Article de méthode

Mis à jour le rouleau Tube méthode d’imagerie Intermittent précisément localisé et répétitif au cours de la Culture à long terme des tranches de cerveau dans un système fermé

DOI :

10.3791/56436

⸱

28 décembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Présenté ici est la méthode du tube mis à jour le rouleau pour la culture et intermittent une imagerie du cerveau rongeur tranches sur plusieurs semaines avec un repositionnement précis sur couvre-objet en photodécoupe. Viabilité neuronale et la morphologie de la tranche sont bien entretenus. Sont prévues des adaptations de ce système entièrement fermé à l’aide de virus pour l’expression spécifique de type cellulaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coupes de cerveau de rongeurs cultivées sont utiles pour étudier le comportement moléculaire et cellulaire des neurones et des cellules gliales dans un environnement qui soutient plusieurs de leurs interactions normales en vivo . Tranches provenant d’une variété de lignées de souris transgéniques ou utilisation de vecteurs viraux pour l’expression des protéines fluorescent étiquetées ou reporters dans les coupes de cerveau de type sauvage permettent d’imagerie haute résolution en microscopie par fluorescence. Bien que plusieurs méthodes ont été développées pour l’imagerie des tranches de cerveau, alliant la culture tranche avec la capacité d’exécuter répétitives une imagerie de cellules spécifiques en tranches direct sur de longues périodes a posé des problèmes. Cela est particulièrement vrai lorsque les vecteurs viraux sont utilisées pour l’expression des protéines exogènes, puisque cela se fait mieux dans un système fermé pour protéger les utilisateurs et d’éviter toute contamination croisée. Nous rapportons des simples modifications apportées à la méthode de culture de rouleau tube cerveau tranche qui permettent pour l’imagerie haute résolution répétitive des tranches sur plusieurs semaines dans un système fermé. Cultivant les tranches sur des lamelles de photodécoupe permet l’utilisation de repères de rapidement et précisément repositionner la scène pour l’image du champ identique au fil du temps avant et après des traitements différents. Des exemples sont donnés pour l’utilisation de cette méthode combinée à une coloration neuronale spécifique et expression d’observer les changements dans l’architecture tranche hippocampe, expression neuronale induite par virale de protéines fluorescentes et le développement de la pathologie cofilin, qui a été précédemment observé dans l’hippocampe de la maladie d’Alzheimer (ma) en réponse au traitement de la tranche avec des oligomères de peptide amyloïde-β (Aβ).

Introduction

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Des cultures primaires de neurones dissociés des régions du cerveau de rongeur sont un outil important utilisé par les chercheurs pour observer les réponses à pathologiquement impliqués des stimuli. Toutefois, ces études présentent l’inconvénient de regarder les neurones en 2D uniquement et sans leur système de soutien glial. En outre, sauf s’il est cultivé dans des conditions de très haute densité (640 neurones/mm2 ou environ 16 % de la surface) dans lequel il devient impossible de suivre l’excroissance au hasard d’une dendrite ou axone depuis plus d’une courte distance de son corps cellulaire, hippocampe viabilité neuronale pendant 4 semaines diminue de façon importante1, limitant l’utilisation de cultures dissociées des études étendues des pathologies liées au vieillissement. La mise en culture des tranches préparés à partir de cerveau de rongeur est une option intéressante qui permet de surmonter ces limitations en conservant une architecture cellulaire organisés et la viabilité des semaines ou des mois. Conditions pour le maintien de nombreuses régions du cerveau de rongeur dans la tranche de culture ont été décrits2.

Deux méthodes principales sont largement utilisés pour les cultures à long terme des tranches de cerveau : culture sur la membrane à l' interface air-liquide3 ou mise en culture sur les lamelles dans des tubes scellés a permis de tourner dans un incubateur à rouleau d’aération4. Tranches sur des membranes peuvent être photographiées directement avec la microscopie de fluorescence à haute résolution à l’aide d’un microscope droit et eau immersion objectifs5. Alternativement, tranches cultivés sur les membranes ont été transférés à la vaisselle en verre bas pour atteindre la bonne résolution des épines dendritiques, à l’aide d’un microscope inversé6. Toutefois, les deux méthodes d’imagerie tranches cultivés sur les membranes sont des systèmes ouverts qui nécessitent des modifications moyennes et utilisent souvent les antifongiques et/ou des antibiotiques pour prévenir ou réduire la contamination5,6. Tranches sur une membrane à l’interface air-médium maintiennent excellente morphologie et la survie, mais revenir à des emplacements précis en imagerie répétitive à fort grossissement est extrêmement difficile à moins que l’expérience est issue uniquement de petits groupes de cellules exprimant un marqueur fluorescent. Bien que les tranches cultivés sur les membranes ont été utilisés avec virale véhiculée par expression de transgènes5,6, protocoles de prévention des risques biotechnologiques peuvent nécessiter un système de culture clos être employées pour certains vecteurs viraux qui sont utilisés pour exprimant fluorescent étiquetée protéines et reporters de la physiologie cellulaire. En outre, les objectifs à immersion exigent décontamination entre les échantillons qui seront suivies dans la culture5. Une application importante des cultures interface membrane est de combiner une imagerie avec l’électrophysiologie de temps unique points7.

La méthode du tube à rouleaux avec lamelles couvre-objet à l’intérieur du tube en plastique ne permet pas de n’importe quel électrophysiologie ou l’imagerie haute résolution sans enlever le couvre-objet. Ainsi, cette méthode a été le plus souvent appliquée à des études à long terme dans lequel, après fixation observations ont été faites à8. Décrite ici est une méthode qui utilise la technique de culture de tube de rouleau, mais sur les tubes percés-out avec des tranches sur lamelles couvre-objet qui peut être photographiée de façon répétitive pour aussi longtemps que les cultures est maintenue. Le système clos ne requiert aucun changement médiatique pour l’imagerie et utilise des lamelles de photodécoupe pour fournir des repères qui permettent d’imagerie à fort grossissement, après quelques jours ou semaines, les domaines précis précédemment imagés.

Nous appliquons cette méthode pour analyser les changements dans l’hippocampe de rongeur, une région de majeur du cerveau impliquée dans la mémoire et l’apprentissage. L’hippocampe rongeur est souvent étudiée comme modèle pour des changements pathologiques ou liée à l’âge observée au cours du développement de troubles cognitifs9, telles que celles qui se produisent dans l’AD. Notre méthode est particulièrement bien adaptée à l’étude des changements pathologiques qui se développent au sein d’une seule tranche au fil du temps en réponse aux changements environnementaux, tels que l’augmentation des peptides bêta-amyloïdes, qui est caractéristique de l’AD8. Une pathologie associée du cerveau humain et les rongeur est la présence d’agrégats de cofilin-actine et tiges, les faisceaux contenant ce dernier des filaments dans laquelle cofilin et l’actine sont dans un rapport molaire 1:110,11, 12. tiges ont été observés dans les tranches fixes d’hippocampe de rat après un traitement de bêta-amyloïdes, ainsi que dans une tranche de cerveau de rongeurs vivants exprimant cofilin-GFP, soumis à l’hypoxie,8, et ils peuvent contribuer à la dysfonction synaptique chez AD et d’AVC. Ici, nous utilisons cette nouvelle méthode de culture pour observer l’évolution temporelle et la distribution dans les tranches des exogènes chimériques fluorescentes protéines exprimées introduites par différents virus. Ensuite, nous utilisons l’expression neuronale spécifique d’une construction de journaliste cofilin pour suivre l’évolution de la tige de cofilin et pathologie globale dans des tranches d’hippocampe en réponse au traitement par solubles oligomères bêta-amyloïdes (Aßo).

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Protocole

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L’utilisation des animaux suit élevage agréé et protocoles d’utilisation des animaux qui sont conformes à la protection des animaux et utiliser lignes directrices de la Colorado State University.

Remarque : Le protocole ci-dessous décrit la méthode de préparation et de la culture pour l’incubation à long terme et l’imagerie intermittent de tranches d’hippocampe. Une seule tranche hippocampe est attachée à une lamelle de photodécoupe spécialement préparé à l’aide d’un caillot de plasma, et puis les lamelles sont scellés sur le côté plat d’un tube de rouleau de Percé-out, qui est maintenu dans une étuve à rouleau. Les caillots plasmatiques sont dissous avec la plasmine avant l’infection virale pour l’expression de la protéine fluorescente et l’imagerie haute résolution. Un colorant vital neuronal fluorescent est utilisé pour les neurones dans les tranches d’image.

1. préparation du rouleau Tube Rack

  1. Utilisation du modèle illustré à la Figure 1A imprimé à la taille indiquée sur la barre d’échelle. Avec un clou, percer des trous petits (assez grands pour un marqueur à pointe fine) dans le modèle centré sur les trous.
  2. Définir le modèle sur le fond d’un plat de culture de tissu de 15 cm (diamètre nominal de 14 cm) et marquer la position des trous. Répétez cette procédure sur un deuxième plat.
  3. Avec des forets conçus pour être utilisé sur du plastique, percer six trous de diamètre de 1,5 cm sur chaque plat dans un arrangement hexagonal (4,8 cm Centre à centre) avec des centres de trou 2,5 cm du bord du plat. Percer trois trous (3 mm de diamètre) 12 mm du bord qui sont équidistantes placées entre deux des plus grands trous comme indiqué dans la Figure 1A.
  4. Avec le fond de chaque plat face à face, placer une vis de machine long 2.5 pouces (3/16 de pouce de diamètre) avec une rondelle plate à travers l’un des petits trous suivies d’une deuxième rondelle plate, une pièce de polyéthylène tube (entretoise, 4,7 cm), une autre rondelle plate , le deuxième plat de culture de tissu, une autre rondelle plate, une rondelle et un écrou.
  5. Répétez l’étape 1.4 sur les deux autres vis de machine et en serrant seulement vaguement jusqu'à ce que toutes les vis sont en place. Ensuite, serrez les écrous.
  6. Travailler les œillets (5/16 de pouce épais, diamètre du trou 5/8 po) dans les trous du plat inférieur pour obtenir le dernier tube carré (Figure 1B; illustré avec deux tubes en place). Une gommette sur chaque grille avec un numéro unique.

2. préparation du rouleau Tubes et lamelles couvre-objet

  1. Fabrication du gabarit pour le perçage du trou dans des tubes de rouleaux
    1. Percer un trou de 1,5 cm 8 cm de profondeur dans la partie centre de 2 x 4 x 5,5 po en bois blocs à un angle tel que le côté plat du rouleau tube volonté être presque parallèles avec le bloc lorsqu’il est inséré (Figure 2A).
    2. Agrandir le trou à l’aide d’une lime ronde bois à élargir et à cône le trou pour permettre l’insertion de tubes (tubes roulés sont légèrement plus grandes de diamètre près de l’extrémité du cap) (Figure 2B).
    3. Percer un trou vertical de 1,5 cm de diamètre, 5,5 cm du côté de l’édifice et centré sur le trou de côté (Figure 2C).
    4. Lorsque l’orifice du côté est conique assez, insérer un tube de rouleau qui est tracée à l’endroit désiré pour centrer le trou pour la tranche et positionner le tube pour l’endroit repéré est centré dans le trou vertical de 1,5 cm.
    5. Retirez le tube et mesurez la distance entre l’endroit à l’extrémité du tube. Marquer cette distance entre le centre du trou dans le gabarit et insérer un clou pour fournir un arrêt pour positionner correctement le tube de forage (flèche sur la Figure 2C).
    6. Utiliser une scie à métaux pour couper les ongles affleurer la surface de la cale en bois pour éviter les blessures.
    7. Ajouter les clips à ressort sur le fond de la sauteuse s’il y a une presse de foret avec machines à sous qui lui permettent d’être ancré (flècheFigure 2D noir). Sinon, utilisez C-pinces pour tenir le gabarit sur la perceuse.
  2. En utilisant le gabarit décrit ci-dessus pour tenir et positionner un tube de culture en plastique plat face 11 cm avec le côté plat vers le haut (Figure 2A), percer un trou de diamètre 6 mm avec le centre de 1,0 cm du bas et centré entre les parois du tube.
    Remarque : Un foret conçu pour le plastique doit être utilisé.
  3. Avec un outil d’ébavurage pivotant, lisser les bords du trou (Figure 2A) et faire 4 rainures à l’intérieur bord du trou (Figure 2E, encart) pour faciliter le drainage du trou pendant la rotation.
  4. Avec un trou de 12 mm, punch, couper des disques de diamètre de 12 mm de feuilles de caoutchouc non toxique double face adhésif silicone. À l’aide d’un poinçon de papier standard un trou (diamètre 6 mm), faire un trou au centre de chaque disque.
  5. Rincer les tubes percés avec l’éthanol à 70 %, air séchez-les dans une armoire, de la sécurité biologique et stériliser les tubes et les disques perforés adhésifs pendant 40 min sous la lampe UV (30 W à distance moyenne de 70 cm) dans l’armoire de sécurité biologique.
  6. Repositionner les tubes et les disques après 20 min afin que toutes les surfaces exposées sont stérilisés. Dans des conditions stériles, Décollez le blanc protecteur d’un disque adhésif et apposer le caoutchouc de silicone à l’extérieur d’un tube, en alignant les trous (Figure 2F).
    ATTENTION : Pour éviter l’exposition aux UV, porter une protection oculaire et fermer le cabinet avant d’allumer la lampe UV.
  7. Nettoyez 12 mm diamètre photodécoupe (100 Centre numéroté 1 mm carrés) lamelles de verre allemand. Maintenez les lamelles doucement avec une pince et tremper dans de l’éthanol absolu, suivi par l’eau, suivie d’éthanol absolu à nouveau et enfin tremper les lamelles dans une flamme pour brûler de l’éthanol. Permettre à lamelles couvre-objet à refroidir.
  8. Avec une pince en tenant les lamelles, tremper dans 2 % 3-aminopropyltriethoxysilane dans l’acétone pour 10 s. Rincer les lamelles couvre-objet avec de l’eau ultrapure et laisser sécher à l’air.
  9. Mettre les lamelles sur un papier filtre stérile à l’intérieur d’une biosécurité armoire et allumez la lampe à UV légère. Exposer chaque côté les lamelles pendant 20 min.
    ATTENTION : Pour éviter l’exposition aux UV, porter une protection oculaire et fermer le cabinet avant d’allumer la lampe UV.

3. préparation de la tranche hippocampe

  1. Avant de débuter la dissection, préparer la moitié des lames de rasoir à double tranchant pour le chopper de tissu. Plier les lames longueur délicatement avec les doigts et casser en deux.
  2. Rincer les moitiés de la lame avec de l’acétone à l’aide d’un coton-tige pour nettoyer, rincer dans de l’éthanol absolu et séchage à l’air.
Avant de monter une lame la moitié sur le chopper de tissu, de le stériliser en rinçant avec de l’éthanol à 70 %.
  • Suivre les protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme ; et un animalier institutionnel après l’anesthésie isoflurane, euthanasier un chiot de 4-7 jours vieille souris ou rat par décapitation et enlever la tête avec des ciseaux ou guillotine.
    Remarque : Le protocole de culture de tranche de cerveau est indépendant de la souche de rat ou de souris ou de génotype. Plusieurs lignées de souris transgéniques avec différents fonds génétiques ont été utilisées.
  • Rincez la tête avec l’éthanol à 70 % et le placer dans une boîte de Pétri de 60 mm. Jusqu'à ce que le montage final de la tranche de cerveau sur le tube d’enroulement, toutes les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire pour maintenir la stérilité.
  • À l’aide d’une lame chirurgicale #21, faites une coupe sagittale à travers la peau et le crâne. Avec une pince de Dumont #5, peel en arrière la peau et le crâne d’exposer le cerveau.
  • Avec une pince fermée, doucement taquiner sur tout le cerveau, il publie en pinçant avec la pince à travers la tige de cerveau derrière le cervelet. Placer le cerveau dans un récipient stérile 60 mm contenant Balanced Salt Solution/0.5% de glucose de 4 ° C Gey (GBSS/glucose).
  • À l’aide d’un microscope à dissection de visualiser le cerveau (Figure 3A), placer la face dorsale du cerveau vers le haut et couper le tiers avant du cerveau et le cervelet avec une lame chirurgicale (Figure 3B).
    1. Avec une pince, tenir le côté postérieur de cerveau coupé vers le haut et la face ventrale contre le côté de la boîte de Pétri pour la stabilité. Doucement taquiner les méninges loin autour de la ligne sagittale médiane et enlever le tissu de cerveau moyen à l’aide d’une pince de Dumont #5 à pointe fine (Figure 3C, cercle en pointillés).
    2. Faire deux incisions le long du côté du cerveau pour l’écarter ouvert (Figure 3C, lignes pointillées). Une fois que le cerveau est placé face dorsale vers le bas et ouvrir de propagation, l’hippocampe fissure doit être visible (Figure 3D, flèche).
    3. Transférer le cerveau ouvert de propagation à un morceau de film plastique Polychlorotrifluoroéthylène et positionnez-le pour trancher sur la scène d’un découpeur de tissu. Humidifiez la lame GBSS/glucose, puis hacher l’hippocampe en tranches épaisses de ~ 300 µm.
    4. Avec une pipette de transfert, purger le cerveau en tranches sur le film plastique dans un plat frais 60 mm contenant GBSS/glucose (Figure 3E). Doucement, pinch off et taquiner, avec pinces à pointe fine, les méninges restantes et autres tissus non-hippocampique (Figure 3-F) des tranches (Figure 3G, H).

    • 4. électrodéposition tranches

    1. Une fois les tranches ont été obtenus, placer 2 µL de plasma de poulet sur le centre du côté d’un lamelle couvre-objet préparé photodécoupe. Répandre le plasma légèrement pour atteindre une tache de diamètre de 3-4 mm.
      Remarque : Le côté de photodécoupe est le dessus de la lamelle couvre-objet vu à travers un microscope à dissection, tels que les nombres sont correctement orientées.
    2. Transférer 1 tranche de cerveau avec une spatule stérile de pointe étroite (Figure 4A) à l’endroit de plasma (Figure 4B). Utilisez la pince fermée pour garder la tranche à l’extrémité de la spatule en soulevant la tranche de la GBSS/glucose.
    3. Touchez la spatule pour le plasma spot sur la lamelle couvre-objet et avec une pince fermée, poussez la tranche sur la lamelle couvre-objet.
    4. Mix 2,5 µL de plasma avec 2,5 µL de la thrombine dans une éprouvette. Placer rapidement 2,5 µL de ce mélange sur et autour de la tranche et la pipette de haut en bas doucement pour mélanger (Figure 4B).
      Remarque : Le plasma se coaguler dans 10-15 s, donc cela doit être fait rapidement. Si l’adhérence de la tranche est un problème, mélanger 5 plasma µL avec 5 thrombine µL et utiliser 4-5 µL sur la tranche, supprimant certains après avoir été mélangées afin que la tranche se trouve à plat sur la lamelle couvre-objet.
    5. Retirez le plastique transparent couvrant du côté exposé de l’adhésif de caoutchouc de silicone déjà apposée sur un tube d’enroulement et la lamelle avec la tranche de cerveau sur l’adhésif en alignant la tranche dans le trou (Figure 4C).
    6. Pour assurer l’adhérence, comprime doux, même à la lamelle avec le pouce en appuyant uniformément sur la lamelle couvre-objet et en tenant pendant environ 1 min tout en transférant à l’armoire de sécurité biologique.
    7. Dans une armoire de sécurité biologique, ajouter 0,8 mL de milieu de culture complet Neurobasal A (Table des matières) dans chaque tube (Figure 4D).
    8. Couler un mélange d’air 5 % CO295 % grâce à une pipette Pasteur stérile coton-branché solidement maintenu par une pince. Rincer le tube avec le mélange de gaz et rapidement Boucher le tube qu’il soit retiré du autour de la pipette.
    9. Identifier les tubes avec le numéro de tranche et nombre des grilles. Insérer les tubes dans un rack de rouleau, veillant à ce qu’ils soient équilibrés géométriquement. S’il y a un nombre impair de tubes, ajouter des tubes pour équilibrer.
    10. Placez les paniers dans une étuve à 35 ° C à rouleaux avec rouleaux tournant le rack roller sur RPH 10-13 (Figure 4E). Pour garder le milieu en bas des tubes, inclinaison l’incubateur retour environ 5° en levant son front sur une planche.
    11. Entrez le numéro de tranche et le tube sur une feuille de calcul, qui sert à enregistrer toutes les informations de la tranche des traitements et des dates d’observation.
    12. Sur environ jour 6 dans la culture, ajouter 1 µL (0,002 U) de plasmine active dans chaque tube.
    13. Après la formation de caillots se dissoudre complètement (généralement en quelques heures), retirer le support et le remplacer par un milieu frais sans plasmine. Si nécessaire, tranches peuvent être incubées avec plasmine pendant la nuit et le milieu a changé le lendemain.
    14. Tranches sont généralement incubées pendant au moins 7-10 jours avant son utilisation dans des expériences. Aspirez le milieu et remplacez-le jour 3 ou 4, le 7e jour et tous les 7 jours.

    5. préparation de vecteurs viraux pour l’Expression du transgène

    NOTE : Expression de transgènes dans les neurones des cultures de la tranche est réalisée à l’aide de cerveaux de rongeurs génétiquement ou par l’introduction du transgène à l’infection par les déficients virus recombinant de la réplication.Adénovirus (AV), adeno-associated virus (AAV) et vecteurs recombinants lentivirus ont été utilisés dans nos cultures hippocampe tranche pour l’expression des chimères de différentes protéines fluorescentes dans des tranches de cerveau.

    1. Préparer la réplication AV déficient pour exprimer l’ARN d’intérêt selon les méthodes décrites ailleurs13,14. Titre les virus infectieux U/ml par la méthode de dilution en série à l’aide d’un anticorps dirigé contre une protéine virale exprimée comme décrit14. Pour observer les agrégats cofilin et formation de tige de cofilin-actine, utilisent le cofilin-R21Q-RDRF cDNA (plasmide 51279 #)16.
      Remarque : Le 1 promoteur synapsin est un excellent choix pour l’expression spécifique neuronale15, alors que le promoteur de cytomégalovirus est utile pour la conduite des niveaux d’expression élevée dans beaucoup de types de cellule13.
    2. Préparer AAV en co transfection de transfert plasmide contenant le gène d’intérêt et un plasmide rep/hab, avec ou sans un plasmide d’assistance, dans les cellules HEK293 emballage, qui alimentent le gène E1 viral, comme décrit précédemment17,18.
      NOTE : AAV Recombinant est également pour une insertion ciblée dans l' hôte de génome cellule19. Pour le plasmide de transfert, nous utilisons cofilin humaine 1 avec une étiquette de protéine de fluorescence (plasmide #50856) mRFP1 de C-terminal clonée dans un synapsin contenant du promoteur AAV plasmide en aval du calcium capteur GCaMP5G20. Un morceau d’ADN codant pour la séquence peptidique Self clivage P2A est inséré par PCR entre GCaMP5G et cofilin-DP pendant la préparation du plasmide transfert de fournir l’expression de deux protéines d’un unique de transcription d’AAV21.
    3. Préparer des vecteurs recombinants lentivirus par transfection Co du plasmide de transfert contenant le gène ou ADNc des signaux d’intérêt et de l’intégration, ainsi qu’une troisième génération de lentivirus emballage mélange qui divise la virale gag, pol, rev et gènes de vsv-g sur trois différentes plasmides22,23.
    4. Pour le plasmide de transfert, utilisez une seule étape de clonage système24 pour assembler le promoteur synapsin et cofilin-R21Q-RDRF cDNA (à partir de plasmide 51279 #) dans pLKO.1-GFP (plasmide #30323), avec le promoteur synapsin et cofilin-R21Q-RDRF remplaçant la hPGK promoteur et GFP cDNA, respectivement.
    5. Transfecter le plasmide final en cellules HEK293T de phosphate de calcium comme décrit précédemment23.
    6. Recueillir le moyen de quatre plats de 10 cm, se concentrer à 500 µL à l’aide de concentrateurs centrifuges 150K-coupure et stocker le lentivirus final à-80 ° C en petites parties aliquotes après rapide congélation dans l’azote liquide. Décongeler une aliquote qu’une seule fois pour infecter les cellules.
    7. Déterminer empiriquement que le volume de chaque type de virus disposés à parvenir au niveau de l’expression souhaitée en mettant en place un certain nombre de cultures différentes tranche de suivre l’expression des transgènes après l’infection avec des volumes différents de virus.
      Remarque : En général, 1-10 µL du virus est utilisée par tranche.

    6. traitements de la tranche

    1. Infectant les tranches avec le virus
      1. Travailler sous une hotte de sécurité biologique approuvé pour le travail de virus au niveau de sécurité biologique approprié pour le vecteur, mélanger une partie aliquote du virus (habituellement 1-10 µL) de 0,8 mL de milieu complet.
      2. Aspirez le milieu de la tranche à l’aide d’une pipette Pasteur stérile dans un piège de la collection contenant l’eau de Javel. Un piège secondaire est toujours utilisé entre le premier piège et la source de vide.
      3. Remplacer ce moyen de communication avec l’aliquote contenant le virus préparé ci-dessus, retourner les tubes de culture à une grille et placer dans un incubateur.
      4. Après 2 à 5 jours d’incubation des tranches avec le virus dans l’armoire de sécurité biologique, retirez le support contenant le virus avec une pipette stérile et placez-la dans un flacon contenant un agent antiviral approuvé pour tuer les virus.
    2. La coloration des neurones avec colorant vital
      1. Préparer et stocker les aliquotes de colorant vital neuronale fluorescent25 par rapide congélation 4 µL d’aliquotes dans l’azote liquide à une concentration de 100 µM et stocker ces à-20 ° C. Pas de gel/dégel la teinture plus d’une fois.
      2. Pour numéroter les neurones pour la visualisation en microscopie de fluorescence, décongeler une aliquote du colorant vital neuronale et diluer dans 4 mL de milieu Neurobasal complet (concentration de colorant final est 100 nM).
      3. Retirer le support de tranches par aspiration (ou avec une pipette de transfert si le milieu contient des virus) et remplacez-le par 0,8 mL de milieu contenant le colorant vital neuronale de 100 nM. Retourner les tranches à l’appareil de rouleaux dans l’incubateur.
      4. Après incubation des tranches pendant 2 h, aspirer le milieu contenant du colorant et remplacez-le par 0,8 mL de milieu complet frais sous une hotte de sécurité biologique.
        Remarque : Marquage des neurones en tranches avec un colorant vital nécessite plusieurs heures d’incubation. Les premières images sont habituellement pris 24h après le traitement de teinture. Bien que les neurones sont spécifiquement étiquetés, il n’y a fluorescence de fond qui se décline en 2-3 jours pour donner mieux l’imagerie neuronale. Intensité du colorant vital diminue après 72 h.
      5. Pour suivre les changements dans la morphologie de la tranche au fil du temps, réétiqueter les tranches tous les 7 jours.

    7. Coupez l’imagerie

    1. Découvre les tranches sur un microscope inversé. Pour l’imagerie de fluorescence plus brillants, après 24 h avant l’imagerie, échanger le milieu de culture avec milieu Neurobasal A complet sans l’indicateur de pH de rouge de phénol.
      Remarque : Pour les expériences rapportées ici, tranches sont lus sur un microscope à fluorescence confocale rotation inversée disque équipé d’un codage linéaire x, y scène avec contrôle z piezo et une caméra numérique haute résolution sensible.
    2. Transférer le tube avec la culture de la tranche à être photographié de l’appareil de tube de rouleau pour le sur mesure porte-tube (Figure 5A), qui est placé dans l’adaptateur de la scène (Figure 5B), pour garder la lamelle perpendiculaire à l’objectif et de maintenir la tranche dans le même sens au cours de séances d’imagerie répétitives sur longs intervalles.
    3. Poussez le curseur sur la carte de l’étape serré contre le tube pour maintenir le tube en place (Figure 5B).
    Maintenir la température de la tranche à 35 ° C au cours de l’imagerie par l’utilisation des installations de chauffage des bandes et un contrôleur thermorégulatrice construit dans l’adaptateur de scène sur mesure (Figure 5C).
    NOTE : Détails du porte-tube, scène adaptateur, et chauffage est accessible à : https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  • À l’aide d’une faible puissance (p. ex.., 4 X) objectif et transillumination champ lumineux, se concentrer sur le modèle de grille de photodécoupe (Figure 6A) en vertu de la tranche. Pour la première séance d’imagerie, numériser rapidement autour de la tranche pour localiser et consigner le nombre pour les différentes régions où l’imagerie grossissement plus élevé est souhaitée (par exemple, cornu ammonis (CA) 1, CA3, gyrus denté (DG), etc.).
  • Déplacer la scène à la première place de la grille contenant une zone d’intérêt. Basculez vers le 20 X objectif air et recherchez une marque de fiducial (e.g., astuce d’un numéro gravé) (Figure 6B).
  • Basculer vers un objectif de puissance plus élevé (40 X ou 60 X), de localiser la marque de fiducial et l’enregistrement puis le x et la position y de la scène. Déplacer la scène pour trouver l’ou les champs d’intérêt à proximité et enregistrer leurs x et y compense de la marque de fiducial (Figure 6B, flèche). Répéter dans d’autres domaines de la grille si vous le souhaitez.
    NOTE : Ces positions décalée de la marque de fiducial permettent de repérer cohérente de l’emplacement même de la lamelle couvre-objet lorsque la tranche est imagée, même si l’origine x, y de réglage de la marque de fiducial change lorsque l’adaptateur de tube ou de la scène sont retirés et remplacés.
  • Capturer une image Z-pile dans chaque champ sélectionné en utilisant le contrôle objectif de microscope ou un contrôle de phase piezo, si elles sont disponibles.
    NOTE : Les plans Image sont generalement à intervalles de 0,5 µm et 2 µm, selon la taille et la résolution souhaitée de l’image fonctionnalités. Construction d’une image 3D de qualité exige que les caractéristiques de l’image s’étendent sur plusieurs plans d’acquisition, et afin de visualiser les petits éléments, des intervalles plus petits sont donc requis entre les plans.
  • Garder le total d’imagerie temps pour chaque tranche aussi court que possible.
    Remarque : La plupart des séances d’imagerie a rapporté ici étaient sous 18 min/tranche. Cependant, nous avons photographié quelques tranches de dix ou plusieurs fois et même en tant que tant que les 40 min en une seule séance, sans dommage apparent dans la survie à long terme de la tranche.

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    Résultats

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Pour déterminer la précision avec laquelle les repères peuvent être utilisés pour reimage les mêmes cellules dans les mêmes champs au fil du temps, nous avons examiné les tranches cultivées sur des lamelles de photodécoupe (Figure 6A). Les neurones ont été visualisées par la souillure avec un colorant vital (100 nM pendant 2 h ; ne tache pas les cellules non neuronales), qui disparaît de neurones au fil du temps sans léser les cellules

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    La méthode du tube rouleau décrite ici permet de culture à long terme et une imagerie direct du tissu cérébral en tranches. Un problème majeur avec la technique de tranche appliquée ici est dans le montage et l’entretien des tranches. Revêtements de lamelle qui prennent en charge la tranche adhérence, promouvoir l’amincissement de la tranche en améliorant l’excroissance des neurites et la migration des cellules hors la tranche ; ainsi, nous avons évité l’utilisation de ces substrats. L’insertion des groupes aminés sur le...

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    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    Fond des plats de culture de 15 cmVWR Scientific25384-326
    Vis à métaux à tête cruciforme (#10-32)Ace Hardware2,5 » de long et 3/16 » de diamètre
    Rondelles plates #10ACE Hardware
    Écrous à vis mécaniques (#10-32)Hardware
    Rubber Grommets  ;Quincaillerie ACE5/16 », d’épaisseur ; 5/8 », diamètre de trou ; 1,125 », tube
    OD, 3/16" ; ID)ACE HardwareCut to 1.8
    Longueur Rondelle de blocage #10Perceuse à colonne ACE
    5 vitesses  ;Ace HardwareProTech Model 1201
    Nunclon Delta Flat-Sided TubesVWR62407-076
    Forets, 3 mm, 6 mm et 15 mm  ;Ace HardwareDiablo freud marqueForets pour couper le plastique.
    Ace Hardwarede 1,5 cm et 1 mm
    , pinces à ressort Ace Harware
    , porte-pression de 16 mmAce Hardware
    Ace Hardware263075 po
    (joint sécurisé)Grace Bio-Labs6665810,5 mm d’épaisseur
    Perforatrice de 6 mm PerforatriceOffice Max
    de 12 mmthepunchbunch.com
    à 70 % d’éthanol
    , diamètre 12 mmBellco Glass, Inc.1916-91012
    Bunsen
    Éthanol absolu
    Eau
    3-aminopropyltriéthoxylaneSigma-AldrichA3648
    AcétoneSigma-Aldrich179124
    #5 Dumont ForcepsOutils scientifiques fins11251-30
    Hachoir à tissus McIlwainTed Pella, Inc.10180
    Lames de rasoir à double tranchantTed Pella, Inc.121-6
    Whatman Filter PaperVWR28450-182Coupé en cercles de 5,8 cm de diamètre
    Poly-chloro-trifluoro-éthylène (Aclar)Ted Pella, Inc.10501-10Couper en cercles de 5,8 cm de diamètre
    #21 Lame chirurgicaleVWR Scientific25860-144
    #5 Dumont ForcepsFine Science Tools11251-30
    Spatule en acier inoxydable avec extrémité effiléeVWR82027-518
    Gey’s Balanced Salt SolutionSigma-AldrichG9779  ;
      ; GlucoseThermoFisher Scientific15023-021Solution à 25 % (p/v), filtre de 0,2 mm stérilisé
    Plasma de pouletCocalico Biologicals30-0300-5LRéhydrater dans de l’eau stérile, centrifugeuse à 2500 x g 30 min à 4 ° ; C, congélation rapide des aliquotes dans de l’azote liquide et stockage à  ; -80 °C
    Thrombine topique (bovine)PfizerThrombin-JMIAliquotes de congélation rapide dans l’azote liquide à 1 000 unités internationales/mL dans le diluant fourni et stocké à -80° ;C. Utilisation à 250 unités/mL.
    Cell Roller SystemBellco BiotechSciERA
    Incubateur à rouleauxFormaModèle 3956
    N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
    Pen/Strep (100X)ThermoFisher Scientific15140122
    200 mM GlutamineThermoFisher Scientific25030081
    GlucoseThermoFisher Scientific15023-021Solution à 25 % (p/v), filtre de 0,2 mm stérilisé
    Neurobasal AThermoFisher Scientific10888-022  ;Milieu complet : 48 mL de neurobasal A, 1 mL de N21-MAX, 0,625 mL de 200 mM de glutamine, 0,180 mL de glucose à 25 %, 0,250 mL de 100x stylo/streptocoque.
    Emballage de lentivirus de troisième générationLife TechnologiesK4975-00
    159 K filtres centrifuges à coupure (Centricon)EMD Millipore
    de clonage lentiviral (InFusion)Clonetech
    Plasmids 30323, 50856, 51279Addgene
    Colorant de viabilité des cellules neuronales (NeuO)Technologies des cellules souches1801Décongeler une fois et congeler rapidement en 4 & micro ; L aliquotes. Conserver à -20 ° ; C
    Microscope inverséOlympusIX83
    Objectifs de microscopeOlympusair : 4X, 20 ; huile : 40X, 60X,Système
    confocal à disque rotatifYokagawaCSU22
    Microscope Caméra EMCCDPhotométrieCascade II
    Linéaire codé (x,y), piézo z plat, platine ASI
    Microscope lasers et intégrationIntelligent Imaging Innovations
    HEK293T cellulesAmerican Type Culture CollectionCRL-3216
    Plasmine humaineSigma AldrichP18670,002 U/mL dans 0,1 % d’albumine sérique bovine (filtre 0,2 mm stérilisé), congélation rapide dans de l’azote liquide et stockage à -80 ° ;C.
    ACE en polyéthylène OD (5/16 » ;" , Forets pour le bois, lime à bois rondes de 1/4 po outil d’ébavurage à tête pivotante , feuille de silicone adhésive de lamelles phototechnologiques Bec nanopure Système

    Références

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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