Cet article illustre un modèle murin pour étudier le développement de l’hyperplasie myointimal (MH) après une lésion aortique ballon.
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Article de méthode
Blessure axée sur le ballon pour provoquer l’hyperplasie Myointimal dans l’aorte abdominale de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’utilisation de modèles animaux est essentielle pour une meilleure compréhension de la MH, une des principales causes de la sténose artérielle. Dans cet article, nous démontrons un modèle murin de ballon dénudation, qui est comparable aux modèles de lésion du navire établies dans les grands animaux. Le modèle de dénudation aorte avec des cathéters à ballonnet imite le contexte clinique et conduit à des changements physiologiques et pathobiological comparables. En bref, après avoir effectué une incision horizontale dans l' aorte abdominalis, un cathéter à ballonnet sera inséré dans le vaisseau, gonflé et introduit marqués. Gonflage du ballonnet conduira à des blessures de l’intima et une surdistension du navire. Après avoir retiré le cathéter, l’incision aortique sera fermée avec des points de suture unique. Le modèle présenté dans cet article est reproductible, facile à réaliser et peut être établie de manière rapide et fiable. Il est particulièrement approprié pour l’évaluation de coûteux agents thérapeutiques expérimentales, qui peuvent être appliqués de façon économique. À l’aide de différentes souches de souris knock-out, l’impact de différents gènes du développement MH peut être évaluée.
Introduction
La sténose artérielle dans les artères coronaires et périphériques a un effet important sur la morbidité et la mortalité des patients1. Un mécanisme pathologique sous-jacent est l’hyperplasie myointima (MH), qui se caractérise par une augmentation de la prolifération, la migration et la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire du muscle lisse vasculaire des cellules (SMC)2. SMC se trouvent dans la couche de support du navire et de migrer lors de la stimulation à la surface de la lumière. Signaux stimulants incluent les facteurs de croissance, cytokines, contact cellule-cellule, lipides, les composants de la matrice extracellulaire et cisaillement mécanique et étirement les forces3,4,5,6. Lésions de la paroi des vaisseaux, pathologique ou iatrogène, causent des cellules endothéliales et les dommages aux cellules de muscle lisse et stimulent les réactions inflammatoires et donc conduisent à MH7.
Différents modèles animaux sont actuellement disponibles pour étudier les lésions artérielles et hyperplasie myointima. Grands animaux comme les porcs ou les chiens ont l’avantage d’une artère similaire et l’anatomie coronaire de partage avec les humains et sont particulièrement adaptées aux études portant sur l’angioplastie techniques, procédures et dispositifs8. Cependant, modèles de cochon ont l’inconvénient de supérieur thrombogénicité9,10, tandis que les chiens n’ont une réponse douce à navire blessures11. En outre, tous les grands modèles animaux nécessitent logement spécifique, l’équipement et le personnel, qui est lié à des coûts élevés et n’est pas toujours disponibles dans une institution. Petits modèles animaux comprennent les rats et les souris. Comparativement à des rats, des souris ont les avantages d’un coût moindre et l’existence d’une variété d’assommer de modèles. Le modèle décrit dans cette vidéo peut être associé d’ApoE-/-souris nourries avec un régime occidental pour imiter étroitement le contexte clinique d’angioplastie dans navires athéroscléreuse12. Les modèles précédents induit des lésions vasculaires via fil blessures13, dessiccation fluide14, printemps15ou des rotateurs blessures16. Étant donné la nature de la lésion affectera grandement le développement et la constitution de MH, à l’aide d’un cathéter à ballonnet pour induire la lésion en est le meilleur moyen d’imiter le contexte clinique.
Dans cet article, nous décrivons une nouvelle méthode pour induire des MH avec un cathéter à ballonnet chez la souris. L’utilisation d’un cathéter à ballonnet (1,2 mm x 6 mm) avec un RX-Port (Figure 1 a) permet le grattage de la couche intimale et, en même temps, l’induction d’une surdistension du navire. Ces deux facteurs sont des déclencheurs importants pour le développement de MH. L’heure de l’observation pour ce modèle est de 28 jours,17.
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Protocole
Animaux a reçu tous les soins en conformité avec le Guide pour les principes des animaux de laboratoire, préparé par l’Institut des ressources animales de laboratoire et publié par le National Institutes of Health. Tous les protocoles d’animaux ont été approuvées par l’autorité locale responsable ('' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, (Bureau pour la santé et la Protection des consommateurs) de Hansestadt Hamburg'').
1. préparation du cathéter
Remarque : Reportez-vous à la Table des matières pour plus d’informations concernant le cathéter.
- Prenons cathéter de la titulaire de cathéter.
- Tirez le fil de guidage de la lumière par l’orifice distal dehors.
- Mettre dans une goutte de colle cyanoacrylate sur l’extrémité distale du cathéter.
ATTENTION : Porter des gants en latex ou nitrile. - Placez le fil de guidage dans le port de RX du cathéter et le faire avancer à travers la lumière à l’orifice distal. Ensuite, tirez le fil de guidage légèrement pour laisser un espace d’environ 5 mm à la fin.
- Attendre 5 min pour permettre à la colle sécher.
- Déplacer le fil-guide, il devrait être fixé. Si c’est toujours mobile, répétez les étapes 1.3 à 1.6.
- Remplir une seringue de 3 mL de sérum physiologique à 0,9 % 1,5 mL et connectez-le à l’orifice de gonflage du ballonnet.
- Pousser le piston de la seringue pour tester le gonflement du ballon. Laissez 0,6 mL sérum physiologique dans la seringue.
2. préparation souris
- Obtenir des souris mâles à l’âge de 14 semaines, pesant environ 30 g.
NOTE : Nous avons utilisé des animaux obtenus de l’Institute of Laboratory Animals. Nous avons utilisé ici C57BL/6J. - Une chambre à induction permet d’anesthésier la souris avec isofurane de 2,0 à 2,5 % (de 500 mL/min, débit d’oxygène).
- Placez la souris sur le dos sur un coussin chauffant et maintenir l’anesthésie avec un masque couvrant la bouche et le nez de la souris. Recherchez une profondeur suffisante de l’anesthésie en pinçant les pattes et la queue pour vérifier l’absence de réflexes.
- Enlever les poils abdominaux à l’aide d’une tondeuse à cheveux.
- Écarter les pattes postérieures et fixer leur position à l’aide de ruban adhésif.
- Désinfecter la région abdominale à l’aide de povidone-iode, suivie de l’éthanol à 80 %. Répétez cette étape deux fois plus.
- Utilisez un drap chirurgical opératoire ne risque pas être contaminé. Ouvrez les couches de la peau et des muscles le long de la linea alba avec un ciseaux (ou un scalpel) pour exposer les organes abdominaux.
- Poser les intestins dans un gant de hydratée saline 0,9 % et les envelopper pour les garder humides.
- Utiliser deux pinces fines pour enlever le tissu adipeux au-dessus de l’aorte abdominale.
- À l’aide d’une seringue à insuline (30G), injecter 250 µL de solution d’héparine (50 U/mL) dans la veine cave inférieure (VCI) et attendre 3 minutes pour sa distribution systémique. Héparine va supprimer l’hémostase et empêcher la coagulation indésirable pendant la chirurgie.
- À l’aide de deux pinces, disséquer l’aorte d’approche jusqu'à la bifurcation et ses navires sortant de la branche.
- Ligaturer les vaisseaux secondaires, qui sont supposés être placés dans la zone fixée, avec un cauterizer à haute température.
- Arrêter la circulation sanguine par un clampage de l’aorte approche directement sous les artères rénales.
- Placez une deuxième pince à une position distale juste au-dessus de la bifurcation aortique.
- Effectuer une petite incision horizontale à l’aide de ciseaux au point médian entre les mâchoires le long du vaisseau.
Remarque : La taille de l’incision doit être équivalente à 1/3 de la circonférence du vaisseau. - Insérer une seringue avec une aiguille (30G) dans l’incision et rincer l’aorte avec 250 µL de solution de l’héparine (50 U/mL).
- 10-0 sutures, placer un seul noeud de chaque côté de l’incision.
- Dilatation de l’aorte en y insérant un dilatateur de navire de l’incision et la propagation du navire légèrement. Répétez la dilatation 2 à 3 fois.
- Hydrater le cathéter à ballonnet avec la solution saline à 0,9 %.
- Insérer le cathéter à ballonnet aplati dans l’aorte et le faire avancer vers la pince proximale sur l’aorte.
- Lorsque vous atteignez la pince proximale, soigneusement ouvrir la pince proximale et gonfler le ballonnet pour éviter les fuites de sang, en injectant ~0.6 mL de sérum physiologique.
NOTE : Le rapport du ballonnet gonflé au bateau est de 1.5 : 1. - Avancez la sonde rétrograde pendant environ 2 cm.
- Tirez le cathéter élargi, tout en dégonflant le ballon légèrement en libérant la seringue.
- Rattacher la pince proximale lorsque la sonde atteint l’incision de l’aorte. Dégonfler le ballonnet complètement et retirez-le.
- Rincer l’aorte avec 250 µL de solution de l’héparine (50 U/mL) à l’aide d’une seringue de 30G.
- Refermer l’incision aortique à l’aide de sutures de 10-0. Endroit interrompu points sur chaque côté latéral, suivie d’un ou deux points de suture sur la face ventrale.
- Ouvrez la pince distale. En cas de saignement, refermer la pince et placez des points supplémentaires.
- Ouvrir la pince proximale avec précaution.
- Placez deux écouvillons sur la suture pour le soutenir et arrêter tout saignement.
- Placer une pince hémostatique résorbable sur la suture pour le soutenir.
Remarque : Un pouls aortique doit être visible dans la partie distale de l’incision. - Replacer l’intestin dans l’abdomen.
- Rincer la cavité abdominale avec du sérum physiologique 0,9 % stérile, qui a été préchauffé à 37 ° C.
- Fermer la couche de muscles abdominaux à l’aide de sutures en cours d’exécution de 6-0.
- Fermer la peau avec des sutures en cours d’exécution de 5-0.
- Injecter par voie sous-cutanée 4 ou 5 mg/kg carprofène avant de laisser la souris de se réveiller. Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il a pris conscience, maintenir le décubitus sternal. Garder l’animal seul dans une cage jusqu'à la guérison complète.
- Ajouter métamizolum à l’eau potable (50 mg/100 mL) comme médicaments contre la douleur pendant 3 jours et contrôler l’animal au quotidien. Habituellement, souris comme le doux goût de métamizolum et commencent à boire immédiatement après la chirurgie. Si vous préférez, agents injectables à libération peuvent être utilisés au lieu de métamizolum.
Remarque : La période d’observation pour ce modèle est de 28 jours.
3. histopathologie
- Récolter l’aorte ballon-blessé après 28 jours en préparant les souris comme décrit aux points 2.2 à 2,9.
- Utiliser des ciseaux pour enlever l’aorte ballon-blessés (entre la bifurcation et 0,3 mm au dessus des vaisseaux rénaux) et euthanasier la souris en découpant de son cœur.
- Rincer la lumière du navire avec 0,9 % NaCl.
- Difficulté du navire récolté dans 4 % de paraformaldéhyde (PFA) du jour au lendemain et il déshydrater dans l’augmentation des concentrations d’éthanol, commençant par l’éthanol à 70 % pour l’éthanol à 80 % pendant 1 heure, 2 heures, éthanol à 95 % pendant 2 heures et l’éthanol à 100 % pendant 5 heures. Puis, incuber les échantillons dans le xylène 2 heures 3 fois, avant de s’infiltrer dans les échantillons avec de la paraffine.
Remarque : au lieu de chasse d’eau du navire récolté avec 0,9 % NaCl, il peut être évacuée avec 4 % PFA.
ATTENTION : PFA et xylène sont toxiques et doivent être manipulées avec soin. - Incorporer l’échantillon à la paraffine et couper en tranches de 5 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome.
- Déparaffiner les diapositives avec xylène 3 fois pendant 5 minutes.
- Réhydrater les lames de tissu à l’aide d’une série décroissante de l’éthanol. Commencer avec 100 % d’éthanol 2 fois pendant 5 min, puis 3 minutes d’éthanol à 95 %, 80 % et 70 %.
- Tacher les diapositives avec coloration trichrome de Masson comme décrit18.
- Déshydrater les lames colorées dans 100 % éthanol 2 fois pendant 10 min chaque. Clair avec xylène 2 fois pour 10 min chacun et montez en milieu de montage.
- Visionner les diapositives avec un microscope à champ lumineux. Utiliser une lentille avec 5 x grossissement et une ouverture numérique de 0,12 pour une image d’aperçu ou une lentille avec des grossissements de 20 x avec une ouverture numérique de 0,35 pour l’observation détaillée.
4. la microscopie en immunofluorescence
- Réhydrater les lames de tissu à l’aide d’une série décroissante de l’éthanol. Commencer avec 100 % d’éthanol 2 fois pendant 5 min, suivie de 3 min d’éthanol à 95 %, 80 % et 70 %.
- Effectuer des recherche d’antigène en chauffant les lames dans une solution de recherche d’antigène dans un cuit-vapeur pendant 20 min.
- Laissez le refroidir de diapositives à température ambiante.
- Après avoir lavé les diapositives pour trois fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), appliquer une solution blocage antigène sur sections pendant 30 min.
- Les lames trois fois pendant 5 min avec du PBS.
- Incuber les sections avec l’anticorps primaire dilué dans du diluant l’anticorps primaire.
Remarque : Le bon moment de concentration et d’incubation doit être choisi séparément pour chacun des anticorps. - Les lames trois fois pendant 5 min avec du PBS pour éliminer les anticorps non lié.
- Incuber les sections avec un anticorps secondaire conjugué pré dilué dans l’anticorps secondaire diluant.
Remarque : Le bon moment de concentration et d’incubation doit être choisi séparément pour chacun des anticorps. - Ôter les anticorps non liés en lavant les diapositives pendant 5 min trois fois.
- Contre-coloration noyaux cellulaires à l’aide de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 15 min ; la concentration finale de DAPI devrait être de 350 nM.
- Monter les diapositives en immunofluorescence compatible solution de montage.
Remarque : En utilisant la solution de montage incorrect peut obscurcir le signal de fluorescence. - Consulter les diapositives avec un microscope à fluorescence. Utiliser une lentille de grossissement 40 x avec une ouverture numérique de 1,3.
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Résultats
Dénudation du ballon est un modèle approprié pour étudier le développement du MH chez la souris. Les animaux se remettre bien de la chirurgie et montrent une post-opération excellente condition physique. Nous avons créé ce modèle en 50 souris ayant moins de 3 % la mortalité due à l’intervention chirurgicale. Figures 1 b -C montrent les principales étapes chirurgicales. Après une incision de la peau le long de la linea alba, identifie...
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Discussion
Cet article illustre un modèle murin pour étudier le développement de l’hyperplasie myointimal et permet l’exploration des processus pathologiques sous-jacent et les essais de nouveaux médicaments ou les options thérapeutiques.
L’étape la plus critique dans le présent protocole est la dénudation de l’aorte. Une attention particulière devrait être accordée au cours de cette étape car dénudation excessive conduira à la formation de l’anévrisme et la défaillance de modèle. En revanche, si la dénu...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Christiane Pahrmann pour son aide technique.
D.W. a été soutenu par la Foundation de Kade Max. T.D. a reçu des subventions de la Fondation de Kröner Else (2012_EKES.04) et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. a reçu des subventions de recherche de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10-0 Suture Ethilon | Ethicon | 2814G | |
| 3 mL Seringue | BD Medical | 309658 | |
| 37 % HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Suture prolène 5-0 | Ethicon | EH7229H | |
| Suture prolène 6-0 | Ethicon | 8706H | |
| Fuchsin acide | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Coloration trichrome Solution |
| de récupération d’antigène | Dako | S1699 | |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Coloration trichrome |
| Bepanthen Pommade pour les yeux et le nez | Bayer | 1578675 | Pommade pour les yeux |
| Betadine Solution de bétadine | Betadine Purdue Pharma | NDC :67618-152 | |
| C57BL/6J | Charles River | Numéro de stock 000664 | |
| Pince applicatrice | Fine Science Tools | 18056-14 | MÂCHOIRE DIMS : 4 x 0,75 mm LONGUEUR : 13 mm |
| Collagène 3 | abcam ab7778 | Anticorps | |
| DAPI | Thermo Fischer | D1306 | |
| Âne anti-Chèvre IgG AF555 | Invitrogen | A21432 | Anticorps secondaire |
| Âne anti-Lapin IgG AF488 | Invitrogen | A21206 | Anticorps secondaire |
| Âne anti-Lapin IgG AF488 | Invitrogen | A11055 | Secondaire anticorps |
| Âne anti-Lapin IgG AF555 | Invitrogen | A31572 | Anticorps secondaire |
| Éthanol 70 % | Th. Geyer | 2270 | |
| Éthanol 96 % | Th. Geyer | 2295 | |
| Éthanol absolu | Th. Geyer | 2246 | |
| FAP | abcam | ab28246 | anticorps |
| fine | Outils | scientifiques fins11251-20 | |
| Pince standard | Outils de science fine | 11023-10 | |
| Acide acétique glacial | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Tondeuse à cheveux | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Héparine | Rotexmedica | PZN 3862340 | 25.000 I.E./mL |
| Kit de cautérisation haute température | Bovie | 18010-00 | |
| Image-iT FX Signal Enhancer | Invitrogen | I36933 | Solution de blocage |
| Vert clair SF | Waldeck | 1B-211 | Coloration trichrome |
| Pince microchirurgicale | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4mm |
| MINI TREK Cathéter de dilatation coronaire 1,20 mm x 6 mm / Échange rapide | Abbott | 1012268-06U | |
| Hydrate de molybdatophosphorique | Merck | 1.00532.0100 | Coloration trichrome |
| NaCl 0,9 % | B.Braun | PZN 06063042 N° d’art. : 3570160 | |
| Porte-aiguille | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Coloration trichrome |
| Paraffine | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| PBS pH 7,4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 4 % | Microscopie électronique Sciences | #157135S | |
| Ponceau S solution Serva | Electrophorèse | 33427 | Coloration trichrome |
| Diluant d’anticorps primaire | Dako | S3022 | |
| Prolong Gold Solution de montage | Thermo Fischer | P36930 | Solution de montage pour lames colorées par immunofluorescence |
| Pointe fine remplaçable | Bovie | H101 | |
| Resorcin-Fuchsin Weigert | Waldeck | 2E-30 | Coloration trichrome |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofène |
| Ciseaux | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Ciseaux Vannas-style | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Diluant d’anticorps secondaire | Dako | S0809 | |
| Adhésif à action rapide MINIS 3x1g | UHU | 45370 | Porte-lames en cyanoacrylate |
| Ted Pella | 21057 | ||
| SM22 | abcam | ab10135 | Anticorps |
| SMA | abcam | ab21027 | |
| Boîte de coloration des | Ted Pella | 21075 | |
| Microscope chirurgical | Leica | M651 | |
| Tabotamp fibrillaire | Ethicon | 431962 | Hémostat résorbable |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| U-100 Seringue à insuline | BD Medical | 324825 | |
| Dilatateur de vaisseau | Fine Science Tools | 18603-14 | |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Weigerts fer hématoxyline Kit | Merck | 1.15973.0002 | Coloration trichrome |
| Xylène | Th. Geyer | 3410 |
Références
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Réimpressions et autorisations
