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Article de méthode

Le Madagascar blatte comme Alternative non-mammifère modèle Animal pour étudier la Virulence, pathogenèse et l’efficacité du médicament

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DOI :

10.3791/56491

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24 novembre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Southern Research, 3Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour utiliser la Madagascar blatte comme modèle animal non-mammifère alternatif pour mener la virulence bactérienne, pathogenèse, toxicité des médicaments, l’efficacité du médicament et études de la réponse immunitaire innée.

Résumé

Beaucoup d’aspects de l’immunité innée est conservées entre les mammifères et les insectes. Un insecte, le Madagascar blatte du genre Gromphadorhina, peut être utilisé comme un modèle alternatif d’animaux pour l’étude de la virulence, l’interaction hôte-pathogène, réponse immunitaire innée et l’efficacité du médicament. Détails pour l’élevage, soins et reproduction de la blatte sifflement sont fournis. Nous montrons aussi comment il peut être infecté par des bactéries telles que les pathogènes intracellulaires Burkholderia mallei, b. pseudomallei et b. thailandensis. L’utilisation de la blatte sifflement est peu coûteuse et surmonte les questions de réglementation concernant l’utilisation des mammifères dans la recherche. En outre, trouv & eacutes en utilisant le modèle de cafard sifflant est semblables à ceux obtenus à l’aide de modèles mammifères et reproductible. Ainsi, le cafard sifflant de Madagascar représente un hôte de remplacement attrayante qui devrait être étudié lors des études chez l’animal.

Introduction

L’utilisation d’insectes comme alternatives non-mammifère modèles animaux pour étudier la pathogenèse bactérienne et la défense de l’hôte innée a été gagne du terrain ces dernières années. Sur le plan logistique, c’est en raison de leur coût relativement peu élevé et la facilité à obtenir, manutention et à s’occuper des insectes par rapport aux mammifères. Il n’y a également aucune politique de réglementation régissant l’utilisation des insectes dans la recherche ; Il n’est pas soumis à la compétence ou les limitations imposées par un animal utilisent Comité ou un organisme gouvernemental. Insectes comme des modèles animaux de substitution se prêtent particulièrement à des études complètes pour les facteurs de virulence, interactions hôte-pathogène et les évaluations de l’efficacité des médicaments antimicrobiens. Leur utilisation peut réduire le nombre de mammifères utilisés pour la recherche ainsi surmonter certains des dilemmes éthiques inhérents à la conduite d’expérimentation animale 1,2.

Insectes peuvent servir d’hôtes substitut parce qu’il y a un haut degré de communité entre le système immunitaire inné des insectes et des mammifères 1,3. Les plasmatocytes insectes et mammifères macrophages phagocytent les microorganismes 4. La contrepartie insecte de la neutrophile est les hémocytes 5,6. Les voies de burst oxydatif intracellulaire dans les insectes et les cellules de mammifères sont similaires ; les espèces réactives de l’oxygène dans les deux sont produites par orthologues p47phox et p67phox protéines 5. Les cascades de signalisation en aval des récepteurs Toll dans les insectes et les récepteurs Toll-like et d’interleukine-1 chez les mammifères sont aussi remarquablement similaires ; tous deux entraîner la production de peptides antimicrobiens, tels que les défensines 7. Ainsi, les insectes peuvent être utilisés pour étudier des mécanismes immunitaires innées générales qui sont partagées par des métazoaires.

Un insecte appelé le Madagascar blatte du genre Gromphadorhina, est l’un de la plus grande espèce de cafard qui existe, typiquement atteignant 5 à 8 cm à maturité. Il est seulement originaire de l’île de Madagascar et se caractérise par le sifflement - rend un son qui se produit quand le cafard sifflant expulse l’air à travers les ouvertures respiratoires appelées spiracles 8. Le sifflement caractéristique sert comme une forme de communication sociale parmi les sifflements des cafards pour la parade nuptiale et agression 9 et peut être entendu quand un homme est dérangé dans son habitat. Le Madagascar blatte est un mouvement lent comparé à la blatte américaine et d’autres espèces de ravageurs urbain. Il est facile de prendre soin et de se reproduire ; un cafard sifflant enceinte peut produire des descendants de 20 à 30 à la fois. Un bébé sifflements cafard, appelé une nymphe, atteint sa maturité sexuelle à 5 mois après avoir soumis à 6 mues et peut vivre jusqu'à 5 ans dans la nature et en captivité, 8.

Nous avons utilisé le Madagascar blatte comme un hôte de remplacement pour l’infection par des pathogènes intracellulaires Burkholderia mallei, b. pseudomalleiet thailandensis b. 10,11. La virulence de ces agents pathogènes en sifflant des cafards a été comparée à leur virulence chez le modèle animal de référence pour Burkholderia, le hamster syrien. Nous avons trouvé que la dose létale 50 % (DL50) de b. pseudomallei et b. mallei était similaire dans les deux modèles 11. Fait intéressant, b. thailandensis, bien que non virulente dans le modèle de rongeur, est mortelle dans le sifflement de la blatte 11. Cette différence en ce qui concerne l’infection à b. thailandensis met en évidence l’utilité du modèle cafard sifflant ; B. thailandensis atténuant les mutants peuvent être résolues plus facilement chez la blatte sifflement que dans les modèles de rongeurs. En outre, comme b. thailandensis est souvent utilisé comme l’organisme modèle pour b. pseudomallei et mallei b. 10,12,13, identifier les mutations atténuantes il pourrait conduire à des cibles similaires dans ses cousines plus virulentes.

Malgré la différence dans la virulence de thailandensis b. chez la blatte sifflement versus le hamster syrien, facteurs de virulence critique, comme celles figurant dans le système de sécrétion de type 6-1 (T6SS-1), des mutations qui sont atténuant dans b. mallei et B. pseudomallei, sont de même atténuer pour thailandensis b. 11. Le modèle cafard sifflant est plus validé dans ce T6SS individuels mutants (T6SS-2 T6SS-6) en b. pseudomallei, qui n’ont aucune incidence sur la virulence chez les hamsters syriens, restent virulents dans le sifflement des cafards 11. Ainsi, le cafard sifflant est un modèle animal de substitution viable pour les trois espèces de Burkholderia . Récemment, nous avons utilisé le cafard sifflant comme un modèle animal de substitution pour évaluer l’efficacité de la chloroquine médicament antipaludique (CLQ) contre Burkholderia infection 10 et sa toxicité.

Nous décrivons ici l’élevage et les soins de Madagascar blatte et fournir des détails sur la façon d’infecter cet insecte avec trois espèces de Burkholderia . En outre, nous révèlent que le cafard sifflant est un modèle de substitution viable pour étudier la virulence et l’efficacité du médicament dans les infections de Burkholderia et qu’il probablement peut également servir un hôte de remplacement pour les autres bactéries pathogènes dans des études similaires.

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Protocole

1. les préparations pour le maintien d’une colonie de cafard sifflant

  1. Se préparer pour les cafards sifflement à vivre dans des cages. Appliquer une fine couche de gelée de pétrole, environ 20 à 30 mm de largeur, soit à la circonférence des parois vers le haut de la cage pour éviter les cafards sifflement de l’escalade de la cage et d’échapper.
    NOTE : Sifflements cafards peut être logé dans une variété de conteneurs qui ont une grande surface, sont d’une hauteur suffisante et être munies de couvercles. Utiliser des cages de souris (~ 43 x 23 cm x 20 cm). Pour les cages destinées à 37 ° C, ne s’appliquent pas de gelée de pétrole.
  2. Inclure un carton d’oeufs en carton placé à l’envers à l’intérieur de la cage pour offrir une cachette pour les insectes naturellement timides. Ne pas substituer le carton d’oeufs en carton avec celle faite en mousse de polystyrène afin d’éviter l’ingestion de plastique.
  3. Ne fournissent pas de litière pour le nettoyage plus facile et à accroître la visibilité des nymphes nouvellement écloses.
  4. Procurer de la nourriture sèche pour chiens qui contient une composition de ~ 20 % de protéines brutes. Grossièrement, broyer la nourriture pour chien avec un robot culinaire ou un mélangeur et conserver à 4 ° C.
  5. Obtenir plusieurs plats peu profonds et pierres aquarium ou une éponge pour l’alimentation et l’eau.
    NOTE : boîtes de Pétri sont recommandées.

2. un sifflement cafard soins et reproduction

  1. Obtenir non-consanguines Madagascar sifflements cafards (~ 5 cm) d’un éleveur commercial. Les espèces utilisées dans le présent protocole sont Gromphadorhina laevigata. Déballez la boîte d’expédition contenant les cafards sifflement dès leur réception.
  2. Suivez les directives institutionnelles appropriées pour l’utilisation des équipements de protection individuelle dans le traitement des animaux.
    Remarque : Utilisez des gants jetables épais pour le traitement des cafards car les griffes tarsiennes d’un cafard sifflant sont coupantes.
  3. Transfert jusqu'à 75 grands cafards sifflement (> 3 cm) par grande cage. Transférer les larves nouvellement écloses et plus petites (< 3 cm) pour une cage séparée.
    Remarque : Maintenir significativement plus de 75 grands sifflements cafards par cage souris pourraient conduire à la détérioration de la santé de la colonie et peuvent également entraîner de décès.
  4. Gérer un cafard fraîchement muée, qui est blanc cassé en couleur, doucement et évitez les pressant. Vous pouvez également permettre l’exosquelette à assombrir et durcir avant du manipuler.
    Remarque : Il n’est pas nécessaire d’enlever les acariens, Gromphadorholaelaps schaeferi, qui accompagnent souvent les cafards sifflement dès réception des éleveurs. Les acariens bénéfiques nettoyer les cafards sifflement et sont inoffensifs pour les humains.
  5. Nourrir un sifflement cafards avec de la nourriture sèche pour chiens au sol dans un plat peu profond une ou deux fois par semaine. Fournir suffisamment de nourriture chien afin que les cafards sifflement aient suffisamment de nourriture jusqu'à la prochaine tétée. Jetez tout aliment qui est devenue humide et moisie.
  6. En plus de nourriture pour chiens, fournir découpé fruits et légumes, comme les pommes, pommes de terre ou laitue, dans un plat peu profond. Jetez les aliments moisi ou pourri.
  7. Fournir de l’eau potable une ou deux fois par semaine dans un plat peu profond, mais ne pas trop remplir le plat pour éviter toute fuite dans la cage. Placer les pierres de petit aquarium ou une éponge dans le plat de prévoir une aire d’atterrissage de petites nymphes. Utiliser de l’eau osmosée, si disponible.
  8. Garder un sifflement de cafards dans l’obscurité à une température variant de 21 ° C à 30 ° C. Garder les gros cafards sifflement destinés à l’expérimentation à une température plus basse (~ 21 ° C) pour environ 2 mois diminuer la reproduction et la grossesse. En revanche, garder des nymphes aux températures plus élevées (28 ° C à 30 ° C) pour accélérer la croissance.
    NOTE : Gardez les cages à température ambiante (21 ° C) dans un endroit sombre du cabinet.
  9. Obtenir l’humidité en incluant une casserole d’eau si le sifflement des cafards sont conservés dans un incubateur.
  10. Nettoyer la cage en écopant des excréments secs régulièrement ou en transférant un sifflement cafards à une cage propre par 2 ou 3 semaines. Garder le fond de la cage au sec. Nettoyer la cage immédiatement si l’excès d’eau est autorisé à s’accumuler et mélanger avec les excréments au fond de la cage.

3. cafard préparation d’expérimentation

  1. Transférer le nombre approprié de sifflement cafards dans une cage à un incubateur à 37 ° C humidifié avant une expérience de 1 à 3 semaines d’acclimatation. Inclure un groupe de contrôle pour l’injection. Cette période d’acclimatation est essentielle pour éviter les chocs de température au cours de l’expérimentation.
  2. Ne pas appliquer la vaseline aux cages destinées à 37 ° C car la température élevée fait fondre la gelée.
  3. Vérifier les cafards sifflement tous les 1 à 2 jours pour remplacer les aliments et l’eau et nettoyer la cage.
  4. Obtenir des contenants clairement jetables en plastique alimentaire avec couvercles pour regrouper les cafards sifflement pendant l’expérimentation. Pour la ventilation, percer des trous dans le couvercle ou le côté du récipient avec un clou et le marteau.
    NOTE : Utiliser de récipients capuchon vissé sur snap cap conteneurs dans le cadre de niveau 3 de biosécurité. Conteneurs de Snap cap peuvent être renforcés avec du ruban adhésif, si nécessaire.
  5. Le jour de l’injection, distribuer des cafards sifflement acclimatés de 6 à 12 en groupes par conteneur, assurer une répartition égale selon le sexe et la masse corporelle.
  6. Déterminer le sexe des cafards sifflement individuels. Déterminer le sexe de la proéminence de cornes sur les hommes et l’absence de celui-ci, sur les femmes.
  7. Peser les cafards sifflement individuels. Pour faciliter le pesage d’un cafard sifflant sur la balance, incluez-la dans deux bateaux de pesée qui ont été tarés.
    Remarque : Par souci de cohérence entre les expériences, utilisez un sifflement cafards avec un poids de 4 à 8 g. Cependant, aucune différence de survie après l’infection n’ont été trouvés entre petit (1,5 à 2 g) et les grands (6 à 8 g) sifflement cafards. Pour études de médicaments, utiliser un sifflement cafards avec un poids d’environ 5 g pour obtenir une concentration de drogue plus cohérente par corps massive.
  8. Au lieu d’un plat d’eau, incluent l’eau contenu fruits ou légumes, comme une tranche de pomme ou de pommes de terre. Jeter de la nourriture avariée. Ne fournissent pas d’eau pour garder le conteneur sec.
  9. Retourner un sifflement cafards à 37 ° C jusqu'à ce que les injections.

4. préparations et Culture bactérienne

NOTE : Les espèces bactériennes utilisées dans le présent protocole sont mallei b. pseudomallei b. et b. thailandensis. Toutes les manipulations avec mallei b. et b. pseudomallei doivent être effectuées dans la catégorie II ou enceintes de sécurité biologique de classe III situé à un niveau biosafety (BSL) laboratoire 3. Effectuer des manipulations avec b. thailandensis dans l’enceinte de sécurité biologique similaire armoires situées soit dans un laboratoire BSL2 ou BSL3. Suivez institutionnel mode opératoire normalisé pour travail BSL3. Suivez les lignes directrices pour l’utilisation des équipements de protection individuelle lors de la manipulation des bactéries.

  1. Préparer un plat principal de Burkholderia au moins 3 jours avant l’infection. Utilisez Luria-Bertani (Lennox) (LB) agar pour b. pseudomallei ou thailandensis b. et utilisation LB agar additionné de 4 % de glycérol pour b. mallei. Bactéries de strie d’un stock de glycérol de 25 % à-80 ° C.
    NOTE : Toujours ensemencer le maître directement depuis le stock de glycérol congelés ; éviter la série passage des bactéries de plaque à plaque car cela pourrait causer la virulence réduite.
  2. Inoculer le bouillon de 10 à 20 mL LB avec plusieurs colonies de b. pseudomallei ou thailandensis b. de la plaque de maître. De même, inoculer LB bouillon additionné de 4 % de glycérol pour b. mallei.
  3. Agiter le bouillon de culture à 175 à 250 tr/min à 37 ° C pendant environ 18 h.
  4. Centrifuger à 2 à 3 mL de culture à 5 000 x g pendant 10 min.
  5. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot bactérien dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS, 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4).
  6. Diluer la bactérie avec du PBS pour atteindre une densité optique (do) de 0,5, mesuré à une absorbance à 600 nm dans un spectrophotomètre.
  7. En série de diluer les bactéries dix fois en PBS de la do départ de 0,5. Utilisez ces suspensions pour l’infection.
  8. Déterminer la colonie formant des unités (UFC) de l’inoculum par dilution en série et de placage de 100 µL d’extraits sur milieu gélosé. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 à 48 h.

5. préparations médicamenteuses

  1. Déterminer la quantité appropriée de médicaments à donner par corps massive. Le dosage CLQ donné à la blatte sifflement était fondé sur la dose normale pour les mammifères, qui est de 50 mg/kg/jour.
  2. Remettre en suspension ou diluer le médicament d’intérêt dans le véhicule. Par exemple, diluer CLQ dans du PBS à une concentration de 12 mg/mL. Cette concentration offre 300 µg de drogue à un ~ 6 g sifflements injecté de cafard dans un 25 µL volume.
  3. Si nécessaire, stériliser la solution médicamenteuse en le faisant passer à travers un filtre de seringue 0,22 µm.
  4. Conserver la solution médicamenteuse à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Chauffer la solution médicamenteuse au moins 21 ° C (température ambiante) avant les injections.

6. montage de l’injecteur

  1. Définir le pointeur jusqu’au volume souhaité (25 µL) en tournant la vis de réglage sur une pipette à répétition.
  2. Poussez le levier de déclenchement de la pipette répétitive et tirez le poussoir. La pipette à répétition est maintenant prête à accueillir une seringue chargée.
    NOTE : Calibrer le volume éjecté par la pipette à répétition en mesurant la quantité d’eau éjectée sur une balance.
  3. Remplissez une seringue de 1 mL avec suspension contenant une bactérie ou les drogues.
  4. Fixer la seringue à une stérile 26 ou 27 G x ½ pouce (ou plus courte) aiguille.
  5. Tapez sur la seringue pour flotter les bulles d’air vers le haut et expulser les bulles et une suspension dans un récipient rempli d’eau de Javel de 10 %.
  6. Prenez la seringue sur le clip de la seringue de la pipette à répétition avec le biseau de l’aiguille vers le haut.
  7. Tirez le levier de déclenchement, puis appuyez sur le bouton du distributeur fermement pour effectuer des injections vides dans un récipient rempli d’eau de Javel 10 % jusqu'à ce que le piston de la seringue est contre le pousseur.
  8. Effectuer 1 ou 2 injections de vides supplémentaires pour s’assurer que le liquide est éjecté hors de la seringue. La pipette à répétition est prête pour les injections.

7. cafard Injections

  1. Effectuer toutes les injections de cafard dans une armoire dans un BSL2 de sécurité biologique de classe II ou classe III ou BSL3 réglage à l’aide institutionnelle recommandé des équipements de protection individuelle.
  2. Nettoyer les surfaces de travail dans l’armoire de sécurité qui peuvent entrer en contact avec les cafards de sifflement. Utiliser 10 % eau de Javel suivie d’éthanol à 70 % pour enlever résidu de javellisant. Laisser la surface à l’air sec.
  3. D’une main, tenez le cafard sifflant à ses côtés. Immobiliser un cafard sifflant tel qu’il est incapable de recul pendant l’injection. Pliez légèrement le cafard sifflant afin que les membranes cutanées entre les tergites abdominaux sont exposés.
  4. Avec l’autre main, tenir la pipette répétitive telles que l’aiguille arrive à un 0° d’angle de 30° de la ligne médiane de dorso-ventral de la blatte un sifflement. Perforer la membrane cutanée adjacente à la 3rd, 4èmeou 5ème tergum de l’extrémité postérieure.
    NOTE : L’entrée de l’aiguille dans le cafard sifflant à l’angle indiqué veille à ce que l’aiguille ne pas traverser et quitter le cafard sifflant. Le site d’injection garantit que la matière éjectée est contenue dans la cavité abdominale, remplie de l’hémolymphe. Pratique tenant les cafards sifflement et injection d’eau avant les injections de l’entreprise avec des bactéries vivantes ou de la drogue.
  5. Pousser le bouton dispense fermement pour injecter le volume. Retirez doucement l’aiguille sous le même angle que celui utilisé pour l’entrée.
  6. Placez le cafard sifflant injecté dans un récipient séparé pour distinguer les cafards un sifflement qui n’ont pas encore été injectés. Essuyez toute l’hémolymphe qui peut ont suintait sur le site d’injection.
  7. Continuer à injecter les autres cafards sifflement au sein d’un groupe à l’aide de la seringue et l’aiguille même. Arrêter l’injection avant que le piston de la seringue n’atteigne le fond du baril afin d’éviter un dosage incomplètes dans la dernière injection.
  8. Pour les injections multiples dans un seul cafard sifflement, tels que ceux avec des bactéries et des drogues, injecter sur différentes côtés d’un tergum sur la face dorsale des cafards sifflement. Sinon, effectuer des injections multiples en injectant à terga différentes (3rd à 5ème).
  9. Veiller à ce que les couvercles des conteneurs sont fixées solidement. Renforcer les couvercles avec du ruban adhésif, si nécessaire.
  10. Incuber les sifflements des cafards dans un incubateur humidifié 37 ° C.

8. enregistrement sifflements cafard morbidité et mortalité

  1. Effectuer tous les examens de cafard sifflant sous une hotte avec institutionnelle de sécurité biologique de classe II ou classe III recommandé des équipements de protection individuelle. Nettoyer les surfaces dans l’armoire de sécurité avec 10 % de Javel suivie d’éthanol à 70 %. Laissez la zone de travail à l’air sec.
  2. Marquer un sifflement cafards une ou deux fois par jour sur une période de 1 à 2 semaines à l’aide de la morbidité marquant le tableau (tableau 1).
  3. Retirez les cafards morts un sifflement et noter le nombre de survivants.
  4. Transfert en restant vivants sifflements cafards à un récipient propre si l’excès d’humidité s’est accumulée au fond du récipient. Sinon, utiliser un essuie-tout jetable pour essuyer l’excès d’humidité.
  5. Remplacer la nourriture avariée quotidienne et retour sifflements cafards dans l’incubateur humidifié 37 ° C.
  6. À la fin de l’étude, placez les survivants restants dans un sac de biohazard et congeler à-80 ° C à euthanasier.
  7. Analyser statistiquement les données14 pour déterminer la DL50 et par analyse de Kaplan-Meier et Log-Rank pour sa survie. Comme avec tous les insectes expérimentation, certains décès peuvent survenir chez le groupe témoin. Ces décès sont attribués à la mortalité naturelle des insectes 15. Pour une discussion plus détaillée sur la façon de compte pour les décès dans le groupe témoin, consultez référence15.

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Résultats

Cette section illustre les résultats obtenus lors de cafards sifflant de Madagascar ont été infectées par b. mallei, b. pseudomallei, ou thailandensis b.; les résultats montrent que cet insecte est un modèle animal docile pour différentes espèces de Burkholderia dans l’étude de virulence, la toxicité et l’efficacité du médicament contre les infections bactériennes. Plus de cafards sifflement a survécu dans les groupes qui ont été infectées par les mutants atténu...

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Discussion

Les conditions expérimentales optimales commencent par une colonie de cafard sifflant sain, qui exige un minimum mais engagement chronologique cohérente. Bien que les sifflements de cafards peut aller pour une période relativement longue (~ semaines) sans nourriture ni eau, entretien hebdomadaire ou bi-hebdomadaire cage doit être fournie. Cela inclut vérifier la nourriture et l’approvisionnement en eau et d’assurer que la cage soit sèche. Maintien des conditions de vie sec est particulièrement important pendant l’acclima...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer et a.m. Friedlander conçu les procédures décrites dans le manuscrit. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli et D. DeShazer effectué les expériences. J. Chua a écrit le manuscrit.

Les auteurs remercient Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter et Steven A. Tobery pour l’assistance technique excellente et David P. Fetterer et Steven J. Kern pour l’analyse statistique.

Le travaux ont été subventionnés par l’Agence de réduction proposition de défense menace #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F et #CBS. MEDBIO.02.10.rd.034 à D.D.

Opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement endossées par l’armée américaine.

Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les vues ou les politiques du ministère de la défense, ni mentionne des noms commerciaux, des produits commerciaux, ou organisations impliquent l’approbation par le gouvernement américain.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
cafard siffleur de Madagascar
  ;   ;
  ;
  ;
  ;		Carolina Biological Supply Co, Burlington, Caroline du Nord  ;
143668 Croquettes n Bits, n’importe quelle saveurBig Heart Pet Brands, San Francisco, CAUPC #079100519378
Enclenchement des contenants en plastique jetables ou équivalentRubbermaid, Huntersville, NCUPC #FG7F71RETCHIL
À visser sur des contenants en plastique jetables ou équivalentRubbermaid, Huntersville, NCUPC #FG7J0000TCHIL
Tridak STEPPER série répétitive pipetteDymax Corporation
www.dymax.com		T15469
Seringue (1 mL)  ;Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ309659
Aiguille (26 ou 27G x 1/2)Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ305109, 305111
Diphosphate de chloroquineSigma-Aldrich, St. Louis, MOC6628
Saline tamponnée au phosphateGibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD10010023
Difco Luria- Bertani (Lennox)Becton Dickinson, Sparks, MD240230
Agar  ;Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA1296
GlycérolSigma-Aldrich, St. Louis, MOG6279

Références

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