Haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants durant Golden syrien Hamster Infection

Résumé

Nous décrivons ici une technique qui associe une mutagenèse par transposon séquençage haut-débit pour identifier et quantifier des mutants de leptospires transposon dans les tissus après une contestation des hamsters. Ce protocole peut être utilisé à des mutants de l’écran de survie et de la diffusion chez les animaux et peut également être appliqué à des études in vitro .

Résumé

Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un transposon séquençage (Tn-Seq) technique pour identifier et quantifier des mutants de Leptospira interrogans altérés de remise en forme au cours de l’infection de hamsters syriens dorés. TN-Seq combine la mutagénèse aléatoire transposon avec la puissance de la technologie de séquençage haut-débit. Animaux est mis au défi avec une piscine de mutants transposon (entrée piscine), suivie de la récolte du sang et des tissus quelques jours plus tard afin d’identifier et de quantifier le nombre de mutants dans chaque organe (sortie piscines). Les piscines de sortie sont comparés à la piscine d’entrée afin d’évaluer l’aptitude en vivo de chaque mutant. Cette approche permet le dépistage d’une grande piscine de mutants dans un nombre limité d’animaux. Avec des modifications mineures, ce protocole peut être effectué avec n’importe quel modèle animal de la leptospirose, modèles hôte réservoir comme les rats et les infections aiguës comme les hamsters, ainsi que des études in vitro . TN-Seq fournit un outil puissant à l’écran pour des mutants présentant des défauts de remise en forme in vivo et in vitro .

Introduction

Identification des gènes de virulence pour certaines bactéries, comme Leptospira spp., est difficile en raison du nombre limité d’outils génétiques disponibles. Une approche couramment utilisée est la création d’une collection de mutants par mutagenèse aléatoire transposon, suivie de l’identification du site d’insertion dans chaque mutant et test de virulence des mutants de transposon individuels dans un modèle animal. Cette approche est longue et coûteuse et nécessite un grand nombre d’animaux.

Lorsque la mutagénèse aléatoire a été d’abord développé pour le pathogène Leptospira interrogans, gènes impliqués dans la virulen....

Protocole

ATTENTION : Des souches pathogènes de Leptospira spp doivent être manipulés sous procédures de confinement de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté. Une armoire de biosécurité classe II doit être utilisée pour toutes les manipulations des pathogènes Leptospira spp.

1. création du Transposon bibliothèque mutante¹⁵

1. Transfert du transposon dans Leptospira spp. par conjugaison (Figure 1)
   1. Ensemencer un volume de la culture de la ....

Résultats

Création d’une bibliothèque de mutants de transposon dans L. interrogans par conjugaison nécessite une unité de filtration, comme illustré à la Figure 1. Nous avons récupéré des transconjugants 100-200 de chaque croisement.

Le site d’insertion de transposon est identifié dans chaque mutant par séquençage du produit PCR généré par PCR semi aléatoire qui cible à la fin du transposon et hôte a.......

Discussion

Bien que les résultats de notre expérience pilote pour hamster contestée par voie intrapéritonéale avec 42 L. interrogans mutants sont présentés¹⁷, gageons que plus grandes piscines de mutants peuvent être projetés par Tn-suiv. Parce que la fréquence des transconjugants est faible (100-200 transconjugants/accouplement), plusieurs accouplements sont nécessaires pour générer un nombre suffisant de mutants pour les grandes expériences de Tn-Seq. Maintenir un grand nombre de mutants dans des .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sulfate de kanamycine à partir de Streptomyces kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K4000
Acide 2,6-diaminopimélique	Sigma-Aldrich	D1377
Chlorhydrate de spectinomycine pentahydraté	Sigma-Aldrich	S4014
Axio Lab A1 microscope avec condensateur à fond noir	Zeiss	490950-001-000
Kit de purification de sang et de tissus DNeasy	Qiagen	69504/69506
MinElute Purification PCR	Qiagen	28004/28006
QIAquick Kit de purification PCR	Qiagen	28104/28106
Modèle 505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB-505
2.5" Corne de tasse	Fisher Scientific	FB-4625
Perle Ruptor 24	Omni International	19-010	Étape 3.1.2.4
Désoxynucléotidyltransférase terminale	Promega	M828C
Master mix Phusion	Thermo Scientific	F531	Préparation des banques génomiques, étape 3.4.
DreamTaq Master Mix	Thermo Scientific	K9011/K9012	Identification du site d’insertion du transposon, étape 1.2.
dCTP	Thermo Scientific	R0151
ddCTP	Affymetrix/ USBProducts	77112
T100 Thermocycleur	BioRad	1861096
Qubit 2.0 fluorimètre	Invitrogen	Q32866	étape 3.6.
Kit de dosage Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32851/Q32854	étape 3.6.
Technologies de vie	tubes d’essai Qubit	Q32856	étape 3.6.
PBS pH 7.2 (1X)	Gibco	20012-027 20012-050
Scalpel jetable No10	Feather	2975#10
Plastique K2 EDTA 2 ml tubes	BD vacutainer	367841
seringue U-100 avec 26G x ½ ; ” aiguille	BD vacutainer	329652	défi IP, étape 2.2.1.
Seringue à embout Luer-Lok de 3 mL	BD vacutainer	309657	Ponction cardiaque, étape 2.4.2.
Aiguille 25G X 5/8"	BD vacutainer	305901	Ponction cardiaque, étape 2.4.2.
Base en verre fritté de 25 mm avec bouchon	EMD Millipore	XX1002502	Système d’unité de filtration, étape 1.1.7.
Pince à ressort en aluminium de 25 mm	EMD Millipore	XX1002503	Système d’unité de filtration, étape 1.1.7.
Entonnoir en verre borosilcate de 15 ml	EMD Millipore	XX1002514	Système d’unité de filtration, étape 1.1.7.
Fiole Erlenmeyer à bras latéral de 125 ml	Système d’unité de filtration EMD Millipore	XX1002505	étape 1.1.7.
Filtre en acétate-cellulose VVPP (taille des pores 0,1 mm ; diamètre 25 mm)	EMD Millipore	VVLP02500

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