Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

Résumé

Le test des comètes est une méthode efficace pour détecter les lésions de l’ADN dont l’ADN simple et double-brin se brise. Nous décrivons la comète neutres et alcalins des essais pour mesurer les lésions de l’ADN dans les cellules cancéreuses pour évaluer les effets thérapeutiques de la chimiothérapie.

Résumé

Dommages à l’ADN sont un phénomène commun pour chaque cellule pendant sa durée de vie et sont défini comme une altération de la structure chimique de l’ADN génomique. Les thérapies contre le cancer, tels que la radio - et chimiothérapie, introduisent une quantité énorme d’autres dommages à l’ADN, menant à l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose pour limiter la progression du cancer. Évaluation quantitative des dommages à l’ADN au cours du traitement expérimental contre le cancer est une étape clé pour justifier l’efficacité d’un agent génotoxique. Dans cette étude, nous nous concentrons sur un essai d’électrophorèse unicellulaire, également connu sous le nom du test des comètes, qui permet de quantifier unique et ADN double-brin breaks in vitro. Le test des comètes est une méthode de quantification des dommages ADN qui est efficace et facile à exécuter, et a de faibles exigences de temps/budget et reproductibilité élevée. Ici, nous mettons en évidence l’utilité de l’essai de comet pour une étude préclinique en évaluant l’effet génotoxique de la polythérapie olaparib/témozolomide aux cellules de gliome U251.

Introduction

Le test des comètes a été tout d’abord développé par Ostling et Johanson en 1984 en démontrant que la migration de l’ADN de fragments de noyaux en vertu d’une condition neutre¹. La technique a été développée plus tard par Singh et al., montrant qu’une condition alcaline a considérablement augmenté la spécificité et la reproductibilité du dosage². Depuis lors, le test des comètes neutre est surtout utilisé pour détecter les cassures double brin d’ADN, alors que le test des comètes alcaline est plus sensible pour les petits montants de dommages à l’ADN, simples et doubles brins de l’ADN brise, sites alcali-labile,....

Protocole

1. préparer des réactifs

1. 1 x PBS
   1. diluer à 100 mL de PBS 10 x avec 900 mL dH ₂ O et ajuster le pH à 7.4 à l’aide d’un pH-mètre. Conserver à température ambiante.
2. Solution de lyse (LS)
   1. préparer 2,5 M NaCl, EDTA de disodium de 100 mM, 10 mM Tris base et 200 mM NaOH dans 900 mL dH ₂ O ; il prend généralement environ 20 min pour permettre le mélange dissoudre complètement. Ajuster le pH à 10 à l’aide d’un pH-mètre. Ajouter 1 % sodium lauryl sarcosinate et 1 % X-100 Triton et ajuster le volume final à 1 000 mL. Refroidir à 4 ° C pendant au moins 30 min avant utilisation.<....

Résultats

Le présent protocole décrit un flux de travail étape par étape pour l’exécution de test comète et analyse de données (Figure 1). Résultats de dosages du comète alcalins et neutres ont montré que la queue de la comète de cellules d’U251 traités à la doxorubicine (1 µM, 20 h) était plus longue et a une plus forte intensité de l’ADN, ce qui suggère une accumulation importante de fragments d’ADN en raison de la chimiothérapie (Figure 2

Discussion

Le test des comètes est un outil efficace pour mesurer les cassures simples ou double brin de l’ADN au niveau cellulaire. L’essai a été largement appliquée comme un « étalon or » dans les études concernant la génotoxicité et biosurveillance¹³, allant des lésions base ADN crosslinks, développement de médicaments et sites sensibles d’alcali. Dans la présente étude, nous avons montré deux protocoles distincts d’étape par étape pour des dosages de comète neutres et alcalins, respectivement. Combinant .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
forts
10x PBS(Ca++, Mg++ gratuit)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Lauryl sarcosinate de sodium	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Acétate de sodium	Sigma	32318
Acide acétique glacial	Sigma	695092
Acétate d’ammonium	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
Low agarose à point de fusion	Invitrogen	16520
Agarose	Invitrogen	16500
95 % éthanol	WARNER-GRAHAM#	64-17-5
Trypsine	GIBICO	25300-054
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Consommables
Lames de tissu en verre	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifugeuse	Tubes DENVILLE
Pointes de pipette	SHARP
strong>Name	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Equipments
Microwave	Avanti
Waterbath	PRECISION
Chambre d’électrophorèse horizontale	TREVIGEN	Cometassay ES II
Alimentation	Bio-Rad
Incubateur	Quincy Lab	Modèle 12-140E
Microscope fluorescent	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf

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