Flux de travail basé sur la combinaison de traceur isotopique des expériences pour étudier le métabolisme microbien de multiples Sources d’éléments nutritifs

Audrey Bloem; Stephanie Rollero; Pauline Seguinot; Lucie Crépin; Marc Perez; Christian Picou; Carole Camarasa

doi:10.3791/56393

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Flux de travail basé sur la combinaison de traceur isotopique des expériences pour étudier le métabolisme microbien de multiples Sources d’éléments nutritifs

9.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/56393

⸱

22 janvier 2018

Audrey Bloem¹ , Stephanie Rollero² , Pauline Seguinot¹ , Lucie Crépin³ , Marc Perez¹ , Christian Picou¹ , Carole Camarasa¹

¹UMR SPO, INRA, SupAgroM, Université de Montpellier, ²IWBT Stellenbosch University, ³PILI, Toulouse White Biotechnology

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une procédure expérimentale pour quantitativement et complètement étudier le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs. Ce flux de travail, basé sur une combinaison d’expériences de traceur isotopique et une méthode d’analyse, permet le sort des nutriments consommés et l’origine métabolique des molécules synthétisée par des microorganismes à déterminer.

Résumé

Études dans le domaine de la microbiologie s’appuient sur la mise en œuvre d’un large éventail de méthodes. En particulier, le développement de méthodes appropriées contribue substantiellement à fournir une connaissance approfondie du métabolisme des microorganismes qui poussent dans des milieux chimiquement définis contenant l’azote unique et sources de carbone. En revanche, la gestion par le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs, malgré leur large présence dans des environnements naturels ou industriels, demeure pratiquement inexplorée. Cette situation est principalement due au manque de méthodologies appropriées, qui entrave les enquêtes.

Nous rapportons une stratégie expérimentale quantitativement et complètement explorer comment le métabolisme fonctionne lorsqu’un nutriment est fourni comme un mélange de molécules différentes, par exemple, une ressource complexe. Nous décrivons ici son application pour l’évaluation de la répartition des multiples sources d’azote à travers le réseau métabolique de la levure. Le flux de travail combine l’information obtenue au cours d’expériences de traceur isotopique à l’aide de sélectionné ¹³C - ou des substrats marqués au N ¹⁵. Tout d’abord, il se compose des fermentations parallèles et reproductibles dans le même milieu, qui comprend un mélange de molécules contenant du N ; Toutefois, une source d’azote sélectionné est étiquetée chaque fois. Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) est mis en place pour évaluer les modèles étiquetage des composés ciblés et de quantifier la consommation et la récupération des substrats dans les autres métabolites. Une analyse intégrée de l’ensemble de données complet donne un aperçu du sort des substrats consommés dans les cellules. Cette approche nécessite un protocole précis pour la collecte d’échantillons – facilité par un système assistée par robot de surveillance en ligne des fermentations – et la réalisation de nombreuses analyses fastidieuses. Malgré ces contraintes, elle a permis de comprendre, pour la première fois, la séparation des multiples sources d’azote dans tout le réseau métabolique de la levure. Nous avons élucidé la redistribution d’azote provenant de sources plus abondantes vers autres composés N et déterminé l’origine métabolique des molécules volatiles et acide aminé.

Introduction

Comprendre comment opère de métabolisme microbien est une question clé pour la conception de stratégies efficaces pour améliorer les procédés de fermentation et de moduler la production de composés par fermentation. Progrès de la génomique et de la génomique fonctionnelle dans ces deux dernières décennies a largement contribué à étendre la connaissance de la topologie des réseaux métaboliques de nombreux micro-organismes. Accès à ces informations a conduit à l’élaboration d’approches qui visent pour un aperçu complet de la fonction cellulaire¹. Ces méthodes reposent souvent sur une interprétation basée sur des modèles de paramètres mesurables. ....