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Une approche Simple pour induire une névrite auto-immune expérimentale chez la souris C57BL/6 pour les évaluations fonctionnelles et neuropathologiques

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DOI :

10.3791/56455

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9 novembre 2017

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1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

Dans cet article

Résumé

Ce rapport présente une approche simple pour provoquer avec succès l’expérimental névrite auto-immune (EAN) à l’aide de la protéine de la myéline zéro (P0)180-199 peptide en combinaison avec adjuvant complet de Freund et la toxine coquelucheuse. Nous présentons un modèle sophistiqué capable d’évaluer avec précision l’ampleur des déficits fonctionnels et neuropathologie qui se produisent dans cette EAN.

Résumé

Névrite auto-immune expérimentale (EAN) est un modèle expérimental fort apprécié des maladies démyélinisantes périphériques auto-immunes. Maladie de l’EAN est induite par l’immunisation de souris avec des peptides neurogènes pour diriger une attaque inflammatoire vers les composants du système nerveux périphérique (PNS). Les progrès récents ont permis à l’induction de l’EAN dans la lignée de souris C57BL/6 relativement résistante à l’aide de la protéine zéro (P0)106-125 ou P0180-199 peptides livrés en adjuvant combinée à l’injection de la toxine de la coqueluche. La capacité d’induire l’EAN dans la souche C57BL/6 permet l’utilisation des nombreux outils génétiques qui existent sur cette toile de fond la souris et permet ainsi l’étude sophistiquée de la pathogenèse de la maladie et à l’interrogatoire de l’action mécanique de thérapeutiques novatrices dans combinaison d’approches transgéniques. Dans cette étude, nous démontrons une approche simple pour provoquer avec succès l’EAN en utilisant le peptide de180-199 P0 chez les souris C57BL/6. Aussi, nous exposons un protocole pour l’évaluation des déficits fonctionnels qui se produisent dans ce modèle, accompagné d’un tableau de caractéristiques neuropathologiques. Ainsi, ce modèle est un puissant modèle expérimental pour l’étude de la pathogenèse de neuropathies démyélinisantes périphériques humains et pour déterminer l’efficacité des thérapies potentielles qui visent à favoriser la réparation de la myéline et protéger contre les dommages de nerf dans auto-immunes névrite.

Introduction

Les neuropathies périphériques peuvent être origine génétique ou acquise, avec neuropathies acquises ayant soit métabolique, ischémique, précipitants inflammatoires ou toxiques. Ces maladies sont également utilement classées comme axonale ou demyelinative à l’origine. Le plus souvent acquis démyélinisantes les neuropathies périphériques sont la polyneuropathie démyélinisante inflammatoire aiguë (paid, aussi connu comme le syndrome de Guillain-Barré, GBS) et Polyneuropathie inflammatoire chronique démyélinisante (CIDP)1, 2 , 3 , 4; les deux sont pathogenetically caractérisées par une réaction auto-immune dirigée contre la gaine de myéline, causant la démyélinisation des nerfs périphériques. Dans ces maladies, les lymphocytes T activés traversent la barrière de nerf de sang et de génèrent une réaction immunitaire dans le PNS. Activation des macrophages dans le nerf puis provoque la démyélinisation soit directement via attaque phagocytaire, soit indirectement par l’intermédiaire de médiateurs de l’inflammation sécrétées, entraînant des troubles cliniques tels que paralysie et dysfonctionnement sensoriel5. Tandis que les axones démyélinisés conservent la capacité d’être remyelinated après la démyélinisation, remyélinisation est souvent retardée ou incomplète, entraînant la susceptibilité des axones nus à des dommages irréversibles, qui est la cause principale de la clinique permanent personnes handicapées. Actuellement, les traitements les plus efficaces sont des immunomodulateurs, mais malgré leur efficacité, dans de nombreux cas la récupération est souvent lente et environ 25 % des patients éprouveront des déficits fonctionnels résiduels qui réduisent considérablement leur qualité de vie de6, 7.

EAN est un modèle animal couramment des maladies démyélinisantes neuropathie périphérique qui a fourni des renseignements précieux sur pathogenèse et un moyen d’évaluer de nouveaux agents thérapeutiques4. Ce modèle peut être induit chez les différentes espèces comme les lapins, rats, souris et les cochons d’Inde et est induite par l’immunisation avec des antigènes neurogènes. Toutefois, en fin de compte l’induction EAN réussie repose sur une réponse immunitaire appropriée pour la maladie de se produire. Compte tenu des variations de l’espèce (et inter-espèce/souche) la fonction immunitaire, plusieurs combinaisons d’antigènes et adjuvants ont été développés pour provoquer avec succès l’EAN. En ce qui concerne les outils de génétiques murines, le C57BL/6 est la plus largement utilisée ; Toutefois, le peptide de protéine P2 traditionnel 57-81 (P257-81) qui se traduit par la maladie dans la souche de souris sensibles SJL8 est incapable de pathogenèse illicite conduisant à des déficits fonctionnels chez la souche C57BL/6. Heureusement, les paradigmes de sensibilisation utilisant le P0106-125 ou P0180-199 peptides, livré en adjuvant combiné avec l’injection de la coqueluche, la toxine peut surmonter cet obstacle, permettant aux outils sophistiqués de génétiques être utilisés dans le modèle murin de EAN.

Ici, on présente une méthode simple pour l’induction de l’EAN chez les souris C57BL/6. En outre, une approche globale et détaillée permettant d’évaluer les déficits fonctionnels et neuropathologiques associés à la maladie est fournie. Le P0180–199 peptide9 a été choisie plutôt que le remplacement de P057-81 10. Le modèle de199 P0180–a été décrit pour produire des signes cliniques moins sévères par rapport à l' alternative de P057-81 10et est donc susceptible de résister à l’introduction de potentiellement des perturbations génétiques délétères, récupérer des interventions chirurgicales (par exemple, implantation de pompe osmotique) et se prête à la fonction de marche tapis roulant stable4. Cependant, le tapis roulant démarche tests de la fonction et histologiques protocoles décrits ici pourraient facilement être appliquées lors de l’étude de la maladie dans une variante de57-81 induite par P0.

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Protocole

toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par l’Institut Florey pour les neurosciences et le Comité d’éthique de la santé mentale (Centre de cerveau de Melbourne) Animal et suivre le Code de pratique australienne pour l’utilisation des animaux pour scientifique Application.

1. Induction EAN

Remarque : EAN peut être induite avec succès chez les souris C57BL/6 mâles âgés de 6 à 8 semaines. Le protocole d’induction dure 9 jours au total. Jour 0 désigne le jour de la première vaccination. Pour ce protocole, les injections ont été réalisées sous anesthésie (voir étape ci-dessous 1.1.2).

  1. Lors de la journée -1 :
    1. préparer la toxine de la coqueluche (voir Table des matières) solution de 1,6 µg/mL à l’aide de phosphate 0,1 M souris-isotonique stérile solution saline tamponnée (MT-PBS).
    2. Anesthetization à l’isoflurane :
        ,
      1. Placez votre souris (C57BL/6, mâle, 6 à 8 semaines) dans la chambre d’anesthetization et de régler le débit d’oxygène à 1 L/min.
      2. Allumez le vaporisateur isoflurane, réglez-le à 2,5 % pour anesthetization et le moniteur de respiration et attendez pendant 2 min, ou jusqu'à ce que les réflexes primaires (limbe cornéen et postérieur) sont sensibles n’est plus
    3. Retirer la souris de la chambre d’anesthetization et d’administrer les 250 µL de la solution ci-dessus de la toxine pertussique via une injection intrapéritonéale (i.p.) à l’aide d’une seringue 0,5 mL avec une aiguille de 30 1/2 G.
    4. Préparation de l’inoculum injectable pour la vaccination :
      1. Prepare Solution A à l’aide de 2 mg/mL de solution de peptide de 180-199 P0 (avec > 98 % de pureté, séquence S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) dans la solution saline à 0,9 %.
      2. Préparation de Solution B à l’aide de 20 mg/mL de solution de Mycobacterium tuberculosis (voir Table des matières) dans Freund ' adjuvant complet de s (FCA, comprenant : 15 % mannide monoolate + 85 % d’huile de paraffine et 0,5 mg/mL des morts et secs desséchés M Mycobacterium butyricum).
      3. Faire l’inoculum final d’injection, combiner des parties de volume égal de Solutions A et B dans un batteur de perle et mélangez-les à une vitesse maximale de 1 min à température ambiante.
        Remarque : Des Solutions A et B peuvent être gardées en stock et stockées à 4 ° C pendant un maximum d’un mois mais l’inoculum final combiné doit être fraîchement préparée le jour de l’injection de la souris.
  2. Lors de la journée 0, administrer 50 µL de l’inoculum (préparation décrite à l’étape 1.1.4) dans une souris via une injection sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 23 G.
    Remarque : L’injection peut être placée entre les omoplates, ou entre les membres postérieurs et la queue sur le dos de caudal.
  3. Le jour 1, font de la solution de la toxine pertussique de 1,2 µg/mL (en MT-PBS) et administrer 250 µL dans une souris par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue 0,5 mL avec une aiguille de 30 1/2 G.
  4. Le jour 3, répéter l’étape 1.3 ci-dessus.
    NOTE : Solutions mères A et B peuvent être constituées et stockées à 4 ° c pendant un maximum d’un mois. Toutefois, l’inoculum injectable final, produit par la combinaison des solutions mères A et B, doit être fait le jour de l’injection de.
  5. Le jour 8, administrer 50 µL de l’inoculum (préparation décrite à l’étape 1.1.4) dans une souris par une injection sous-cutanée (Voir l’étape 1.2 ci-dessus), sur le même site d’injection comme à l’étape 1.2 (pour chaque animal)

2. score clinique

  1. effectuer des cliniques marquant à partir de tous les jours le jour 0.
  2. Donnez chaque souris un score de 0, 1, 2, 3 ou 4 selon les critères publiés 4. Voir le tableau 1 pour la notation clinique EAN.
    Remarque : Par souci de cohérence, un effort doit être fait pour marquer la souris en même temps quotidiennement par le même chercheur.

3. Évaluation de la fonction de moteur

Remarque : le rendement moteur est évalué en parallèle avec un score clinique de la même cohorte d’animaux. L’appareil d’évaluation de la fonction motrice doit être connecté à un ordinateur qu’a un système d’imagerie de fonction de démarche (voir Table des matières) installé. Il est également recommandé que toutes les souris à évaluer doivent être habitués à la tâche en cours d’exécution avant l’induction de l’EAN. Pour ce faire, les pistes de pratique (2 séries de tests par souris) sont exécutées trois jours avant l’induction de la maladie (journée -3).

  1. Ouvrir l’appareil d’évaluation de la fonction motrice et allumez le bouton lumière.
  2. Scruff la souris fermement et encrer ses pieds en l’abaissant dans un récipient rempli d’encre rouge tout en tenant sa queue.
    Remarque : Cette étape est requise pour la souche C57BL/6, mais peut être ignorée si une souche de souris avec une couleur de la robe blanche est utilisée.
  3. Placez votre souris dans le compartiment en marche et régler la vitesse du tapis roulant à 15 cm/s.
  4. Tourner sur le tapis roulant et cliquez sur le " dossier " bouton pour capturer la requête en cours d’exécution de la souris à l’aide de la fonction de marche système d’imagerie (voir Table des matières).
  5. Utiliser un timer et mesurer chaque course pour 36 s. Après 36 s, arrêter l’enregistrement et arrêt du tapis roulant.
    Remarque : Les souris qui ne peut pas terminer avec succès la tâche en cours d’exécution pour cet intervalle s 36 sont considérés comme ayant échoué.
  6. Enregistrer le fichier vidéo dans le dossier.
  7. Répéter les étapes ci-dessus pour chaque souris pour être évalué. Les souris avec la même tâche en cours d’exécution de test tous les 3 jours.
  8. Analyser les fichiers vidéo édités à l’aide de logiciels pour les paramètres de fonction de démarche (voir Table des matières).
    Remarque : Les détails de la façon d’analyser les différents paramètres du moteur varient entre logiciels donc veuillez consulter le fabricant ' instruction s avant l’analyse. Pour obtenir une preuve histologique d’axonal et myéline par immunohistochimie ou microscopie électronique, animal tissus peuvent être pris à la toute étape post motricité évaluation selon les objectifs spécifiques de la recherche.

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Résultats

Peptide de180-199 P0 induite par EAN dans des chenaux de souris C57BL/6 pour une maladie monophasique avec score clinique début de post 6 jours premier gravité score de vaccination (dpi) et maximale est observée du dpi 25 suivi par certains score clinique amélioration de 40 dpi durée (Figure 1)4,9. En termes de fonction de la démarche, les souris commencent à échouer à une tâche en cours d’...

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Discussion

Le présent rapport décrit une méthode simple pour provoquer l’EAN utilisant le peptide de180-199 P0 chez les souris C57BL/6, qui permet la quantification des principaux déficits neuropathologiques et fonctionnelles chez la souris induits avec EAN. Distincte pour le protocole d’induction EAN décrit ici est l’utilisation de l’anesthésie, tout en effectuant les injections de vaccination. L’utilisation de l’anesthésie isoflurane améliore grandement la capacité de faire en sorte que le volume total de l’inoculum es...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt au sujet de ce travail.

Remerciements

DGG est NHMRC Peter Doherty et Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA) début carrière Fellow. JLF est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale MSRA. Ce travail a été soutenu par l’Australian National Health et projet Medical Research Council (NHMRC) accorder #APP1058647 à JX.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
C57BL/6, mâle, 6-8 semainesAustralian Bioresources Cenre, WA, Australie
toxines de coquelucheBiological Laboratories, Inc., CA, USA#181
0,1 M de souris isotonique phosphate tamponné salinisé (MT-PBS)Les laboratoires auront leur propre protocole.
Les laboratoires d’IsofluranePharmachem, QLD, Australieauront leur propre protocole d’administration.
P0180&ndash ; 199 peptideWuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHNP0180&ndash ; 199, séquence S&ndash ; S&ndash ; K&ndash ; R&ndash ; G&ndash ; R&ndash ; Q&ndash ; T&ndash ; P&ndash ; V&ndash ; L&ndash ; O&ndash ; A&ndash ; M&ndash ; L&ndash ; D&ndash ; H&ndash ; S&ndash ; R&ndash ; S
Mycobacterium tuberculosis tué par la chaleur (souche H37RA)Difco, MI, États-Unis#231141
Adjuvant complet de Freund (FCA)Difco, MI, États-Unis#263910
16 % de paraformaldéhyde (PFA)Services de microscopie électronique#15710Diluer à 4 % de PFA le jour du prélèvement des tissus.
25 % de glutaraldheydeProSciTech Pty Ltd, QLD, Australie#11-30-8Diluer à 2,5 % de glutaraldéhyde jour de fixation.
Azoture de sodiumChem-Supply Pty Ltd, SA, AustralieSL189Créer 10 % (p/v) de stock dans 0,1 MILLION MT-PBS. Utiliser à 0,03 % (v/v).
SucroseChem-Supply Pty Ltd, SA, AustralieSA030Utilisation à 30 % (p/v).
Température de coupe optimale (OCT) moyenneSakura Finetek, CA, USA#4583
Sérum d’âne normalMerck Millipore, MA, USA#S30-100Utilisation comme diluant d’anticorps à 10 % (v/v) ou autre concentration déterminée par son propre laboratoire.
Triton-X 100Sigma Aldrich, MI, États-Unis#90o2-31-1Utilisation dans un diluant d’anticorps à 0,3 % (v/v) ou à une autre concentration déterminée par son propre laboratoire.
protéine précurseur anti-amyloïde de lapin (APP)Invitrogen (Life Technologies), CA, USAS12700 Utiliséà 1:400 ou titré dans son propre laboratoire.
protéine 1 associée à l’anti-contactine de lapin (Caspr)Don du professeur Elior Peles, Institut Wiezmann des sciences, IsraëlUtilisé à 1:500 ou titré dans son propre laboratoire.
Anticorps secondaires conjugués au fluor Alexa appropriésSondes moléculaires (Life Technologies), OR, États-UnisDiversUtilisation à 1:200 ou titrage dans son propre laboratoire. Le choix de l’espèce dans laquelle l’anticorps a été élevé et d’Alexa Fluor choisi est à la discrétion de chaque laboratoire.
Solution d’enrobage aqueuxDako (Agilent), CA, USAChaque laboratoire aura sa propre préférence.
NameCompanyNuméro de catalogue<strong>Comments
Equipment
0.5 mL seringue avec 301/2 g aiguillesBD#326105
aiguilles de 23 gBD#305143
encreur rougeTout tampon encreur rouge ou colorant alimentaire rouge peut être utilisé pour marquer les pattes des animaux.
Appareil DigiGate (y compris tapis roulant)eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Système d’imagerie DigiGateeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
ChronomètreN’importe quelle minuterie peut être utilisée.
DigiGait 8 SoftwareeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Microscope de dissectionZeissTout microscope de dissection approprié peut être utilisé.
Lames chargéesSuperfrost Plus, Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
CyrostatLeicaN’importe quel cyrostat approprié peut être utilisé.
Équipement de perfusion et instrumentsLes laboratoires auront leurs propres protoctols de perfusion.
laboratoires peuvent produire leurs propresrécipients
Uncrayon decire ou une tension superficielle peuvent également être utilisés pour créer un puits autour de la section du tissu.
Microscope confocalZeis LSM780Tout microscope confocal avec des lignes laser appropriées peut être utilisé.
FIDJI/Image JInstituts nationaux de santéDisponible à partir de www.fiji.sc
Liste des#S3023 Tampon de dissection Les en plastique opaque.

Références

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).

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Mots-clés

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