Article de méthode

Une méthode pratique pour l’Extraction et analyse par chromatographie liquide à haute pression des neurotransmetteurs catécholamines et de leurs métabolites

DOI :

10.3791/56445

⸱

1 mars 2018

 ,  ,  ,  , 
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons une commode extraction en phase solide couplée à la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) avec détection électrochimique (DCE) pour la détermination simultanée de trois neurotransmetteurs de monoamine et deux de leurs métabolites dans les urines des enfants en bas âge. Nous identifions également le métabolite MHPG comme un biomarqueur potentiel pour le diagnostic précoce des lésions cérébrales chez les nourrissons.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’extraction et l’analyse des neurotransmetteurs catécholamines dans les liquides biologiques est d’une grande importance pour évaluer le fonctionnement du système nerveux et les maladies apparentées, mais leur mesure précise est toujours un défi. De nombreux protocoles ont été décrites pour la mesure de la neurotransmetteur par une variété d’instruments, y compris la chromatographie liquide à haute pression (HPLC). Cependant, il existe des lacunes, comme l’opération compliquée ou difficile à détecter des cibles multiples, qui ne peuvent être évités, et actuellement, la technique d’analyse dominant est toujours HPLC couplé avec électrochimiques sensibles ou détection fluorimétrique, due à sa sensibilité élevée et bonne sélectivité. Ici, un protocole détaillé est décrit pour le prétraitement et la détection des catécholamines par chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique (HPLC-DPE) dans les échantillons d’urine réelle des nourrissons, à l’aide de nanofibres composite électrofilées composé des polymères éther couronne avec du polystyrène comme adsorbant, également connu comme la méthode d’extraction (PFSPE) emballé-fibre en phase solide. Nous montrons comment urine échantillons peuvent être facilement precleaned par une colonne de nanofibres-emballés en phase solide, et comment l’analyser dans l’échantillon peut être rapidement enrichi, désorbés et détecté sur un système de développement du jeune enfant. PFSPE simplifie considérablement les procédures de prétraitement des échantillons biologiques, permettant une diminution de temps, frais et réduction de la perte de cibles.

Dans l’ensemble, cet ouvrage illustre un protocole simple et commode pour l’extraction en phase solide couplée à un système HPLC-DCE pour la détermination simultanée de trois neurotransmetteurs monoamines (noradrénaline (Na), épinéphrine (E), dopamine (DA)) et deux de leurs métabolites (3-méthoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) et l’acide 3, 4-dihydroxy-phénylacétique (DOPAC)) dans les urines des enfants en bas âge. Le protocole établi a été appliqué pour évaluer les différences des catécholamines urinaires et leurs métabolites entre les nourrissons à haut risque avec des lésions cérébrales périnatales et témoins sains. Analyse comparative révèle une différence significative dans le MHPG urinaire entre les deux groupes, ce qui indique que les métabolites des catécholamines peuvent être un marqueur important de candidats pour un diagnostic précoce des cas à risque de lésions cérébrales chez le nourrisson.

Introduction

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Neurotransmetteurs catécholamines et leur contenu de métabolites dans les fluides corporels peut affecter la fonction neurale et affecter l’équilibre des États aux stimuli-réponse à une grande partie1. Anormales peut causer une variété de maladies, telles que pheochromacytoma, SURRENALIEN, neuroblastome et troubles neurologiques1,2. L’extraction et le dosage des catécholamines dans les fluides corporels est significatif pour le diagnostic des maladies concernées. Cependant, les catécholamines dans des échantillons biologiques existent en faibles concentrations et sont facilement oxydés. En outre, ils sont très difficiles à éluer à cause de la grande quantité d’interférence en moyenne3. Ainsi, la détection simultanée des catécholamines dans les liquides biologiques est toujours un défi.

Il y a eu des commentaires montrant que les catécholamines urinaires peuvent être une mesure de contrainte, et que leurs niveaux sont des marqueurs biologiques importantes répondant à la stimulation tactile, traitement des nouveaux-nés5. Selon les recherches, tous les nourrissons qui ont subi des incidents prématurées sont à risque de blessures de cerveau pour4,5,6, et blessure peut provoquer la libération anormale des catécholamines et des questions connexes dans les fluides. Il existe des techniques avancées de résonance magnétique capable de détecter des lésions cérébrales dans les précédentes phases7,8. Toutefois, dans les premières 48 h, un processus de développement neurologique anormal provoque crânien permanent qui ne sera pas évident dans des images médicales11. En outre, les ressources de l’instrument haut coût et rares, ainsi que d’autres facteurs, le rend impossible pour toutes les unités néonatales d’avoir accès à ces techniques spécialisées de neuro-imagerie. Cependant, l’utilisation d’un biomarqueur facilement accessible et pratique (tels que les catécholamines et leurs métabolites) pourrait surmonter ces lacunes, et la projection d’un biomarqueur dans les fluides humains peut aider dans le diagnostic précoce des lésions cérébrales et prendre rapidement des identification des nouveau-nés qui ont besoin de neuroprotection9. Les catécholamines dans l’urine peuvent être un indice simple et évident, en raison de la corrélation directe entre le montant de leur libération dans les fluides et la fonction neuroactivity.

Parmi les liquides biologiques, le liquide céphalorachidien (LCR) et des échantillons de plasma ne sont pas faciles à obtenir par l’intermédiaire de procédures traumatisantes existantes, et il est aussi très difficile de se débarrasser des perturbations dues à la protéine adhésive et d’autres impuretés, conduisant à une pénible et processus fastidieux d’échantillonnage qui ne convient pas pour la détection répétée. Aussi, pour les enfants, il est presque impossible d’obtenir les échantillons de façon traumatique. Prélèvement urinaire est donc mieux que les autres formes d’échantillonnage, car il est non invasif, facile à utiliser et peut être fait à plusieurs reprises. Les échantillons d’urine sont abondants et faciles à stocker et montrent de grands avantages sur les autres formes d’échantillons biologiques.

Les principales méthodes pour quantifier des catécholamines dans les liquides biologiques comprennent les radioenzymic dosages10dosages immunitaire-sorbent-enzymatique11, voltamétrie12 et lentille thermique spectrométrie13. Mais lacunes existent, telles que des opérations complexes et difficiles à détecter des cibles multiples. Aujourd'hui, la technique d’analyse dominante est de chromatographie liquide à haute performance (HPLC)14, couplé avec sensible électrochimique15 ou fluorimétrique détection16, en raison de sa grande sensibilité et une bonne sélectivité. Avec la technologie de spectrométrie de masse en tandem, comme la chromatographie en phase liquide/spectrométrie de masse (LC/MS) et liquid chromatography/mass spectrometry/spectrométrie de masse (LC/MS/MS), l’analyse et la quantification des neurotransmetteurs peuvent atteindre de haut précision et la spécificité de17,18. Cependant, la technique MS nécessite instrumentation coûteuse comme main-d'œuvre largement qualifiée, rendant la méthode difficilement applicable universellement dans les laboratoires plus classiques. Systèmes HPLC-DCE sont équipés généralement dans les laboratoires cliniques et plus classiques et sont ainsi devenus un choix commun et bon pour les groupes de recherche à utiliser pour le dosage chimique, mais elles nécessitent l’échantillon introduit dans le système pour être propre et de a petite Echelle volume19. Ainsi, il est d’une grande importance pour purifier et condenser l’échantillon avant l’analyse. La méthode classique pour la purification est extraction liquide-liquide14,15,20 et off-line extraction en phase solide, y compris l’alumine activée colonne21,22 et diphenylborate (DPBA) complexation23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. ont utilisé résine polymère modifié chimiquement avec de l’éther couronne comme l’adsorbant pour extraire sélectivement des catécholamines dans l’urine humaine depuis 200727. En outre, en 2006, Haibo He et al. fait preuve d’une approche de synthèse facile pour boronates affinité extraction sorbant byutilizing un nanomagnétiques fonctionnalisable polyédriques SILSESQUIOXANES oligomériques (POSS) selon des structures composite et appliquant à l’enrichissement des catécholamines dans l’urine humaine (noradrénaline, adrénaline et à l’isoprénaline)28. Ils ont également profité de la nanomatériaux pour accomplir le travail, en utilisant une technologie appelée nano-électrofilage et formant le matériau fibreux de polymère à l’échelle nanométrique. Le processus électrofilage peut ajuster le diamètre, la morphologie et alignement spatiale du produit en contrôlant la tension de service et de modifier le contenu de la solution de filage ainsi que d’autres paramètres29. Comparée à la cartouche SPE classique, nanofibres électrofilées sont très adaptés extraire et enrichir les analytes cibles d’une matrice complexe, car elles sont équipées des rapports élevés de surface-surface-à-volume d’adsorber les analytes à haut rendement, et pièce plus facilement contrôlée par surfaces propriétés chimiques, permettant la fixation pratique des composés cibles. Ces propriétés font le bon choix pour adsorbants SPE, qui réduit considérablement la phase solide et la désorption solvant montant30,31,32,33. Des catécholamines dans les échantillons d’urine, nanofibres électrofilées composés d’éther couronne apolymeric avec du polystyrène (PCE-PS) ont été utilisés pour extraire sélectivement trois catécholamines (NE, E et DA)34. Le document indiquait que l’éther couronne sélective adsorbés les cibles du NE, E et DA, qui reposait sur sa géométrie correcte permettant de lier les catécholamines via formant des liaisons hydrogènes. Les résultats affichés l’éther couronne matérielle efficacement, éliminer les autres composés interférents contenues dans des échantillons biologiques. Inspiré par ce rapport, une nouvelle méthode a été développée pour l’extraction sélective des catécholamines par utilisation de nanofibres composite électrofilées composé de PCE-PS.

Dans cet article, la méthode déjà rapporté34 a été améliorée et utilisée non seulement pour analyser avec succès E, NE et DA, mais aussi leurs métabolites, MHPG et DOPAC, dans l’urine. Nous explorons également de nouvelles possibilités pour le mécanisme du processus d’adsorption. La méthode montre satisfaisant de l’efficacité d’extraction et de sélectivité pour les cinq analytes, et la méthode a été vérifiée dans l’analyse de l’urine de nouveau-nés à haut risque avec des lésions cérébrales périnatales et témoins sains.

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Protocole

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Le consentement éclairé des parents a été obtenu, et l’approbation du Conseil d’examen de l’établissement a été obtenue pour l’étude. L’étude a été réalisée conformément au code de déontologie de l’Association médicale mondiale (déclaration d’Helsinki) pour des expériences sur des êtres humains. Soignants de tous les participants prévus écrits préalable pour être inscrits à l’étude. Approbation du Comité d’éthique de l’hôpital Zhongda, filiale avec l’Université du sud-est, a également été obtenu.

1. préparation des colonnes et des Solutions nécessaires à l’Extraction et le dosage des catécholamines

  1. Préparer la colonne PFSPE. Diviser 1-2 mg de nanofibres PCE-PS en 5-6 portions et utiliser une fine tige d’acier avec 0,5 mm de diamètre pour les compresser ordonnée dans l’extrémité d’un embout de la pipette avec un volume de 200 µL.
  2. Préparer l’urine artificielle par pesage 2,427 g d’urée, acide urique 0,034 g, 0,09 g de créatinine, citrate trisodique 0,297 g, 0,634 g de chlorure de sodium, 0,45 g de chlorure de potassium, 0,161 g de chlorure d’ammonium, 0,089 g Chlorure de calcium dihydraté, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydrate, 0,034 g de bicarbonate de sodium, oxalate de sodium 0,003 g, 0,258 g de sulfate de sodium, dihydrogénophosphate de sodium 0,1 g et phosphate disodique 0,011 g et dissoudre dans 200 mL de produits chimiques ci-dessus désionisée eau.
  3. Préparer 2 mg/mL solution de diphenylborate (DPBA) solution en dissolvant 2 mg du composé dans 1 mL d’eau distillée. Conserver la solution dans l’obscurité à 4 ° C.
  4. Norme de l’analyte
    Remarque : La structure chimique et les propriétés des catécholamines sont instables, et ils se décomposent facilement. Le processus d’élaboration des normes doit être très rapide et doit prévenir l’exposition aux rayons du soleil.
    1. Peser 1,0 mg de NE, E, DA, MHPG, DOPAC et interne standard 3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA dans des tubes de microcentrifuge séparée 1,5 mL. Diluer la solution benzoïque dans l’eau à 100 ng/mL avant utilisation.
    2. Osciller les normes préparées dans l’obscurité à grande vitesse jusqu'à ce que les analytes se dissoudre complètement. Il s’agit de l’étalon primaire ; conserver à-20 ° C pendant jusqu'à plusieurs semaines.
    3. Préparer des stocks secondaire 1 000 ng/mL d’analytes. Pour NE, E, DA, DOPAC et MHPG, transférer 5 µL de chaque analyte primaire stock dans 4 975 µL d’eau distillée dans un tube à centrifuger 5 mL et stockez-le dans l’obscurité à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Préparer ces frais du jour des solutions. Pour benzoïque, transférer 5 µL d’étalon primaire dans 4 995 µL d’eau distillée dans un tube à centrifuger 5 mL et stockez-le dans l’obscurité séparément à 4 ° C.
    4. Préparer des dilutions supplémentaires avec la crosse de l’analyte secondaire pour créer une courbe standard (p. ex.., supplémentaires Tableau 2). Stocker des solutions dans l’obscurité à 4 ° C et préparer les frais du jour.
    5. Tester la tension optimale du détecteur ECD en utilisant le stock standard avec une concentration appropriée. Varier la tension afin de trouver une valeur où les analytes ont la meilleure apparence de pointe.
  5. Préparer l’éluant contenant 30 % d’acide phosphorique, 15 % d’acétonitrile, et 55 % d’eau distillée. Pour 10 mL de solvant de l’éluant, utilisez 5,5 mL d’eau distillée et ajouter 1,5 mL d’acétonitrile et 3 mL d’acide phosphorique goutte à goutte dans l’eau.

2. préparation des échantillons d’Urine réelle et la Phase Mobile

  1. Ont les mères à recueillir les premières urines du matin de leurs enfants à l’aide de godets d’urine aseptique. Transférer les échantillons dans des tubes en polypropylène et étiquette immédiatement. Ensuite, stocker les échantillons dans un congélateur à-20 ° C.
  2. Vortex et centrifuger les échantillons urinaires à 1 510 x g pendant 10 min à la température (RT) de se débarrasser de la plupart des interférences particulaire ambiante. Jeter le sédiment et rassembler les surnageants d’autres expériences. Afin d’extraire efficacement les analytes, passez à PFSPE un prétraitement (étape 3) immédiatement après centrifugation.
  3. Préparer la phase mobile
    1. Préparer une bouteille propre, au moins 1 L. La composition de la phase mobile est répertoriée dans le Tableau complémentaire 1; pour la phase mobile 1 L, mesure 6,7242 g d’acide citrique, 93,06 mg de sel disodique d’éthylène diamine tétra acétique (EDTA), 7,02 g d’orthophosphate de sodium monométalliques, 404,5 mg de sel de sodium acide heptanesulfonique-1 et 3,5 g de sodium hydratent dans la bouteille. Ajouter 40 mL d’acétonitrile et distillée à 1 000 mL. Agiter et vibrer aux ultrasons pendant 15 min jusqu'à ce que la question de la solution se dissout.
    2. À l’aide d’un pH-mètre avec une électrode de verre, ajuster le pH de la phase mobile à 4.21 avec une solution saturée d’hydroxyde de sodium.
    3. Filtrer la phase mobile avec une membrane microporeuse des fluorure de polyvinylidène 0,45 µm et un dispositif d’aspiration à dépression pour se débarrasser des impuretés.
    4. Utilisez vibration ultrasonique pendant 15 min pour dégazer la phase mobile chaque fois avant de l’utiliser.

3. PFSPE Extraction et analyse par CLHP

  1. Activer les nanofibres. Appuyez sur 100 µL de méthanol et 100 µL d’eau séquentiellement à travers la colonne PFSPE à l’aide d’une seringue de 5 mL d’une manière lente, goutte à goutte.
  2. Mélanger 100 µL d’urine déguster avec 100 µL de solution de DPBA 2 mg/ml et 30 µL 100 ng/ml de solution de benzoïque (IS, étalon interne) dans un tube de 0,5 mL EP, puis transvaser la mélange de la solution dans la colonne PFSPE. Appuyer sur la solution d’échantillon mélangé par le biais de la colonne PFSPE avec une seringue en plastique étanche de 5 mL à l’aide de la force de la pression de l’air.
  3. Lessiver la colonne trois fois en chargeant 100 µL de solution DPBA (2 mg/mL) dans la colonne SPE et poussez la solution lentement à travers la cartouche avec la pression de l’air à l’aide d’une seringue en plastique étanche de 5 mL.
  4. 50 µL de l’éluant sur la colonne PFSPE de la charge et le pousser à travers la colonne, en recueillant l’éluat avec un tube de 0,5 mL EP.
  5. Allumez le dégazeur de fonctionnement d’une solution contenant de l’air dans le système. Avant les analyses d’échantillons, le système devrait fonctionner pendant plus de 0,5 h avec la phase mobile pour équilibrer et réduire le bruit de la ligne de base. Voir supplémentaire tableau 1 liste les paramètres de configuration du système HPLC.
  6. L’échantillon de 20 µL de l’éluat à l’aide d’un échantillonneur automatique et injecter ensuite dans le système HPLC-DCE.
  7. Lorsque les essais sont terminés, éteignez la cellule du détecteur à l’aide de l’interface détecteur. N’éteignez pas la cellule avec le commutateur à l’arrière du détecteur, car cela pourrait endommager l’instrument.
  8. Modifier manuellement la composition de la phase mobile 10 % méthanol et 90 % d’eau. Fonctionner pendant au moins 30 min. Ensuite, modifier manuellement la phase mobile au méthanol de qualité CLHP. Fonctionner pendant environ 15 min protéger le système dans le méthanol. Pour exécuter cette étape suivant la durée recommandée peut entraîner des dommages à la colonne et le détecteur. Désactiver le flux, puis éteignez le dégazeur.

4. Extraction de cartouches (PBA) de l’acide phénylboronique

PBA cartouche extraction procédures étaient similaires au régime dans Kumar et al. (2011) 25. toutes les solutions sont poussées à travers la cartouche PBA (100 mg, 1 mL) avec de l’air forcé par une seringue.

  1. Conditionner la cartouche avec du 80/20 de 1 mL acétonitrile-eau (v/v) contenant 1 % d’acide formique et 1 mL de tampon de phosphate 50 mM (pH 10) dans l’ordre.
  2. Appuyez sur l’échantillon d’urine tamponnée (mL 1 urine et 2 mL de tampon de phosphate, pH 8,5) par l’intermédiaire de la cartouche PBA.
  3. Laver la cartouche avec 1 mL 50/50 v/v d’acétonitrile-un tampon phosphate (10 mM, pH 8,5).
  4. Éluer la cartouche avec 1 mL d’acétonitrile-eau (80/20 v/v) contenant 1 % d’acide formique.

5. identification et Quantification des catécholamines

  1. Linéarité
    1. Diluer le stock d’analytes secondaire avec urine artificielle à six concentrations (1.5, 3, 12, 25, 50 et 100 ng/mL) ; le volume de dilution de l’urine artificielle suit supplémentaires Tableau 2. Faire trois échantillons parallèles avec chaque concentration d’obtenir 18 solutions expérimentales de l’analyte pour construire les courbes d’étalonnage.
    2. Diluer 10 fois étalon secondaire benzoïque avec urine artificielle pour obtenir la solution expérimentale de 100 ng/mL.
    3. Prétraitez toutes les solutions d’analyte de 5.1.1, selon l’étape 3 (procédures d’extraction de PFSPE). Comme à l’étape 3, injecter 20 µL de chaque éluat correspondante dans le système de CLHP-DCE pour obtenir un chromatogramme HPLC.
    4. Construire les courbes d’étalonnage des cinq analytes en traçant le ratio de la surface du PIC (objectifs/IS) comme l’axe des Y contre le rapport des concentrations (objectifs/IS) comme l’axe des X, comme le montre supplémentaire Figure 1.
  2. LOD et NDD valeur de sensibilité
    1. Injecter 20 µL de l’urine artificielle vide dans le système de CLHP-DCE (comme à l’étape 3), pour obtenir le chromatogramme HPLC de l’échantillon.
    2. Dans le chromatogramme de 5.2.1, recueillir 11 valeurs vides de signal et calculer la valeur moyenne Xb et l’écart type Sb. Calculer le signal minimal d’une substance qui peut être détectée à un certain niveau de confiance, XL, XL = Xb+ K * Sb (K est le coefficient déterminé selon le niveau de confiance, Sb reflète le niveau sonore de la méthode de mesure et le niveau de bruit de machine). Ainsi, LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) /S (S correspond à la valeur de la pente de la courbe de travail).
    3. Définir un S/N de 3:1 (K = 3) comme la limite de détection (LD) et un S/N de 10:1 (K = 10) dans la limite de dosage (NdD).
  3. Évaluer le taux de récupération
    1. Préparer les échantillons d’urine réelle et enrichis. Diluer le stock d’analytes secondaire avec urine réel à trois concentrations (5, 50 et 100 ng/mL) afin d’obtenir les échantillons d’urine enrichis. Préparer les trois échantillons parallèles pour chaque solution d’analyte. Compter la concentration enrichie comme la quantité de composés cibles dopés dans l’échantillon d’urine. Définir cette valeur comme uns.
    2. Stock de benzoïque diluée à 100 ng/mL, comme au point 5.1.2.
    3. Traiter chaque solution d’échantillon de 5.3.1 selon l’étape 3 (procédures d’extraction de PFSPE) et injecter le 20 µL de chaque éluant correspondante dans le système de CLHP-DCE pour obtenir le résultat du chromatogramme. La valeur des analytes sera comptée comme une quantité de composés cibles quantifiées dans l’échantillon d’urine enrichis. Définir cette valeur comme unt.
    4. Injecter 20 µL de l’échantillon d’urine dans le système HPLC-DCE (comme à l’étape 3) pour obtenir le résultat du chromatogramme. La valeur des analytes sera comptée comme une quantité initiale de composés cibles quantifiées dans l’échantillon d’urine. Définir cette valeur comme unje.
    5. Calculer la quantité de composés cibles dans les échantillons provenant de l’équation de la courbe d’étalonnage. Le pourcentage de récupération est estimé à récupération méthodologiques % = (t - Ai) × 100 / (s). Valeurs moyennes sont indiquées dans le tableau 1.
  4. Évaluer l’imprécision
    1. Préparer les échantillons d’urine artificiels enrichis à 5, 50 et 100 ng/mL concentrations comme au point 5.3.1. Préparer six échantillons parallèles pour chaque solution d’analyte. Préparer les échantillons expérimentaux frais tous les jours.
    2. Diluer le stock benzoïque à 100 ng/mL comme au point 5.1.2.
    3. Évaluer la précision intra-jour (n = 6). Chaque solution d’échantillon en 5.4.1 selon l’étape 3 du processus et injecter le 20 µL de chaque éluant correspondant dans le système de CLHP-DCE pour obtenir le chromatogramme. Faire la même opération six fois dans la même journée.
    4. Calculer la quantité de composés cibles dans les échantillons provenant de l’équation de la courbe d’étalonnage. Selon la même concentration du même composé, l’écart type relatif (RSD) des six essais en une seule journée est déterminé comme précision intra-jour. Valeurs moyennes sont indiquées dans le tableau 1.
    5. Évaluer la précision inter-jour (n = 6). À la même heure chaque jour dans les six jours séquentielles, préparer les échantillons d’urine artificiels enrichis pour trois concentrations de 5, 50, 100 ng/mL, comme 5.4.1 et 5.4.2. et traiter chaque solution d’analyte échantillon selon l’étape 3.
    6. Injecter le 20 µL de chaque correspondant éluat de 5.4.5 dans le système HPLC-DCE pour obtenir des résultats de chromatogramme chaque jour. Calculer la quantité de composés cibles dans les échantillons provenant de l’équation de la courbe d’étalonnage. Inter-journée précision est exprimée par le RSD de la quantité d’essais sur des échantillons d’urine artificiels enrichis aux trois concentrations en six jours séquentielles. Valeurs moyennes sont indiquées dans le tableau 1.

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Résultats

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Ce protocole est une méthode simple et pratique de PFSPE pour prétraiter les échantillons d’urine et enrichir des cinq catécholamines pour la détection via un système HPLC-DPE ; un diagramme du processus est illustré à la Figure 1. Le protocole comprend principalement quatre étapes-activation, chargement, rinçage et élution - couplé avec une petite quantité de nanofibres PCE-PS et un dispositif d’extraction en phase solide simple. La morphologie des nanofibre...

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Discussion

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La méthode PFSPE proposée dans le présent document peut être importante et significative en ce qui concerne sa rapidité, simplicité et commodité. Les adsorbants utilisés dans le protocole sont nanofibres électrofilées, qui ont des rapports élevés de zone-volume surfaces et adsorbent les analytes à haut rendement. La procédure n’a besoin de quelques milligrammes de nanofibres et un faible volume de solvant de l’éluant et ne nécessite pas une étape d’évaporation se concentrer les analytes. Ici, nous avons présenté un aperç...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs certifient qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts avec toute organisation financière concernant les matières abordées dans cet article.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par le National Science Foundation de Chine (No.81172720, no 81673230), le Social Development Research Programme of Jiangsu Province Science et Technology department (no. BE2016741), Science & Technology Project de Chine Administration générale de la Supervision de la qualité, Inspection and Quarantine (2015QK055), le programme d’ouvrir un projet de laboratoire clé du développement de l’enfant et l’apprentissage de la Science du ministère de l’éducation, Université du sud-est (CDLS-2016-04). Nous saluons sincèrement Song Yuan et Ping Liu qui nous ont aidés dans la collecte d’échantillons.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
200 et micro ; L pipettepointe colonne pour contenir des nanofibres
Nanofibres PCE-PS matériau pour l’extractionPFSPE
tige d’acier (environ 0,5 mm de diamètre)remplir les nanofibres dans la colonne
seringue en plastique étanche au gaz (5 ml)compresser la solution à l’extrémité de la pointe
méthanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
ester de 2-aminoéthyle de l’acide diphénylborinique(DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408réactif complexe
noradrénaline(NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512analyte
3-méthoxy-4-hydroxyphénylglycol(MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377analyte
épinéphrine(E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503analyte
3, 4- Acide dihydroxyphénylacétique(DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128analyte
dopamine(DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromure (DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781étiquette intérieure
acétonitrileSigma-Aldrich.Inc75-05-8
acidephosphorique en phase mobileSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2acide urique eluriant
Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd69-93-2
créatinineSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd60-27-5
citrate trisodiqueartificiel Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd6132-04-3urine artificielle
KClSinopharm Chemical ReagentCo. , Ltd7447-40-7urine artificielle
NH4ClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd12125-02-9urine artificielle
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagentCo., LtdSWC0140326urine artificielle
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd62-76-0urine artificielle
NaSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7757-82-6urine artificielle
hydrogénophosphate disodiqueSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10039-32-4urée urinaire artificielle
Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd57-13-6urine artificielle
NaClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-14-5urine artificielle
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10034-99-8artificiel urine
CaCl2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10035-04-8urine artificielle
HClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-01-0urine artificielle
acide citriqueSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd77-92-9urine artificielle et phase mobile
EDTA sel disodiqueSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd34124-14-6phase mobile
orthophosphate de sodium monométalliqueSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7558-80-7urine artificielle et phase mobile
1-heptanesulfonic sel de sodiumSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd22767-50-6
hydroxyde de sodiumSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd1310-73-2
colonne d’acide phénylboronique en phase mobile (colonne PBA)Extraction Aglilent12102018PBA
Inertsil® ; ODS-3 5 et micro ; m 4.6&fois ; Colonne de 150 mmDikma5020-06731Colonne HPLC pour la séparation
SHIMADZU SIL-20AC proéminence ÉCHANTILLONNEUR AUTOShimadzu Corporation, JaponSIL-20ACauto-injection pour éluant
SHIMADZU LC-20AD Chromatographie liquide haute performanceShimadzu Corporation, JaponPompe HPLC LC-20AD
SHIMADZU L-ECD-60A Détecteur électrochimiqueShimadzu Corporation, JaponDétecteur L-ECD-60Apour les analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry SystemMicromeritics, USASurface and Porosity Analyzer  ;
urinaire artificielle en phase mobile

Références

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