Article de méthode

Un Multimodal à l’approche d’imagerie basée sur Micro-CT et Fluorescence moléculaire de positons pour une évaluation longitudinale de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine chez la souris

DOI :

10.3791/56443

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13 avril 2018

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1Corporate Preclinical R&D, Chiesi Farmaceutici S.p.A., 2Department of Veterinary Science, University of Parma, 3Department of Molecular Genetics, Erasmus MC, 4Department of Molecular Genetics, Vascular Surgery, Radiation Oncology, Erasmus MC, 5Fluidda NV

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons un multimodal non invasive d’imagerie approche basée sur la Micro-CT et fluorescence moléculaire tomographie pour une évaluation longitudinale du modèle souris poumon fibrose induite par instillation intratrachéale double de la bléomycine.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) est une maladie pulmonaire mortelle caractérisée par la destruction progressive et irréversible de l’architecture pulmonaire, ce qui provoque une détérioration significative de la fonction pulmonaire et la mort d’insuffisance respiratoire.

La pathogenèse de l’IPF dans des modèles animaux expérimentaux a été induite par administration de bléomycine. Dans cette étude, nous étudions un modèle de type gif souris induit par une instillation de bléomycine intratrachéale double. Les évaluations histologiques standards utilisées pour l’étude de la fibrose pulmonaire sont invasives terminales. L’objectif de ce travail consiste à surveiller la fibrose pulmonaire grâce à des techniques d’imagerie non invasives comme tomographie moléculaire fluorescente (FMT) et Micro-CT. Ces deux technologies validées avec les conclusions de l’histologie pourraient représenter une approche révolutionnaire fonctionnelle pour suivi non invasif en temps réel de la progression et la sévérité de la maladie du GIF. La fusion des différentes approches représente un peu plus loin pour comprendre la maladie de l’IPF, où les événements moléculaires qui se produisent dans un état pathologique peuvent être observées avec l’ESF et les modifications anatomiques subséquentes peuvent être surveillées par Micro-CT.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) est une maladie pulmonaire chronique avec une diminution progressive des fonctions pulmonaires qui est malheureusement souvent fatale dans les quatre ans du diagnostic1. Les principales caractéristiques du CIP sont les dépôts de la matrice extracellulaire et la prolifération des fibroblastes, mais la pathogenèse n’est pas encore pleinement comprise. L’hypothèse la plus soutenue est que plusieurs cycles de lésions pulmonaires provoquent la destruction des cellules épithéliales alvéolaires qui mène à l’altération de la prolifération de cycle de cellules mésenchymateuses, accumulation exagérée des fibroblastes et myofibroblastes, et production accrue de matrice. Médiateurs impliqués dans ces processus, tels que les métalloprotéinases matricielles (MMP) ont été trouvés dysrégulation dans le développement de la fibrose IPF humaine ou dans des modèles animaux induite par la bléomycine. La production de MMP incontrôlée conduit à un dépôt de collagène déséquilibrée dans l’interstitium pulmonaire et de l’espace alvéolaire, imitant la plaie anormale réparation1,2.

L’un des principaux obstacles pour la découverte et le développement est la disponibilité des modèles de souris accessible qui imitent la pathogénèse humaine et le phénotype de la maladie. Des agents différents ont été utilisés pour induire la fibrose pulmonaire chez les modèles animaux : dégâts d’irradiation, l’administration d’amiante et de silice, administration de cytokines fibrinogène et la bléomycine3,4; Cependant la bléomycine est le plus utilisé chez les souris, rats, cobayes, hamsters, lapins5 ou dans les grands animaux (primates non humains, les chevaux, les chiens et les ruminants)6,7. La bléomycine est un antibiotique de la bactérie Streptomyces verticillus8 et est utilisée comme un agent anticancéreux9. La fibrose pulmonaire est un effet secondaire fréquent de la drogue et pour cette raison, il est utilisé dans des modèles animaux expérimentaux pour induire une fibrose pulmonaire.

Dans les modèles de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, les lésions fibreuses se produisent 14-21 jours après l’administration de la bléomycine. Dans le travail présenté, nous avons utilisé un nouveau protocole pour induire la fibrose du poumon chez les souris par instillation intratrachéale bléomycine double. Le modèle murin de la bléomycine est très chronophage, parce que les nouveaux médicaments doivent être évaluées sur des lésions fibreuses établies et testées pour distinguer leurs effets anti-fibrosants des effets anti-inflammatoires.

Biochimique détermination de la teneur en collagène, morphométriques et analyse histologique étaient fondées sur l’analyse post mortem, limitant la possibilité de suivre la pathogenèse de la maladie chez le même animal. Ces paramètres ont été considérées comme un étalon-or pour l’évaluation de la fibrose, mais ils ne pas fournir toute distribution temporelle ou spatiale de la lésion fibreuse et empêche un moyen d’enquêter sur le processus de progression de la maladie. 10

Récemment, les technologies d’imagerie non invasives ont été appliqués au moniteur transformant des voies respiratoires, l’inflammation et la progression de la fibrose dans les modèles murins : imagerie par résonance magnétique (IRM), tomodensitométrie Micro (Micro-CT), Fluorescence moléculaire Tomographie par ordinateur (FMT) et Bioluminescent (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Nous proposons une approche d’imagerie non invasive pour surveiller la progression de la fibrose pulmonaire par FMT et Micro-CT à différents moments après une bléomycine défi22longitudinalement.

Plusieurs sentiers sont impliqués dans la création et le développement de la fibrose, et pas beaucoup est connu. Seulement une meilleure compréhension de ces processus pourrait se traduire par plusieurs cibles de médicaments qui peuvent céder à l’infirmerie. La possibilité de surveiller longitudinalement activation de MMP par tomographie moléculaire de fluorescence couplée à la détection des changements de parenchyme pulmonaire par Micro-CT peut-être servir à l’avenir à accéder à la réponse clinique au traitement.

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Protocole

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Toutes les expériences animales décrits ci-après ont été approuvés par le Comité de protection des animaux intra-muros à l’expérimentation animale de Chiesi Farmaceutici et ERASMUS MC sous le numéro de protocole : EMC 3349 (138-14-07) se conformer à l’européen UE Directive 2010/63, Italienne D.Lgs 26/2014 et le révisé de « Guide pour le soin et Use of Laboratory Animals »23.

NOTE : Avant toute utilisation, femelles souris C57Bl/6 (7-8 semaines) consanguines ont été acclimatées pendant au moins 7 jours aux conditions locales vivarium (température ambiante : 20-24 ° C, hygrométrie : 40 à 70 % ; cycle lumière-obscurité de 12 h), ayant un accès gratuit à chow rongeur standard et eau du robinet adoucie.

1. par voie intratrachéale traitement des souris à la bléomycine

  1. Préparer le matériel pour l’instillation intra-trachéale12,13,14.
  2. Mettre les souris dans la chambre anesthésique reliée à un vaporisateur isoflurane fixé à 2,5 %, mélangé avec de l’oxygène. Vérifier la profondeur de l’anesthésie par l’absence d’une réponse d’orteil-pincement. L’effet de l’anesthésie s’est produite après 3-5 min.
  3. Positionnez la souris anesthésiée sur la plate-forme de l’intubation, accrochant par ses incisives placées sur le fil.
  4. Allumez le laryngoscope, prendre une paire de pinces terminé émoussé et utiliser le forceps ou pointe de laryngoscope pour ouvrir délicatement la bouche.
  5. Tirez sur la languette et maintenez-le sur le côté avec une pince. Placer la lame du laryngoscope vers l’arrière de la bouche jusqu'à ce que l’ouverture de la trachée est visualisé et garder le laryngoscope en place.
  6. Avec l’autre main, introduire le tube de livraison raccordé à l’extrémité du tube PE dans la trachée, tourner le robinet à trois voies. Livrer 50 µL de la bléomycine (0,020 µg/souris). Après l’instillation, rapidement enlever le tube de la trachée pour éviter l’étouffement. Tenez les souris droite pendant quelques secondes.
    1. Administrer par voie intratrachéale bléomycine au jour J0 et répétez à jour 4 (Figure 1).
  7. Retirer la souris de la plate-forme de l’intubation et contrôler la souris pendant 30 min (le temps nécessaire pour se remettre complètement de l’anesthésie).
  8. Effectuer l’imagerie in vivo des poumons de souris par FMT et Micro-CT après instillation de bléomycine double au jour 7, 14 et 21.

2. in vivo imagerie par Fluorescence moléculaire tomographie

NOTE : Au préalable, préparer une solution fraîche de 6 nmol/mL de MMP sensible substrat fluorescent 680 dans du sérum physiologique (chlorure de sodium 0,9 %) et store abri de la lumière à 4 ° C avant utilisation. Il est stable pendant 6 mois à 4 ° C. Permettre de MMP imagerie agent s’équilibrer à température ambiante avant de l’injecter dans des animaux.

  1. Sonde d’injection
    1. Préparer le matériel pour injection intraveineuse de la solution de sonde MMP. Préchauffer l’eau à 50 ° C pour chauffer la queue de souris.
    2. Pour saisir fermement la peau de souris, le prendre par la queue et lui permettre de saisir le couvercle de la cage. Maintenant les souris sur les épaules de l’animal, mettre la queue dans un bécher d’eau chaude, pour 4 au maximum 8 dommage thermique s pour prévenir toute blessure thermique à la peau de la queue.  Vérifier les veines gonflement pour la visualisation plus facile et insertion de l’aiguille.
    3. Au cours de la procédure d’injection, mettre les souris dans une drisse en plastique de le garder stable et tirer la queue par un orifice dans le dos. Trouver les deux veines caudales de chaque côté de la queue ; pas l’artère sur le dessous de la queue.
    4. Insérez l’aiguille (26G) de la seringue de 1 mL dans la veine. Si l’aiguille est correctement placée, injection sera facile et la solution de la sonde s’écoule dans le récipient.
    5. Injecter la solution de sonde MMP à 10 mL/kg.
    6. Jeter l’aiguille.
      Remarque : Le point optimal de temps d’imagerie est 24 h après l’injection de sonde MMP parce que c’est le temps requis par la sonde doit être activée. Si des études longitudinales sont effectués, le temps de ré-injection optimale est 7 jours, qui permet d’obtenir le jeu complet de l’agent de la souris.
  2. Imagerie de la FMT
    Remarque : Avant de commencer, toujours enlever la fourrure sur et autour des zones de l’animal qui devront être photographié, en l’occurrence la poitrine, afin d’éviter la dispersion et absorption dans les tissus.
    1. Pour anesthésier la souris, le mettre dans la chambre de l’anesthésique et tournez l’isoflurane à 2,5 % pour l’induction et 2 % pour l’entretien.
    2. Initialiser le logiciel d’acquisition de données et ouvrez une nouvelle étude dans la base de données pour l’expérience.
    3. Avant de commencer l’imagerie FMT, transvaser la souris dans la cassette d’imagerie. Placez votre souris anesthésiée au milieu de l’imagerie cassette pour mieux utiliser le champ de vision de l’ESF. Gardez les souris plate, sûr et doucement comprimée contre les deux fenêtres de la cassette d’imagerie. Réglez la hauteur par boutons sur la cassette et puis glissez-le dans la station d’accueil.
    4. Cliquez sur l' objet dans la fenêtre de numérisation et cliquez sur Aperçu pour voir l’image en direct.
    5. Dessiner la région scan suffisamment grande pour que les tissus qui entourent la zone prévue de fluorescence sont capturé. Y compris les garanties de scan 25 points au total, la région de poumon sera totalement numérisée.
    6. Une fois le retour sur investissement est dessiné, tout d’abord, cliquez sur Ajouter à la file d’attente de la reconstruction et puis cliquez sur numériser pour l’image de la souris. S’assurer que le laser correct à 680 nm est sélectionné.
    7. Une fois terminée l’acquisition de l’image, placez votre souris dans sa cage. N’oubliez pas qu’elle récupère complètement de l’anesthésie.
    8. Quantifier les picomoles de fluorescence dans la fenêtre d’analyse du logiciel d’analyse à l’aide de l' outil de retour sur investissement et réduire le retour sur investissement autour de 700 à 800 mm3 sur le signal provenant de la région de poumon. Veillez à exclure le signal du foie. Copiez le retour sur investissement sur les autres sujets ont eux similaire en dimension et ajuster leur position dans chaque image animale.
    9. Exporter des images sous forme de fichiers jpg.

3. l’imagerie in Vivo par Micro-CT

ATTENTION : Avant de commencer, toujours enlever n’importe quel bijoux en métal ou des objets métalliques près de la zone d’imagerie, d’éviter la dispersion des rayons x.

NOTE : Fibrose pulmonaire induite par le rayonnement est qu'une conclusion commune au cours de l’irradiation induit de lésion pulmonaire24. Micro-CT dérivé indices ni histologiques associées à la fibrose pulmonaire étaient présentes chez les souris témoins traités saline sur 21 jours soumis à quatre Micro-CT séances d’imagerie, ce qui indique que la dose de rayons x livré aux animaux au cours de la Micro-CT des examens n’était pas suffisante ne puisse affecter les résultats.

  1. Allumer le Micro-CT en appuyant sur le bouton vert puissance et lancez le logiciel pour se réchauffer à la source de rayons x. Utilisez le petit calibre et le lit d’animaux pour les souris d’imagerie.
  2. Créez la base de données en cliquant sur nouvelle base de données pour un nouveau et construire le navigateur basé sur le nombre de souris dans l’expérience, ou cliquez sur la connexion à la base de données existante pour enregistrer les données dans un déjà créé un.
  3. Avant de commencer la numérisation, sélectionnez les paramètres d’acquisition dans la fenêtre de contrôle de logiciel : tension du tube radiogène, 90 kV ; CT x-ray tube courant, 160 µA ; Direct courant, du tube radiogène 80 µA ; Champ de vision, 36 mm ; Aucune technique de blocage ; Technique, Scan haute résolution 4 min.
  4. Anesthésier les souris par inhalation de 3 % isoflurane et placez-les sur le lit, pénètre dans le trou avec un cône de nez fournissant un apport constant d’anesthésique. Immobiliser les pattes des souris avec du ruban adhésif sur le lit pour permettre à la poitrine à exposer.
  5. Faites glisser la porte instrument et activer le Mode réel de voir la position de la souris en temps réel en appuyant sur la touche de capture. Déplacer le lit animaux pour aligner la poitrine avec le champ de vision (FOV) à l’aide des boutons situés directement sur l’instrument de la CT. Centrer l’analyse sur la souris ; Si ce n’est pas le cas, ajustez la position avec les flèches gauche et droite situés sur l’instrument de la CT.
  6. Confirmer la position de lit optimale en tournant le portique en cliquant la valeur 90 ° . S’assurer que la région de l’image est entièrement à l’intérieur du champ de vision.
  7. Ne pas appliquer n’importe quelle technique de blocage et démarrer le scan en cliquant sur le bouton de balayage de CT . Cliquez sur Oui au message qui informe que la source de rayons x sera allumée.
    Remarque : Une fois que les rayons x sont allumés, le voyant orange sur le dessus de l’appareil s’allume et la porte coulissante ne sera pas possible d’ouvrir pour la sécurité de l’opérateur. Une fois le scan terminé, une nouvelle fenêtre du logiciel Viewer 2D apparaît affichant la transversale, coronale et sagittale tranche de la reconstruction.
  8. Vérifier la qualité d’image et être sûr de ne pas ont brouillé les images de mouvements en raison de la faiblesse de l’anesthésie. Si nécessaire, répéter l’analyse.
  9. Remettre les animaux dans la cage et n’oubliez pas qu’ils se remettre complètement de l’anesthésie.

4. Lavage bronchoalvéolaire

  1. Anesthésier les animaux avec 3 % isoflurane et le sacrifice par le saignement de l’aorte abdominale.
  2. Utiliser des ciseaux pour exposer la cage thoracique et du cou. Exposer la trachée, puis faire une petite incision pour permettre à la procédure de BAL à effectuer avec un tube de calibre 21 lavage attaché à une seringue de 1 mL sans l’aiguille. Attention ne pas à couper à travers la trachée.
  3. Pour effectuer le BAL, remplir la seringue de 1 mL sans aiguille avec 0,6 mL de solution stérile [10 x Hank équilibré de solution saline (HBSS) ; l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 100 mM, 1 mM d’acide 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic (HEPES) ; distillée eau].
  4. Insérez le tube de lavage dans l’incision dans la trachée et, lentement, injecter et retirer la solution 3 fois, faire une pause sur le troisième retrait pour permettre une collecte optimale de la BALF pour analyse ultérieure.

5. histologie et histomorphométrie

  1. Exposer et supprimer les poumons, les gonfler avec une canule dans la trachée par infusion douce avec 0,6 mL de 10 % de formol tamponné neutre et stocker les échantillons à la température ambiante pendant 24 h.
  2. Déshydrater des échantillons à travers différents passages dans l’augmentation des concentrations des solutions d’alcool (éthanol à 60 % pendant 1 h, éthanol à 70 % pour l’éthanol à 90 % pendant 1 h, 1 h, éthanol à 95 % pendant 2 h et 100 % d’éthanol pendant 2 h) à l’aide d’un processeur de tissu automatique.
  3. Placer les échantillons dans le xylène pendant 2 h pour les rendre translucides. À la fin de la déshydratation, infiltrer les échantillons à la paraffine à 60 ° C pendant 3 h et les intégrer dans le processeur automatisé.
  4. Obtenir 5 µm les coupes sériées épaisse à l’aide d’un microtome rotatif.
  5. Déparaffiner et réhydrater les diapositives dans les classes descendantes d’éthanol et tacher avec Trichrome de Masson à l’aide d’un processeur de tissu automatique.
  6. Manuellement, se concentrer sur des tranches de poumon, numérisation à un grossissement de X 20 à l’aide d’un scanner de diapositives et images numériques des sections ensemble du poumon à l’aide du logiciel Regarde un avec une résolution de 451 nm/pixel.
  7. Morphologiquement évaluer les lésions pulmonaires fibreuses par paramètres semi-quantitatives et quantitatives comme suit :
    1. Déterminer le score d’Ashcroft. Catégorie semi quantitative des changements morphologiques dans les sections du poumon selon le barème défini par Ashcroft10 modifié par Hübner et al. 25 utilisation du système de 0-8 score d’évaluer tout le parenchyme dans les sections de poumon.
    2. Déterminer la teneur en collagène. Quantifier le degré de fibrose10,25 par le logiciel d’analyse image microscope. Choisir au hasard trois ROIs à un grossissement de X 10, par chaque diapo. Normalisation des paramètres de seuil de couleur, de détecter le collagène comme zone de coloration verte.
    3. Déterminer la zone de l’Air alvéolaire. Quantifier la zone de l’air alvéolaire comme paramètre indirect de fibrose10,25. Utilisant le même logiciel et ROIs appliqués pour la fraction de la fibrose, détecter la zone d’air dans la ROIs en utilisant un seuil blanc.

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Résultats

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Résolution spontanée des lésions de fibrose pulmonaire a observé trois semaines après que administration unique de la bléomycine et changements structurels modérés soulignent les limites de ce modèle. Seul un traitement préventif peut être effectué en raison de l’étroite fenêtre thérapeutique qui ne représente pas de pratique clinique17.

Ici, nous démontrons que notre protocole d’instillation intratrachéa...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malgré les nombreux groupes de recherche se concentrant sur le développement de nouveaux médicaments pour traiter l’IPF, à l’heure actuelle, deux seulement sont disponibles pour les patients. Il y a un besoin médical urgent de trouver des thérapies plus efficaces7 car seul poumon transplantationis capable de prolonger la survie de 4 à 5 ans,26. La préalable indispensable à la médecine translationnelle et développement de nouveaux médicaments est la disponibilité d’un modèle...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs aimeraient remercier Dr. Daniela Pompilio et Roberta Ciccimarra pour l’aide technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FMT 2500 Système de tomographie par fluorescencePerkin Elmer Inc.Constructeur
MMPsense 680Perkin Elmer Inc.NEV10126Protéger de la lumière, ranger la sonde à 4 ° ; C
Logiciel TrueQuantPerkin Elmer Inc.
Femelle consanguine C57BL/6San Pietro NatisoneHorst, Pays-Bas (UD),  ;Avant l’utilisation, les animaux ont été acclimatés pendant au moins 5 jours aux conditions locales du vivarium
IsofluraneESTEVE spa571329.8Ne pas inhaler
Compteur de cellules automatiséDasit XT 1800JExperimental Builder
Solution saline, chlorure de sodium à 0,9 % (NaCl)Eurospital15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner  ;Perkin Elmer Inc.
Sulfate de bléomycine de Streptomyces Verticillus  ;Sigma  ; B2434  ;
Processeur automatique de tissus  ;ATP700 Histo-Line LaboratoriesATP700  ;
Système d’encastrement  ;EG 1160 Leica BiosystemsEG 1160
Microtome rotatifSlee Cut 6062
Scanner de lames numérique  ;NanoZoomer S60, logiciel d’analyse d’images NIS-AR de Hamamatsu Photonics
  ;Nikon
Masson' s TrichromeStaining Histo-Line Laboratories
10 % de formol à tampon neutreSigmaHT5012-1CS
Penn-century modèle DP-4M Insufflateur à puissance sèchePenn-centuryDPM-EXT
PE190 micro tube médical2 instruments biologiques sncBB31695-PE/8
Seringue sans aiguille 5 mLTerumoSS*05SE1Couper les planches du piston à l’aide de ciseaux
Hamilton 0,10 mL (modèle 1710)Étanche au gaz81022
Robinet d’arrêt 3 voies DiscofixSeringue4095111
avec aiguille 1 mLSolution Pic3,071,260,300,320Utilisation sans aiguille
Tubes d’alimentation en plastique 18 ga x 50 mm2instruments biologiques sncFTP-18-50Couper obliquement la pointe  ;
expérimental

Références

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Mots-clés

Imagerie micro CTImagerie non invasiveSuivi de la fibrose pulmonaireMod le murinFusion FMT Micro CTQuantification des voies respiratoiresValidation histologique

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