Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale

Résumé

Ce protocole décrit comment stimuler les cellules avec des peptides dérivés mitochondriale et évaluer la signalisation cascade et la localisation des phospho-protéines.

Résumé

Peptides dérivés mitochondrial (AMD) sont une nouvelle classe de peptides qui sont codées par des cadres de lecture ouvert petit au sein d’autres gènes connus du génome mitochondrial. Les AMD ont une grande variété d’effets biologiques tels que la protection des neurones contre l’apoptose, l’amélioration des marqueurs métaboliques et protégeant les cellules de la chimiothérapie. Humanin a été le premier MDP à découvrir et est la plus étudiée peptide parmi la famille des MDP. Les récepteurs membranaires et les voies de signalisation en aval de humanin ont été soigneusement caractérisés. Les AMD supplémentaires telles que des MOTS-c et SHLP1-6 ont été découvertes plus récemment et les mécanismes de signalisation n’ont pas encore à élucider. Nous décrivons ici une méthode fondés sur la culture de cellules pour déterminer la fonction de ces peptides. En particulier, les techniques de fractionnement cellulaire en combinaison avec western blot permettent la détermination quantitative de l’activation et la translocation de la molécule de signalisation importante. Bien qu’il existe d’autres méthodes de fractionnement cellulaire, celle décrite ici est une méthode simple et directe. Ces méthodes peuvent être utilisées pour élucider plus loin le mécanisme d’action de ces peptides et d’autres agents thérapeutiques.

Introduction

Nouvelles études montrent que les peptides dérivés mitochondriale (AMD) jouent des rôles importants de cytoprotection et métabolisme^1,2,3. Comprendre la voie de transduction de signal en présence d’AMD nous donne un aperçu du mécanisme par lequel les AMD modulent diverses fonctions. Le premier MDP identifié, humanin, a été montré pour augmenter la kinase de signal-réglée extracellulaire 1/2 (ERK1/2) phosphorylation par l’intermédiaire de son récepteur liaison^4,5. Cependant, l’effet en aval de l’activation de ERK1/2 es....

Protocole

1. traitement de peptide aux cellules

1. plaque 2 millions SH-SY5Y ou cellules HEK293 (2 x 10 ⁶) dans un 10 cm plat et cultivent pour 2 jours
2. (facultatif) l’autre jour, laver les cellules avec sans sérum Dulbecco ' s mise à jour le Eagle media moyen (DMEM) une fois et incuber avec sérum DMEM gratuit du jour au lendemain si le traitement doit être fait dans les médias libres sériques.
3. Le jour 3, dissoudre les peptides S14G-humanin à 0,2 µm filtrée, l’eau distillée et reconstituer leur solution stock de 1mM.
   Remarque : Les peptides doivent être dissous dans le solvant approprié, qui peut être déterminé par les caractérist....

Résultats

À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons traité des cellules HEK293 et SH-SY5Y avec 1 μM et 100 μM S14G-humanin, un humanin puissant analogiques²¹, respectivement, dans toutes les médias pour les périodes indiquées (Figure 1A et Figure 1 B). nous avons ensuite examiné la forme totale et phosphorylée de ERK1/2 au Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴ , extraits de .......

Discussion

Ici, nous avons démontré que humanin induite par le peptide ERK1/2 activation se produit dans deux types de cellules différentes, et la localisation subcellulaire d’activées ERK1/2 peut être différente selon les conditions (p. ex., dose de peptide, point dans le temps et cellule type). Il a été démontré que humanin signaux par l’intermédiaire de deux récepteurs différents^22,23, qui peut expliquer les différences de signalisation entre les deux lignées ce.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
p44/42 MAPK (ERK1/2)	Signalisation cellulaire	9102	Dilution 1:1 000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)	Signalisation cellulaire	4370	Dilution 1:1 000
Lamine B1	Signalisation cellulaire	12586	Marqueur nucléaire, dilution 1:1 000
GAPDH	Signalisation cellulaire	5174	Marqueur cytoplasmique, dilution 1:2 000
Tom20	Santa cruz	SC-17764	Marqueur mitochondrial, dilution 1:2 000
anti-Rabbit-HRP conjuguée	Signalisation cellulaire	7074	Dilution 1:30 000
RIPA Tampon de lyse et d’extraction	ThermoFisher SCIENTIFIC	89900
100 mm Boîte de culture	ThermoFisher SCIENTIFIC	12556002
HNG peptide	Genescript
25mm Filtre Sylinge	ThermoFisher SCIENTIFIC	09-719A
HEPES	Sigma	H3375
MgCl2	Sigma	M8266
KCl	Sigma	P9333
Glycérol	Sigma	G9012
Triton X-100	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP151-100
EDTA	Sigma	3609
MOPS	Sigma	M1254
EGTA	Sigma	E3889
Saccharose	Sigma	S7903
Tris-base	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP152-1
HCL	Sigma	H1758
PBS	Lonza	17-512F
Racleur cellulaire	FALCON	353085
Halte et commerce ; Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase (100X)	ThermoFisher SCIENTIFIC	78440
Thomas Pestle Assemblages de broyeurs de tissus avec pilons lisses	Thomas Scientific	3432S90
Tween-20	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP337-500
BSA	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP1600-100
8-16 % Mini-PROTEAN TGX Gels de	protéines préfabriquéesBIO RAD	4561104
Mini Trans-Blot	BIO RAD	1658030
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF KIT DE TRANSFERT	BIO RAD	1704272
Clarity Western ECL Substrats	BIO RAD	1705060
Restore	Western blotThermoFisher SCIENTIFIC	21059
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC	11965-092
Sonicateur, Medel : FB120	ThermoFisher SCIENTIFIC	695320-07-12

Module Trans-Blot Turbo Système de transfert BIO RAD 1704150 de transfert