Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivent des techniques pour la dissection appropriée d’Arabidopsis fleurs et siliques, quelques techniques de base de compensation et sélectionné les procédures pour les observations d’entier-montent des structures reproductrices de coloration.

Résumé

En raison de sa formidables outils pour les études de génétique moléculaire, Arabidopsis thaliana est une des espèces plus en vue de la modèle en biologie végétale et, surtout, en biologie de la reproduction végétale. Cependant, plante morphologique, anatomique et les analyses ultrastructurales comprennent traditionnellement beaucoup de temps l’incorporation et la section procédures de champ lumineux, balayage et au microscope électronique. Les progrès récents dans la microscopie confocal fluorescence, state-of-the-art 3D analyses microscopiques assistée par ordinateur et l’amélioration continue des techniques moléculaires pour être utilisé sur des spécimens entiers minimalement transformés, a conduit à une augmentation de la demande pour développement de techniques de traitement efficace et un minimum l’échantillon. Dans ce protocole, les auteurs décrivent les techniques de dissection correctement Arabidopsis fleurs et siliques, base de techniques, de compensation et certaines méthodes de coloration pour toute monture observations des structures reproductrices.

Introduction

Fleurs sont parmi les plus importantes définissant des organes des angiospermes. Plantes dicotylédones est apparu il y a 90 millions ans¹et diversifié si vite que leur apparition rapide a été décrit comme un « mystère abominable » par Charles Darwin,². Les intérêts des chercheurs de l’usine de développement floral sont diverses. Certaines recherches ont porté sur la compréhension de l’origine évolutive de la fleur dans son ensemble, ni l’évolution des propriétés spécifiques d’anatomiques, structurales et fonctionnelles des fleurs^3,4,5....

Protocole

1. fleur et la Fixation de la Silique

1. Récolte de fleurs et siliques de plantes synchronisés lors de l’ouverture de la première fleur.
   Remarque : Dans les conditions expérimentales utilisées ici, les plantes commencent à fleurir environ 21 jours après la transplantation de Murashige et Skoog (MS) des dalles au sol. Graines sont stratifiées pour 3 à 4 jours à 4 ° C et germent/cultivés sur MS plaques à 22 ° C/16 h de lumière et 18 ° C/8 h sombre pendant 8 à 10 jours, avant de transplanter les plants sur un sol riche en éléments nutritifs dans des pots maintenus dans les mêmes conditions (Figure 1). Le nombre de répétitions dépen....

Résultats

Arabidopsis appartient à la famille des Brassicacées, portant des inflorescences avec des fleurs bisexuées, disposées en corymbe (Figure 1). Chaque fleur comporte quatre sépales, quatre pétales, six étamines (quatre de long et deux courts) et un gynécée syncarpe constitué de deux carpelles congénitalement fusionnés (Figure 1F-H) disposées en verticilles concentriques quatre^25.......

Discussion

L’existence de nombreux boutons floraux au sein d’une inflorescence unique de l' Arabidopsis, couvrant toutes les étapes du développement de fleur, offre une occasion unique pour les études visant à caractériser l’effet d’un traitement ou d’une caractéristique du développement en même temps à travers les différentes étapes du développement floral. Un bon point de référence entre les différentes plantes individuelles est l’ouverture de la première fleur de l’inflorescence principale. Les plants sont traités de te.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
forts
Éthanol	Scharlau	ET00102500
Acide acétique	Applichem	A3686,2500	100 % biologie moléculaire
Acide acétique glacial	Sigma-Aldrich	320099	Biologie moléculaire Méthanol
	Scharlau	ME03062500
Solution de formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F1635
Acide propionique	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Hydrate de chloral	Sigma-Aldrich	15307
Glycérol	Roth	3783.1
Gomme arabique	Fluka	51198
Acide lactique	Fluka	69773
Phénol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	Nous avons utilisé du phénol liquide (utilisez la densité pour trouver le volume requis pour votre solution)
Huile de clou de girofle	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylène	Roth	4436.1
Iode	Fluka	57665
Iodure de potassium	Merck	5043
Malachite Vert	Fluka	63160
Acide fuchsin	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Dodécylsulfate	de sodium Sigma-Aldrich	L3771	Biologie moléculaire Hydroxyde
de sodium	Sigma-Aldrich	71690
Di-hydrogénophosphate de sodium	Applichem	A1047,1000
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Phosphate	de potassium Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Azurant 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542
toxique Triton-X-100	Sigma	T8787
Bleu aniline	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Substrat riche en nutriments	Einheitserde	ED73
Verre			Pas de marque spécifique
Tubes à centrifuger faucon de 15 ml	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Pince	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Seringue	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Aiguille de préparation	BD	BD Microlance 304000
Lames de microscope	Thermo Scientific	10143562CE	Bords coupés
Lamelles	Thermo Scientific	DV40008
Boîte			Une boîte en plastique avec une serviette en papier humide et des supports de toboggan à l’intérieur
Nom	Company	Numéro de catalogue	Comments
Solutions
Fixatives
		Carnoy (Farmer’s)	Éthanol absolu : acide acétique glacial, 3:1 (ml :ml)
Fixateur			50 % (v/v) méthanol, 10 % (v/v) d’acide acétique glacial dans de l’eau déminéralisée
FPA50 fixateur			de formol, acide propionique, 50 % d’éthanol ; 5:5:90 (ml :ml :ml)
Solutions éclaircissantes
Hydrate de chloral/glycérol			Hydrate de chloral : glycérol : eau, 8:1:2 (g :ml :ml). Peut être utilisé pour tous les stades de développement des fleurs et pour le développement de la silique avec la microscopie DIC. Le meilleur fixateur est le FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7,5 g, hydrate de chloral 100 g, glycérol 5 ml, eau 30 ml. Peut être utilisé pour tous les stades de développement des fleurs et pour le développement de la silique avec la microscopie DIC. Le meilleur fixateur est le FPA50
Herr’s 4½ ; fluide			Acide lactique, hydrate de chloral, cristaux de phénol, huile de clou de girofle, xylène ; 2:2:2:2:1, en poids. Peut être utilisé pour tous les stades de développement des fleurs (en particulier pour le développement des étamines) et pour le développement de la silique avec la microscopie DIC. Le meilleur fixateur est la
		SDS/NaOH	Mélangez-diluez la SDS et la solution mère de NaOH à 1 % SDS / 0,2 N NaOH (dilution 10x). Pour tous les stades de développement de la fleur et de la silique. Le meilleur fixateur est le fixateur à l’acide méthano/acétique ; Les deux autres fixateurs peuvent également être utilisés. Peut être combiné avec du calcofluor, de l’auramine, du DAPI et une solution de coloration au bleu d’aniline.
SDS solution			10 % (p/v) de dodécylsulfate de sodium. Dissoudre 10 g de dodécylsulfate de sodium dans 80 ml d’eau déminéralisée et compléter à 100 ml avec de l’eau déminéralisée.
Solution			2 N Solution de NaOH : dissoudre 4 g de NaOH dans 40 ml d’eau désionisée et compléter à 100 ml avec de l’eau désionisée
Solutions combinées d’élimination et de coloration
Herr’s IKI-4½ ;			Sur un standard 4½ ; (9 g au total) Ajouter : 100 mg d’iode, 500 mg d’iodure de potassium. Cette solution de clarification peut être utilisée pour tous les stades de développement des fleurs et pour le développement de la silique, soit pour augmenter le contraste, soit pour caractériser la dynamique de l’amidon. Utilisez le FPA50 pour l’analyse structurelle et le fixateur de Carnoy pour l’analyse quantitative de l’amidon.
Coloration			Éthanol 95 % 10ml, vert malachite (1 % dans 95 % EtOH) 1 ml, acide fuchsine (1 % dans ddH2O) 5ml, orange G (1 % dans ddH2O) 0.5ml, phénol 5g, hydrate de chloral 5g, acide acétique glacial 2ml, glycérol 25ml. Ce nettoyage/coloration seul ou en combinaison avec Herr’s 4½ ; La solution peut être utilisée pour évaluer l’avortement du pollen dans les fleurs avec des grains de pollen matures et tricellulaires. Il est utilisé sur du matériel non fixé fraîchement préparé.
fortes
solution			Calcofluor Calcofluor 0,007 % dans l’eau (g :ml). Utilisé à l’origine comme éclaircissant optique. Peut être utilisé pour colorer la cellulose, les polysaccharides carboxylés et le callose dans les parois cellulaires. Fréquemment utilisé pour colorer l’intine du grain de pollen. Les trois fixateurs peuvent être utilisés avec cette solution.
Solution			d’Auramine Auramine 0,01 % dans l’eau (g :ml). Ce colorant fluorscent lipophile peut être utilisé pour colorer les cuticules, la cutine et l’exine, entre autres. Les trois fixateurs peuvent être utilisés avec cette solution
		Calcofluor-Auramine	Solution d’Auramine : Solution de Calcofluor, 3:1. Peut être utilisé pour une coloration combinée par les deux solutions. D’autres proportions peuvent être dosées en maintenant une proportion plus faible de calcofluor par rapport à l’auramine.
Solution			DAPI DAPI 0,4 μg/ml, tampon de phosphate de sodium 0,1 M (pH 7), Triton-X-100 à 0,1 %, EDTA 1 mM. Cette solution peut être utilisée pour colorer les propagations chromosomiques au cours de la méiose masculine et féminine, et les noyaux cellulaires de n’importe quel tissu. Fréquemment utilisé pour étudier le développement des grains de pollen. Le carnoy et le méthanol/acide acétique sont les meilleurs fixateurs pour cette solution. Les fixateurs à base de formaldéhyde tels que le FPA50 peuvent interférer avec la coloration. Excitation dans l’UV et émission maximale autour de 461 nm.
Tampon phosphate de sodium (0,1 M)			Récepteur de protons : 0,2 M Na2HPO4, donneur de protons : 0,2 M NaH2PO4, rapport donneur de protons / récepteur de protons : 1,364 (pour un pH de 7)
		bleu d’aniline	0,1 % (p/v) bleu d’aniline, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2 % de glycérol. Cette solution peut être utilisée pour colorer la callose et la cellulose de nombreux stades de développement (par exemple, dépôt de callose dans les térades mâles et femelles, bouchons de callose dans les tubes polliniques). Excitation dans l’UV et émission maximale autour de 455. Il peut également être excité à 514 nm avec émission dans le rouge pour la coloration du contenu cellulaire.

d’horloger humide Fixateur de méthanol/acide acétique nettoyant à base de formol solution FPA50 à base de formol mère mère de NaOH Alexander de Mélange Solution de