Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Résumé

Comprendre la fonction des processus essentiels chez les bactéries est difficile. Microscopie à fluorescence avec des colorants spécifiques à la cible peut éclairer clé dans la progression de la croissance et cycle cellulaire des cellules microbiennes. Ici, Agrobacterium tumefaciens est utilisé comme une bactérie modèle pour mettre en évidence les méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour la caractérisation des processus essentiels.

Résumé

Le processus cellulaire de base telles que la réplication de l’ADN et la ségrégation, la synthèse des protéines, la biosynthèse de la paroi cellulaire et la division cellulaire s’appuient sur la fonction des protéines qui sont essentielles pour la survie de bactéries. Une série de colorants spécifiques à la cible peut être utilisée comme sondes afin de mieux comprennent ces processus. Coloration avec colorants lipophiles permet l’observation de la structure de la membrane, la visualisation des microdomaines lipidiques et détection des bulles de la membrane. Utilisation des acides aminés fluorescentes-d (FDAAs) pour sonder les sites de la biosynthèse du peptidoglycane peut indiquer des défauts potentiels dans la biogenèse pariétale ou patrons de croissance cellulaire. Enfin, taches d’acide nucléique peuvent indiquer des défauts possibles en ségrégation réplication ou chromosomique d’ADN. Cyanine ADN taches étiquette vivant des cellules et sont adapté pour la microscopie Time-lapse permettant des observations en temps réel de nucléoïde morphologie au cours de la croissance cellulaire. Protocoles pour l’étiquetage de la cellule peuvent être appliqués à des mutants déplétion protéique à repérer les défauts dans la structure de la membrane, biogenèse pariétale ou ségrégation des chromosomes. Par ailleurs, Time-lapse microscopie peut être utilisée pour surveiller les changements morphologiques comme une protéine essentielle est supprimée et peut fournir des indications supplémentaires en fonction de la protéine. Par exemple, l’appauvrissement de la couche de protéines essentielles division cellulaire entraînant filamentation ou ramification, considérant que la déplétion des protéines de croissance cellulaire peut-être causer des cellules à devenir plus courts ou plus rond. Ici, les protocoles pour la croissance cellulaire, l’étiquetage spécifique à la cible et la microscopie Time-lapse sont fournis pour le phytopathogène bactéries Agrobacterium tumefaciens. Ensemble, colorants spécifiques à la cible et le Time-lapse microscopie permettent la caractérisation des processus essentiels dans a. tumefaciens. Enfin, les protocoles fournis peuvent être facilement modifiés pour sonder les processus essentiels chez d’autres bactéries.

Introduction

Progression dans le cycle cellulaire bactérienne nécessite la coordination de nombreux processus, y compris la biosynthèse de la membrane et la paroi cellulaire, réplication de l’ADN et la ségrégation et la division cellulaire. Pour bien comprendre la complexité de la biologie de la cellule bactérienne, il est nécessaire d’étudier ces phénomènes essentiels ; Cependant, c’est une tâche non triviale puisque la viabilité cellulaire est compromise lorsque les éléments clés de ces voies sont mutagénisées tant. Microscopie à épifluorescence couplée avec des colorants spécifiques à la cible est une approche puissante pour sonder ces processus essentiels dans le type sauvage ....

Protocole

1. croissance des souches d’a. tumefaciens

1. Mise en culture des souches d’a. tumefaciens
   1. Utiliser une pointe en bois de bâton ou pipette stérile pour ensemencer 1 mL de milieu de culture ATGN (voir la liste des matériaux pour la recette) avec une seule colonie de la souche désirée.
      NOTE : Pour les souches d’a. tumefaciens de l’appauvrissement, l’ATGN doit contenir 1 mM IPTG comme inducteur de maintenir la biosynthèse des protéines essentielles.
   2. Cultiver les souches d’a. tumefaciens nuit à ATGN à 28 ° C sous agitation à 225 t/mn.
   3. Mesurer la densité optique des cellules à 6....

Résultats

Étiquetage du type sauvage spécifique à la cible A. tumefaciens cellules
Afin d’illustrer que la morphologie cellulaire n’est pas affecté par les étapes de lavage ou un traitement avec 1 % DMSO (qui sert à diluer les colorants fluorescents), les cellules ont été imagées directement à partir de culture (Figure 2 a, panneau de l’extrême gauche), après avoir lavé les cellules par centrifugation tell.......

Discussion

Ce protocole contient une série de procédures d’enquête sur les souches de type sauvage, mutant et appauvrissement de la couche a. tumefaciens . Il est à noter que toutes les procédures répertoriées dans la section protocole peuvent être facilement adapté pour d’autres souches bactériennes avec modifications pour tenir compte des milieux de croissance, des températures et des taux de croissance.

L’utilisation des colorants spécifiques à la cible est un outil précieux pour fournir une .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souches bactériennes
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmide requis pour la virulence de Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58&Delta ; tetRA ::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA &Delta ; ctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. L’insertion de Mini-Tn7 dans un site artificiel attTn7 permet la dépeltion du régulateur maître de l’essentail CtrA dans le phytopathogène Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
fort	>>	Numéro de catalogue	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			À 1 L d’eau stérilisée, ajoutez 50 ml de tampon 20X, 50 ml de sels 20X, 12,5 ml de glucose à 40 %. Pour les assiettes, ajoutez 15 g de Bacto Agar à 1 L d’eau et d’autoclave. Refroidir à 55 ° ; C et ajoutez 50 ml de tampon 20X, 50 ml de sels 20X, 12,5 ml de glucose à 40 %.
		AT 20X	Ajoutez 214 g/L de KH2PO4 à l’eau et ajustez le pH à 7,0 avec de l’hydroxyde de sodium. Autoclave.
	NaOH Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Sels Ajouter			40 g/L (NH4)2SO4, 3,2 g/L MgSO4&bull ; 7H2O, 0,2 g/L CaCl2&bull ; 2H2O, et 0,024 g/L MnSO4&bull ; H2O à l’eau. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4&bull ; 7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2&bull ; 2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4&bull ; H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Préparez 40 % du stock dans de l’eau. Filtrer la stérilisation.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Ajouter 15 g à 1 L d’eau lors de la préparation des plaques.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Optional Media Addits
Kanamycin	GoldBio	K-120	Préparer sous forme de solution mère de 100 mg/ml dans l’eau et filtrer la stérilisation. Utilisation à une concentration finale de 200 & micro ; g/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Préparer sous forme de solution mère de 1 M dans l’eau et filtrer la stérilisation. Utiliser à une concentration finale de 1 mM au besoin pour l’induction.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Microscopy Materials
Lames de microscope	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Nettoyer avec un nettoyant pour vitres Sparkle.
Couvercle de microscope en verre	Fisherbrand	12-541-B	22 x 22 mm. N° 1.5. Nettoyez avec le nettoyant pour vitres Sparkle.
Nettoyant pour vitres Sparkle	Home Depot	203261385	sans ammoniaque ni alcool.
Agarose Ultra Pure	Invitrogen	16500-100	Ajouter à l’eau, au PBS ou au milieu jusqu’à une concentration finale de 1 à 1,5 %. Faire fondre au micro-ondes et placer sur 70 C
de PBS	Fisher BioReagents	BP399500	solution 10X à diluer à 1X avec de l’eau stérile.
Parafilm	Bemis	PM-999	Film de laboratoire utilisé comme joint d’étanchéité dans la préparation des tampons d’agarose.
VALAP			Ajoutez des poids égaux de lanoline, de cire de paraffine et de vaseline dans un tube conique. Tube chauffant en 70 ° ; C sec, perle ou bain-marie pour fondre et mélanger. Appliquez VALAP encore fondu.
Beurre de lanoline	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Vaseline Target	Corp.	06-17644
Cire de paraffine	Bougies Crafty	263012
Nom	Company	Numéro de catalogue	Comments
Colorants spécifiques à la cible
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Utiliser pour diluer les solutions mères de colorants au besoin.
Les FDAA (NADA, HADA, TADA)Les			FDAA peuvent être synthétisés ou acquis grâce à un accord avec Mike VanNieuwenhze (Université de l’Indiana). Préparez une solution mère de 100 mM dans du DMSO. Utiliser à une concentration finale de 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Préparer une solution mère de 1 mg/ml dans du DMSO. Utilisation à concentration finale de 1 & micro ; g/ml.
La			concentration de la pâte est de 5 mM dans le DMSO. Utiliser à la concentration finale de 5 µ ;M.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Préparer une solution mère de 8 mg/ml dans du DMSO. Utilisation à une concentration finale de 8 & micro ; g/ml.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Equipment
Bain sec	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Perles thermiques métalliques	Lab Armor	42370-002
Microscope à épifluorescence équipé d’une caméra			Nikon Eclipse TiE équipé d’une caméra QImaging Rolera em-c2 1K electron-multipliction de charge (EMCCD) est utilisé dans ce travail.

Tampon EMCDD