291-G1Remettre en suspension dans le PBS avec 0,1 % de BSA et stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique
Inhibiteur de ROCK (Y-27632)Tocris1254Remettre en suspension dans le DMSO et stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique
Agoniste lissé (SAG)Millipore566660-1MGRemettre en suspension dans H20 et stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique
rm Sonic Hedgehog/SHHR& D Systems464-SH-025Remettre en suspension dans le PBS avec 0,1 % BSA et stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique
PKC&zeta ; Inhibiteur de pseudosubstrat, EMD myristoyléMillipore539624Se remettre en suspension dans H20 et se stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique
Remettre

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841(2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956(2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622(2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron DifferentiationNkx2 1 ProgenitorsFluorescence Activated Cell SortingEmbryoid Body Monolayer MethodParvalbumin Interneuron EnrichmentSomatostatin Interneuron SubgroupsDual Reporter mESC LineCell Transplantation ProtocolNeural Fate Determination

Articles connexes